引用本文： 王濤, 徐睿, 鞠玲燕, 王美紅, 徐永波, 祝筱姬, 李坤, 褚海波. 高流體靜力壓和缺氧對大隱靜脈和脾靜脈滋養血管超微結構的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(10): 1241-1244. doi: 10.7507/1007-9424.20140297 復制
研究表明，靜脈管壁的滋養血管主要分布在外膜和中膜的外層，以縱向排列的滋養血管占居優勢[1-2]。靜脈高壓時，血管壁的滋養血管增多，且扭曲和呈不規則膨脹[3-4]。通過血管鑄型技術和精確解剖技術評價大隱靜脈滋養血管結構，國外已有報道[3, 5]。前期，我們對高流體靜力壓下大隱靜脈和脾靜脈滋養血管的組織形態學進行了對比研究[6]。本研究采用半薄切片定位，通過電鏡觀察大隱靜脈和脾靜脈滋養血管內皮細胞的超微結構變化，探討高流體靜力壓和缺氧對滋養血管內皮細胞的影響。
1 資料與方法
1.1 標本來源
所有病例均經濰坊醫學院人類研究倫理委員會批準。所有選取標本均來自解放軍第89醫院普通外科2009年6月至2012年6月期間的住院的患者。其中行高位結扎剝脫加旋切治療的大隱靜脈曲張患者20例作為大隱靜脈曲張組，男12例，女8例，年齡23～46歲，平均43歲，術前均經彩色多普勒超聲檢查確診為原發性大隱靜脈曲張，按臨床、病因、解剖及病理生理（CEAP）分類選取C2～C3、病程5～8年者。行脾大部切除大網膜胸骨后固定術治療的門靜脈高壓癥患者14例作為病脾靜脈組，男8例，女6例，年齡21～44歲，平均42歲，確診為乙型肝炎后肝硬變，肝功能Child分級為A、B級，伴有脾功能亢進，病程為5～8年。創傷后下肢行截肢術而大隱靜脈無損傷者20例，男14例，女6例，年齡22～45歲，平均40歲；外傷性脾破裂脾靜脈無損傷者14例，男9例，女5例，年齡20～43歲，平均39歲，共34例作為對照組。
1.2 主要試劑與儀器
試劑：25%戊二醛溶液水溶液購自上海安譜科學儀器有限公司；環氧丙烷液購自上海歐復實業有限公司；環氧樹脂購自南京藍柯高分子材料有限公司；醋酸鈾飽和水溶液購自西安鼎天化工有限公司；枸櫞酸鉛溶液購自南京森貝伽生物科技有限公司。儀器：超薄切片機（德國徠卡，RM2235型），光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51型），透視電子顯微鏡（日本日立，H-7500型）。
1.3 方法
將獲取的大隱靜脈和脾靜脈標本切取1 mm見方的組織塊，1 min內置入戊二醛溶液固定；經1%鋨酸后固定，用磷酸鹽（PBS）緩沖溶液將多余的鋨酸洗凈后，梯度乙醇脫水；分別浸入環氧丙烷液30 min、環氧丙烷:環氧樹脂（1:1）液2 h、環氧丙烷:環氧樹脂（1:2）液1 h和環氧樹脂（Epon 812）液2 h，最后用環氧樹脂包埋后入45℃烤箱12 h、65℃烤箱48 h。包埋塊修整，超薄切片機切片，將0.8μm厚切片轉移到載玻片上、烘干。脫環氧樹脂、脫堿，HE染色，光鏡下觀察大隱靜脈和脾靜脈外膜層滋養血管，半薄切片定位。采用超薄切片，片厚70 nm，切片水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液浸30 min，雙蒸水洗3次各15 min；然后再用枸櫞酸鉛溶液浸15 min，雙蒸水洗3次各15 min。應用日立H-7500型透射電鏡觀察大隱靜脈和脾靜脈外膜層滋養血管內皮細胞的超微結構變化并攝片。
2 結果
病脾靜脈組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常（圖 1A）；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂（圖 1B）。脾靜脈對照組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布和細胞器形態正常（圖 2A、2B）。大隱靜脈曲張組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常（圖 3A）；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂及髓樣變（圖 3B）。大隱靜脈對照組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布和細胞器形態正常（圖 4A、4B）。
圖1
示病脾靜脈組滋養血管內皮細胞的改變。1A：細胞核（TEM×10 000）；1B：黑箭所示線粒體（TEM×20 000）??圖 2?示脾靜脈對照組滋養血管內皮細胞的改變。2A：細胞核（TEM×10 000）；2B：黑箭所示線粒體（TEM×30 000）??圖 3?示大隱靜脈曲張組滋養血管內皮細胞的改變。3A：細胞核（TEM×10 000）；3B：黑箭所示線粒體（TEM×20 000）??圖 4?示大隱靜脈對照組滋養血管內皮細胞的改變。4A：細胞核（TEM×10 000）；4B：黑箭所示線粒體（TEM×30 000）。EC：內皮細胞；N：細胞核；Ery：紅細胞
Figure1.
