引用本文： 管小青, 鄭向欣, 吳驥, 顧書成, 袁牧, 張旭旭, 邱興, 陸柏林. 三陰性乳腺癌組織中MMP-3和VEGF表達的相關性及臨床分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(5): 567-571. doi: 10.7507/1007-9424.20140137 復制
三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人類表皮生長因子受體-2（HER-2）表達陰性的一類乳腺癌。文獻[1-3]報道，TNBC約占乳腺癌總數的15%～25%。由于缺乏治療靶點，且常常發生在絕經前乳腺癌患者，年齡小，惡性程度高，有著較高的局部復發和遠處轉移率，臨床上預后較差。有研究表明，在腫瘤的浸潤轉移過程中，基質金屬蛋白酶（MMP）家族起重要作用[4]，而血管內皮細胞生長因子（VEGF）在腫瘤血管生成過程中發揮著核心的作用[5-6]。本研究收集2008年1月至2013年1月期間我院收治的112例確診為TNBC的患者，用免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中MMP-3和VEGF的表達，分析兩者在TNBC中表達的相關性及其對預后的影響。
1 資料與方法
1.1 一般資料
本組資料來源于2008年1月至2013年1月期間徐州醫學院附屬宿遷醫院/南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院收治的112例已經確診為TNBC患者，年齡26～73歲，中位年齡41.3歲。均為女性患者和初次確診的病例。絕經前患者78例，絕經后34例。病理類型：原位導管內癌10例，浸潤性導管癌77例，原位小葉癌4例，浸潤性小葉癌18例，硬癌3例。有腋窩淋巴結轉移74例，無腋窩淋巴結轉移38例。按2002年第6版AJCC乳腺癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者80例。另均衡隨機法選擇2008年1月至2013年1月期間徐州醫學院附屬宿遷醫院/南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院收治的、其病理類型及病理分期相近的112例luminal型乳腺癌患者作為對照。
1.2 免疫組織化學方法
1.2.1 試劑
所有檢測試劑均購于福州邁新生物技術有限公司，包括一抗、二抗、單抗試劑盒，兔抗人MMP-3多克隆抗體，兔抗人VEGF單克隆抗體，DAB底物顯色劑。
1.2.2 操作方法
應用SP法檢測ER、PR、Her-2、MMP-3和VEGF。實驗步驟按試劑盒說明書進行，PBS代替一抗作陰性對照，福州邁新生物技術有限公司提供的MMP-3和VEGF已知陽性的切片作為陽性對照。
1.2.3 結果判斷
ER、PR和Her-2免疫組織化學SP檢測法均為（－），納入本組研究。任何ER或（和）PR被判斷為（+/－）均視為陽性；對于Her-2檢測的結果判斷，如果SP法檢測Her-2為（+）則直接判斷為陰性，如果Her-2為（+++）則直接判斷為陽性，如果Her-2為（++），則再進行Fish方法檢測并進行驗證是否為陰性，Fish方法提示Her-2也為陰性者，方可納入TNBC組。MMP-3、VEGF以細胞漿或細胞膜出現明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，在鏡下觀察陽性細胞比例及陽性著色強度，參照Shimizu等[7]的評分標準進行半定量積分判斷結果。著色強度判定：不著色為0分，弱著色為1分，中度著色為2分，強著色為3分；陽性細胞比例判定：陽性細胞占總細胞數小于10%為0分，10%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。最后，以陽性細胞的百分比得分與著色強度得分之積作為最終結果進行判定，≥3分為陽性。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。運用方差分析、χ2檢驗、t檢驗等方法對數據進行統計學處理。以Spearman檢驗進行相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MMP-3和VEGF在不同乳腺癌組織中的表達結果
MMP-3和VEGF在TNBC組織中的免疫組織化學染色結果見圖 1。MMP-3在TNBC和luminal型乳腺癌中的表達陽性率分別為90.18%（101/112）和49.11%（55/112），VEGF在其中的表達陽性率分別為84.82%（95/112）和48.21%（54/112），二者在TNBC乳腺癌中均明顯高于luminal型乳腺癌，差異有統計學意義（MMP-3：χ2=44.682，P=0.000；VEGF：χ2=33.695，P=0.000）。
圖1
TNBC組織中MMP-3和VEGF表達結果，細胞漿呈棕黃色陽性表達（SP×400）。1A：MMP-3；1B：VEGF
Figure1.
Results of MMP-3 and VEGF expressions in TNBC tissues, strongly positive expression with buffy in cytoplasm (SP×400).1A:MMP-3;1B:VEGF
2.2 MMP-3和VEGF在TNBC中的陽性表達與其臨床病理特征的關系
TNBC中MMP-3和VEGF陽性表達均與患者發病年齡、月經情況、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移、病理類型、p53表達情況和TNM分期有關（P < 0.05）。見表 1。
表1
MMP-3和VEGF在TNBC中的表達與其臨床病理特征的關系
Table1.
Expressions of MMP-3 and VEGF in TNBC tissues and its relationship to clinicopathologic characteristics
2.3 MMP-3和VEGF表達的相關性
TNBC乳腺癌中MMP-3陽性表達101例患者中，VEGF陽性表達92例，陰性表達9例；MMP-3陰性表達的11例患者中，VEGF陽性表達3例，陰性表達8例，二者表達呈正相關（rs=0.771，P < 0.01）。
2.4 隨訪結果
通過電話、患者復診或復治隨訪，隨訪時間1～5年（平均2.8年），隨訪率為89.29%（100/112）。有11例MMP-3陽性表達的患者失訪，自失訪之日起作為死亡計算。112例TNBC乳腺癌患者1年生存率為96.43%（108/112）。有4例分別于術后5、7、9、11個月死亡，其中1例死于化療嚴重并發癥，3例為腦、肺、肝、骨等多臟器轉移，此4例患者其MMP-3、VEGF均雙陽性；100例TNBC獲得隨訪的患者3年內臟器復發轉移82例，3年內復發轉移率為73.21%；5年生存率（含帶瘤生存）為36.61%。
3 討論
TNBC作為乳腺癌中的一種特殊類型，其病理組織學、分子生物學方面有別于其他類型乳腺癌，表達不同的細胞因子，如CK5/6、CK14、CK17等[8]，復發和轉移率高，尤其內臟轉移和軟組織復發發生率高，嚴重影響此類患者的生存期[9]。我院近5年來共收治653例乳腺癌，其中TNBC 112例，約占同期乳腺癌的17.15%，與文獻[10-11]報道的結果基本一致。TNBC除了與其他類型乳腺癌有不同細胞因子表達之外，尤其是與luminal型相比，還有p53、MMP-3、VEGF呈現高表達[12-15]。本研究中，VEGF和MMP-3在TNBC組織中均呈現高表達，且二者表達呈正相關，并且VEGF和MMP-3在TNBC中的表達明顯高于luminal型乳腺癌（P < 0.05），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌惡性生物學行為中可能有內在聯系，可能共同促進乳腺癌的血管形成和向遠處侵襲、轉移，可作為判斷TNBC侵襲和轉移能力的有價值的指標。
VEGF是內皮細胞特異性的有絲分裂原，可特異性地促進內皮細胞生長及血管生成，并能提高血管滲透性，為血管內皮細胞的遷移和腫瘤細胞的轉移提供基質[16]。VEGF是目前已知作用最強的、腫瘤細胞分泌的促脈管形成因子之一，腫瘤生長較快部位的缺血缺氧可刺激VEGF表達增強，誘導脈管生成，促進腫瘤細胞發生淋巴結和肺轉移[17]。MMP是鋅依賴性的蛋白酶超家族，其家族成員能夠降解生理和病理狀況下細胞外基質中所有的蛋白成分和基底膜[18-19]。MMP在腫瘤或間質細胞中的過表達與癌癥的演變進展之間存在一定的因果關系。MMP-3作為MMP家族的一員，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ型膠原纖維以及黏蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和原纖維蛋白，在多種惡性腫瘤中表達，如結直腸癌、皮膚癌、乳腺癌、基底細胞癌等，并且與腫瘤的生物學行為和預后有關[20-22]。本研究中發現，TNBC中MMP-3和VEGF表達與患者發病年齡、絕經情況、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移和臨床分期均有關。VEGF和MMP-3在淋巴結轉移組和Ⅲ～Ⅳ期的表達水平明顯高于淋巴結無轉移組和Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05），提示VEGF的表達與TNBC的侵襲和轉移能力有關，其機制可能是通過誘導血管的形成，為腫瘤的生長提供充足的營養，從而促進腫瘤體積增大，這與Nathanson [17]報道相符；MMP-3在TNBC的浸潤轉移中扮演重要角色，它的表達情況也可以作為判定TNBC進展情況的指標，其在TNBC中更高的表達率提示了TNBC更差的預后[23]。在p53呈高表達的患者中，MMP-3、VEGF的表達率也較高，這一結果為臨床選擇對其治療的方案提供依據，并且在TNBC中MMP-3和VEGF的表達呈正相關（rs=0.771，P < 0.01），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌惡性生物學行為中可能有內在聯系，可能共同促進乳腺癌的血管形成和向遠處侵襲、轉移。