The changes of endothelial cell in vasa vasorum of diseased splenic veins group. 1A:Nucleus (TEM×10 000);1B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000)??Figuer 2??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of splenic vein group. 2A:Nucleus (TEM×10 000);2B:Black arrow mean mitochondria (TEM×30 000)??Figuer 3??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of varicose greater saphenous veins group. 3A:Nucleus (TEM×10 000);3B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000)??Figuer 4??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of greater saphenous veins group. 4A:Nucleus (TEM×10 000); 4 B:Black arrow mean mitochondria (TEM×10 000). EC:Endothelial cell; N:Nucleus; Ery:Erythrocyte
3 討論
關于大隱靜脈滋養血管的研究目前主要聚焦在兩方面：一是慢性功能不全靜脈滋養血管，二是移植大隱靜脈滋養血管[7]。研究發現，一方面，組織缺氧可誘發血管壁滋養血管增多，血管增生是一種退化和功能不全血管壁的營養與保護性反應[8-9]；另一方面，新生血管形成與白細胞募集、局部炎性因子產生及血管壁易變性增加有關[10]。滋養血管的變化還與交感神經調節、平滑肌增生及局部凝血平衡相關[11]。保護好外膜完整的滋養血管，可增加靜脈內皮的完整性，維持內皮一氧化氮合酶活性和血管舒縮性及抗凝血活性[12-14]。一般而言，通常采用血管鑄型微CT或掃描電鏡觀察血管壁滋養血管的立體分布。電鏡下發現大隱靜脈滋養血管沿主干管壁平行縱軸分布，靜脈數量常多于動脈[15-16]。Lametschwandtner等[2]掃描電鏡觀察，滋養血管呈圓形收縮狀或結狀、外翻。當血流壓力升高時，滋養血管會產生膨脹與伸展，但不會影響滋養血管功能。Kachlik等[1]通過血管鑄型電鏡測量滋養血管直徑，發現動脈滋養血管直徑為11.6～36.6μm，毛細血管直徑為4.7～11.6μm，靜脈滋養血管直徑為36.6～200.3μm。一組大隱靜脈滋養血管電鏡觀察發現，骨骼化大隱靜脈30 min內出現血管平滑肌細胞分裂和細胞凋亡，而非接觸獲取（the“no-touch”harvesting technique）大隱靜脈滋養血管超微結構改變不明顯[17-18]。由此可見，血管外膜是滋養血管發生和代謝的重要部位，滋養血管的開放和增多與血管壁的壓力和缺氧關系密切[19-20]。
前期我們的研究[6]發現，高流體靜力壓和缺氧下大隱靜脈和脾靜脈管壁滋養血管明顯增多，兩者血管床存在異質性，脾靜脈以數量增多為主，大隱靜脈以平均截面積增大為主。本研究發現，大隱靜脈曲張組和病脾靜脈組滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂。該結果與我們前期研究[21]的大隱靜脈和脾靜脈管壁內皮細胞改變有相近之處（內皮表面不光滑，微絨毛增多，吞飲小泡消失，基底膜不完整，細胞核形態不規則，線粒體變性，凹陷增多，胞漿內細胞器減少）。本研究結果提示，曲張靜脈和病脾靜脈管壁滋養血管內皮細胞超微結構的改變以細胞器的線粒體為主。表明靜脈高壓和缺氧同樣會影響滋養血管內皮的超微結構[22-23]。動物實驗[24]也證實，滋養血管的密度與管壁壓力和氧張力密切相關。有作者[3]認為，滋養血管增多是血管壁內改善代謝狀況的一種繼發性血管反應。滋養血管具備新生血管的潛能，這與內皮祖細胞的存在密切相關[25]。
綜上所述，高流體靜力壓和缺氧下大隱靜脈和脾靜脈管壁滋養血管內皮細胞的超微結構會出現重塑現象，二者改變相同。
致謝：本課題得到濰坊醫學院電鏡室張圣明教授和吳紅娟副教授大力幫助，謹表致謝！