TNBC患者的3年內復發轉移率、5年生存率明顯低于luminal型乳腺癌患者，此已成定論。而TNBC的預后最差[24]，復發危險多發生在治療后的1～3年內，多數患者在5年內死亡。本組資料顯示，在獲得隨訪的100例TNBC中，3年內復發轉移率為73.21%，5年生存率（含帶瘤生存）僅為36.61%，而且均發生在MMP-3和VEGF均呈陽性表達的TNBC患者，說明TNBC患者其MMP-3和VEGF均呈陽性表達的預后更差。本組3年內復發轉移率高，5年生存率低，與Tischkowitz等[25]報道的基本相似。但是3年內轉移率高于蔡欣等[26]報道的57.14%，遠低于57.10%的5年生存率。分析本組3年內轉移率高、生存率低的原因可能是本組患者病期晚病理分級差，MMP-3和VEGF均呈陽性表達，沒有進行其他分子靶向治療的經濟條件，拒絕后續強化治療等。
TNBC由于缺乏激素受體及Her-2的表達，故對內分泌治療及曲妥珠單抗靶向治療無效。術后易復發，局部放療的效果也不佳[27]，故化療是其主要的治療手段。抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗單一藥物應用在乳腺癌治療中并未表現出抗腫瘤活性，但在TNBC中也許能提高化療療效，因為TNBC大多高表達VEGF。Ⅱ期臨床試驗[28-29]結果提示，西妥昔單抗聯合化療治療VEGF過表達TNBC可提高客觀有效率。因此，對TNBC進行MMP-3、VEGF檢測，以便了解MMP-3、VEGF高表達的TNBC患者的預后，并通過對上述因子表達的干預，抑制腫瘤細胞降解基質及脈管形成，從而阻斷癌細胞轉移，為臨床上對TNBC的治療提供新的思路。
三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人類表皮生長因子受體-2（HER-2）表達陰性的一類乳腺癌。文獻[1-3]報道，TNBC約占乳腺癌總數的15%～25%。由于缺乏治療靶點，且常常發生在絕經前乳腺癌患者，年齡小，惡性程度高，有著較高的局部復發和遠處轉移率，臨床上預后較差。有研究表明，在腫瘤的浸潤轉移過程中，基質金屬蛋白酶（MMP）家族起重要作用[4]，而血管內皮細胞生長因子（VEGF）在腫瘤血管生成過程中發揮著核心的作用[5-6]。本研究收集2008年1月至2013年1月期間我院收治的112例確診為TNBC的患者，用免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中MMP-3和VEGF的表達，分析兩者在TNBC中表達的相關性及其對預后的影響。
1 資料與方法
1.1 一般資料
本組資料來源于2008年1月至2013年1月期間徐州醫學院附屬宿遷醫院/南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院收治的112例已經確診為TNBC患者，年齡26～73歲，中位年齡41.3歲。均為女性患者和初次確診的病例。絕經前患者78例，絕經后34例。病理類型：原位導管內癌10例，浸潤性導管癌77例，原位小葉癌4例，浸潤性小葉癌18例，硬癌3例。有腋窩淋巴結轉移74例，無腋窩淋巴結轉移38例。按2002年第6版AJCC乳腺癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者80例。另均衡隨機法選擇2008年1月至2013年1月期間徐州醫學院附屬宿遷醫院/南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院收治的、其病理類型及病理分期相近的112例luminal型乳腺癌患者作為對照。
1.2 免疫組織化學方法
1.2.1 試劑
所有檢測試劑均購于福州邁新生物技術有限公司，包括一抗、二抗、單抗試劑盒，兔抗人MMP-3多克隆抗體，兔抗人VEGF單克隆抗體，DAB底物顯色劑。
1.2.2 操作方法
應用SP法檢測ER、PR、Her-2、MMP-3和VEGF。實驗步驟按試劑盒說明書進行，PBS代替一抗作陰性對照，福州邁新生物技術有限公司提供的MMP-3和VEGF已知陽性的切片作為陽性對照。
1.2.3 結果判斷
ER、PR和Her-2免疫組織化學SP檢測法均為（－），納入本組研究。任何ER或（和）PR被判斷為（+/－）均視為陽性；對于Her-2檢測的結果判斷，如果SP法檢測Her-2為（+）則直接判斷為陰性，如果Her-2為（+++）則直接判斷為陽性，如果Her-2為（++），則再進行Fish方法檢測并進行驗證是否為陰性，Fish方法提示Her-2也為陰性者，方可納入TNBC組。MMP-3、VEGF以細胞漿或細胞膜出現明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，在鏡下觀察陽性細胞比例及陽性著色強度，參照Shimizu等[7]的評分標準進行半定量積分判斷結果。著色強度判定：不著色為0分，弱著色為1分，中度著色為2分，強著色為3分；陽性細胞比例判定：陽性細胞占總細胞數小于10%為0分，10%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。最后，以陽性細胞的百分比得分與著色強度得分之積作為最終結果進行判定，≥3分為陽性。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。運用方差分析、χ2檢驗、t檢驗等方法對數據進行統計學處理。以Spearman檢驗進行相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MMP-3和VEGF在不同乳腺癌組織中的表達結果
MMP-3和VEGF在TNBC組織中的免疫組織化學染色結果見圖 1。MMP-3在TNBC和luminal型乳腺癌中的表達陽性率分別為90.18%（101/112）和49.11%（55/112），VEGF在其中的表達陽性率分別為84.82%（95/112）和48.21%（54/112），二者在TNBC乳腺癌中均明顯高于luminal型乳腺癌，差異有統計學意義（MMP-3：χ2=44.682，P=0.000；VEGF：χ2=33.695，P=0.000）。
圖1
TNBC組織中MMP-3和VEGF表達結果，細胞漿呈棕黃色陽性表達（SP×400）。1A：MMP-3；1B：VEGF
Figure1.
Results of MMP-3 and VEGF expressions in TNBC tissues, strongly positive expression with buffy in cytoplasm (SP×400).1A:MMP-3;1B:VEGF
2.2 MMP-3和VEGF在TNBC中的陽性表達與其臨床病理特征的關系
TNBC中MMP-3和VEGF陽性表達均與患者發病年齡、月經情況、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移、病理類型、p53表達情況和TNM分期有關（P < 0.05）。見表 1。
表1
MMP-3和VEGF在TNBC中的表達與其臨床病理特征的關系
Table1.
Expressions of MMP-3 and VEGF in TNBC tissues and its relationship to clinicopathologic characteristics
2.3 MMP-3和VEGF表達的相關性
TNBC乳腺癌中MMP-3陽性表達101例患者中，VEGF陽性表達92例，陰性表達9例；MMP-3陰性表達的11例患者中，VEGF陽性表達3例，陰性表達8例，二者表達呈正相關（rs=0.771，P < 0.01）。
2.4 隨訪結果
通過電話、患者復診或復治隨訪，隨訪時間1～5年（平均2.8年），隨訪率為89.29%（100/112）。有11例MMP-3陽性表達的患者失訪，自失訪之日起作為死亡計算。112例TNBC乳腺癌患者1年生存率為96.43%（108/112）。有4例分別于術后5、7、9、11個月死亡，其中1例死于化療嚴重并發癥，3例為腦、肺、肝、骨等多臟器轉移，此4例患者其MMP-3、VEGF均雙陽性；100例TNBC獲得隨訪的患者3年內臟器復發轉移82例，3年內復發轉移率為73.21%；5年生存率（含帶瘤生存）為36.61%。
3 討論