研究表明，靜脈管壁的滋養血管主要分布在外膜和中膜的外層，以縱向排列的滋養血管占居優勢[1-2]。靜脈高壓時，血管壁的滋養血管增多，且扭曲和呈不規則膨脹[3-4]。通過血管鑄型技術和精確解剖技術評價大隱靜脈滋養血管結構，國外已有報道[3, 5]。前期，我們對高流體靜力壓下大隱靜脈和脾靜脈滋養血管的組織形態學進行了對比研究[6]。本研究采用半薄切片定位，通過電鏡觀察大隱靜脈和脾靜脈滋養血管內皮細胞的超微結構變化，探討高流體靜力壓和缺氧對滋養血管內皮細胞的影響。
1 資料與方法
1.1 標本來源
所有病例均經濰坊醫學院人類研究倫理委員會批準。所有選取標本均來自解放軍第89醫院普通外科2009年6月至2012年6月期間的住院的患者。其中行高位結扎剝脫加旋切治療的大隱靜脈曲張患者20例作為大隱靜脈曲張組，男12例，女8例，年齡23～46歲，平均43歲，術前均經彩色多普勒超聲檢查確診為原發性大隱靜脈曲張，按臨床、病因、解剖及病理生理（CEAP）分類選取C2～C3、病程5～8年者。行脾大部切除大網膜胸骨后固定術治療的門靜脈高壓癥患者14例作為病脾靜脈組，男8例，女6例，年齡21～44歲，平均42歲，確診為乙型肝炎后肝硬變，肝功能Child分級為A、B級，伴有脾功能亢進，病程為5～8年。創傷后下肢行截肢術而大隱靜脈無損傷者20例，男14例，女6例，年齡22～45歲，平均40歲；外傷性脾破裂脾靜脈無損傷者14例，男9例，女5例，年齡20～43歲，平均39歲，共34例作為對照組。
1.2 主要試劑與儀器
試劑：25%戊二醛溶液水溶液購自上海安譜科學儀器有限公司；環氧丙烷液購自上海歐復實業有限公司；環氧樹脂購自南京藍柯高分子材料有限公司；醋酸鈾飽和水溶液購自西安鼎天化工有限公司；枸櫞酸鉛溶液購自南京森貝伽生物科技有限公司。儀器：超薄切片機（德國徠卡，RM2235型），光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51型），透視電子顯微鏡（日本日立，H-7500型）。
1.3 方法
將獲取的大隱靜脈和脾靜脈標本切取1 mm見方的組織塊，1 min內置入戊二醛溶液固定；經1%鋨酸后固定，用磷酸鹽（PBS）緩沖溶液將多余的鋨酸洗凈后，梯度乙醇脫水；分別浸入環氧丙烷液30 min、環氧丙烷:環氧樹脂（1:1）液2 h、環氧丙烷:環氧樹脂（1:2）液1 h和環氧樹脂（Epon 812）液2 h，最后用環氧樹脂包埋后入45℃烤箱12 h、65℃烤箱48 h。包埋塊修整，超薄切片機切片，將0.8μm厚切片轉移到載玻片上、烘干。脫環氧樹脂、脫堿，HE染色，光鏡下觀察大隱靜脈和脾靜脈外膜層滋養血管，半薄切片定位。采用超薄切片，片厚70 nm，切片水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液浸30 min，雙蒸水洗3次各15 min；然后再用枸櫞酸鉛溶液浸15 min，雙蒸水洗3次各15 min。應用日立H-7500型透射電鏡觀察大隱靜脈和脾靜脈外膜層滋養血管內皮細胞的超微結構變化并攝片。
2 結果
病脾靜脈組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常（圖 1A）；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂（圖 1B）。脾靜脈對照組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布和細胞器形態正常（圖 2A、2B）。大隱靜脈曲張組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常（圖 3A）；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂及髓樣變（圖 3B）。大隱靜脈對照組：滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布和細胞器形態正常（圖 4A、4B）。
圖1
示病脾靜脈組滋養血管內皮細胞的改變。1A：細胞核（TEM×10 000）；1B：黑箭所示線粒體（TEM×20 000）??圖 2?示脾靜脈對照組滋養血管內皮細胞的改變。2A：細胞核（TEM×10 000）；2B：黑箭所示線粒體（TEM×30 000）??圖 3?示大隱靜脈曲張組滋養血管內皮細胞的改變。3A：細胞核（TEM×10 000）；3B：黑箭所示線粒體（TEM×20 000）??圖 4?示大隱靜脈對照組滋養血管內皮細胞的改變。4A：細胞核（TEM×10 000）；4B：黑箭所示線粒體（TEM×30 000）。EC：內皮細胞；N：細胞核；Ery：紅細胞
Figure1.
The changes of endothelial cell in vasa vasorum of diseased splenic veins group. 1A:Nucleus (TEM×10 000);1B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000)??Figuer 2??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of splenic vein group. 2A:Nucleus (TEM×10 000);2B:Black arrow mean mitochondria (TEM×30 000)??Figuer 3??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of varicose greater saphenous veins group. 3A:Nucleus (TEM×10 000);3B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000)??Figuer 4??The changes of endothelial cell in vasa vasorum of greater saphenous veins group. 4A:Nucleus (TEM×10 000); 4 B:Black arrow mean mitochondria (TEM×10 000). EC:Endothelial cell; N:Nucleus; Ery:Erythrocyte
3 討論
關于大隱靜脈滋養血管的研究目前主要聚焦在兩方面：一是慢性功能不全靜脈滋養血管，二是移植大隱靜脈滋養血管[7]。研究發現，一方面，組織缺氧可誘發血管壁滋養血管增多，血管增生是一種退化和功能不全血管壁的營養與保護性反應[8-9]；另一方面，新生血管形成與白細胞募集、局部炎性因子產生及血管壁易變性增加有關[10]。滋養血管的變化還與交感神經調節、平滑肌增生及局部凝血平衡相關[11]。保護好外膜完整的滋養血管，可增加靜脈內皮的完整性，維持內皮一氧化氮合酶活性和血管舒縮性及抗凝血活性[12-14]。一般而言，通常采用血管鑄型微CT或掃描電鏡觀察血管壁滋養血管的立體分布。電鏡下發現大隱靜脈滋養血管沿主干管壁平行縱軸分布，靜脈數量常多于動脈[15-16]。Lametschwandtner等[2]掃描電鏡觀察，滋養血管呈圓形收縮狀或結狀、外翻。當血流壓力升高時，滋養血管會產生膨脹與伸展，但不會影響滋養血管功能。Kachlik等[1]通過血管鑄型電鏡測量滋養血管直徑，發現動脈滋養血管直徑為11.6～36.6μm，毛細血管直徑為4.7～11.6μm，靜脈滋養血管直徑為36.6～200.3μm。一組大隱靜脈滋養血管電鏡觀察發現，骨骼化大隱靜脈30 min內出現血管平滑肌細胞分裂和細胞凋亡，而非接觸獲取（the“no-touch”harvesting technique）大隱靜脈滋養血管超微結構改變不明顯[17-18]。由此可見，血管外膜是滋養血管發生和代謝的重要部位，滋養血管的開放和增多與血管壁的壓力和缺氧關系密切[19-20]。
前期我們的研究[6]發現，高流體靜力壓和缺氧下大隱靜脈和脾靜脈管壁滋養血管明顯增多，兩者血管床存在異質性，脾靜脈以數量增多為主，大隱靜脈以平均截面積增大為主。本研究發現，大隱靜脈曲張組和病脾靜脈組滋養血管內皮細胞細胞核結構完整，染色質分布正常；部分線粒體基質深染，嵴模糊、嵴斷裂。該結果與我們前期研究[21]的大隱靜脈和脾靜脈管壁內皮細胞改變有相近之處（內皮表面不光滑，微絨毛增多，吞飲小泡消失，基底膜不完整，細胞核形態不規則，線粒體變性，凹陷增多，胞漿內細胞器減少）。本研究結果提示，曲張靜脈和病脾靜脈管壁滋養血管內皮細胞超微結構的改變以細胞器的線粒體為主。表明靜脈高壓和缺氧同樣會影響滋養血管內皮的超微結構[22-23]。動物實驗[24]也證實，滋養血管的密度與管壁壓力和氧張力密切相關。有作者[3]認為，滋養血管增多是血管壁內改善代謝狀況的一種繼發性血管反應。滋養血管具備新生血管的潛能，這與內皮祖細胞的存在密切相關[25]。
綜上所述，高流體靜力壓和缺氧下大隱靜脈和脾靜脈管壁滋養血管內皮細胞的超微結構會出現重塑現象，二者改變相同。
致謝：本課題得到濰坊醫學院電鏡室張圣明教授和吳紅娟副教授大力幫助，謹表致謝！