TNBC作為乳腺癌中的一種特殊類型，其病理組織學、分子生物學方面有別于其他類型乳腺癌，表達不同的細胞因子，如CK5/6、CK14、CK17等[8]，復發和轉移率高，尤其內臟轉移和軟組織復發發生率高，嚴重影響此類患者的生存期[9]。我院近5年來共收治653例乳腺癌，其中TNBC 112例，約占同期乳腺癌的17.15%，與文獻[10-11]報道的結果基本一致。TNBC除了與其他類型乳腺癌有不同細胞因子表達之外，尤其是與luminal型相比，還有p53、MMP-3、VEGF呈現高表達[12-15]。本研究中，VEGF和MMP-3在TNBC組織中均呈現高表達，且二者表達呈正相關，并且VEGF和MMP-3在TNBC中的表達明顯高于luminal型乳腺癌（P < 0.05），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌惡性生物學行為中可能有內在聯系，可能共同促進乳腺癌的血管形成和向遠處侵襲、轉移，可作為判斷TNBC侵襲和轉移能力的有價值的指標。
VEGF是內皮細胞特異性的有絲分裂原，可特異性地促進內皮細胞生長及血管生成，并能提高血管滲透性，為血管內皮細胞的遷移和腫瘤細胞的轉移提供基質[16]。VEGF是目前已知作用最強的、腫瘤細胞分泌的促脈管形成因子之一，腫瘤生長較快部位的缺血缺氧可刺激VEGF表達增強，誘導脈管生成，促進腫瘤細胞發生淋巴結和肺轉移[17]。MMP是鋅依賴性的蛋白酶超家族，其家族成員能夠降解生理和病理狀況下細胞外基質中所有的蛋白成分和基底膜[18-19]。MMP在腫瘤或間質細胞中的過表達與癌癥的演變進展之間存在一定的因果關系。MMP-3作為MMP家族的一員，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ型膠原纖維以及黏蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和原纖維蛋白，在多種惡性腫瘤中表達，如結直腸癌、皮膚癌、乳腺癌、基底細胞癌等，并且與腫瘤的生物學行為和預后有關[20-22]。本研究中發現，TNBC中MMP-3和VEGF表達與患者發病年齡、絕經情況、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移和臨床分期均有關。VEGF和MMP-3在淋巴結轉移組和Ⅲ～Ⅳ期的表達水平明顯高于淋巴結無轉移組和Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05），提示VEGF的表達與TNBC的侵襲和轉移能力有關，其機制可能是通過誘導血管的形成，為腫瘤的生長提供充足的營養，從而促進腫瘤體積增大，這與Nathanson [17]報道相符；MMP-3在TNBC的浸潤轉移中扮演重要角色，它的表達情況也可以作為判定TNBC進展情況的指標，其在TNBC中更高的表達率提示了TNBC更差的預后[23]。在p53呈高表達的患者中，MMP-3、VEGF的表達率也較高，這一結果為臨床選擇對其治療的方案提供依據，并且在TNBC中MMP-3和VEGF的表達呈正相關（rs=0.771，P < 0.01），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌惡性生物學行為中可能有內在聯系，可能共同促進乳腺癌的血管形成和向遠處侵襲、轉移。
TNBC患者的3年內復發轉移率、5年生存率明顯低于luminal型乳腺癌患者，此已成定論。而TNBC的預后最差[24]，復發危險多發生在治療后的1～3年內，多數患者在5年內死亡。本組資料顯示，在獲得隨訪的100例TNBC中，3年內復發轉移率為73.21%，5年生存率（含帶瘤生存）僅為36.61%，而且均發生在MMP-3和VEGF均呈陽性表達的TNBC患者，說明TNBC患者其MMP-3和VEGF均呈陽性表達的預后更差。本組3年內復發轉移率高，5年生存率低，與Tischkowitz等[25]報道的基本相似。但是3年內轉移率高于蔡欣等[26]報道的57.14%，遠低于57.10%的5年生存率。分析本組3年內轉移率高、生存率低的原因可能是本組患者病期晚病理分級差，MMP-3和VEGF均呈陽性表達，沒有進行其他分子靶向治療的經濟條件，拒絕后續強化治療等。
TNBC由于缺乏激素受體及Her-2的表達，故對內分泌治療及曲妥珠單抗靶向治療無效。術后易復發，局部放療的效果也不佳[27]，故化療是其主要的治療手段。抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗單一藥物應用在乳腺癌治療中并未表現出抗腫瘤活性，但在TNBC中也許能提高化療療效，因為TNBC大多高表達VEGF。Ⅱ期臨床試驗[28-29]結果提示，西妥昔單抗聯合化療治療VEGF過表達TNBC可提高客觀有效率。因此，對TNBC進行MMP-3、VEGF檢測，以便了解MMP-3、VEGF高表達的TNBC患者的預后，并通過對上述因子表達的干預，抑制腫瘤細胞降解基質及脈管形成，從而阻斷癌細胞轉移，為臨床上對TNBC的治療提供新的思路。
