引用本文： 陳靜, 徐曉陽, 朱新江, 戴冬秋. ADAMTS1在結直腸癌組織中的表達及其與預后的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(3): 330-334. doi: 10.7507/1007-9424.20140077 復制
含血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombos-pondin motifs，ADAMTS）是近年來發現的繼基質金屬蛋白酶（MMPs）后的另外一類Zn2＋依賴的分泌型金屬蛋白酶，它廣泛存在于哺乳動物和無脊椎動物體內[1]。自從1997年發現第1個ADAMTSs家族成員以來[2]，已經有19個成員被發現，其在人體正常生理及病理活動中均起著重要的作用。目前的研究[3-5]發現，ADAMTSs家族參與眾多生理活動過程，如膠原成熟、器官形成、黏蛋白降解、抑制血管生成、神經再生、炎癥等。近來逐漸發現，該家族在腫瘤的發生、發展和轉移過程中亦具有重要的作用[6-8]。而有關ADAMTSs家族中含血小板結合蛋白基序1的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS1）在結直腸癌中的作用，國內外鮮見報道。筆者通過免疫組化染色方法檢測了ADAMTS1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，以探討其表達與結直腸癌臨床病理特征和預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集1995年5月至2005年7月期間中國醫科大學附屬第四醫院胃腸外科經手術切除的結直腸癌組織及癌旁組織（癌組織以遠5 cm）的石蠟包埋標本65例，所有標本均經病理學檢查證實。全部病例均為首發，手術前后均未接受放化療，均行根治性切除術；其中男41例，女24例；＜65歲26例，≥65歲39例；腫瘤部位：直腸22例，結腸43例；手術方式：Dixon術13例，Miles術9例，右半結腸切除術21例，乙狀結腸切除術15例，左半結腸切除術5例，橫結腸切除術2例；腫瘤直徑：＜5 cm者40例，≥5 cm 25例；TNM分期〔根據國際抗癌聯盟（UICC）標準〕：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例，Ⅳ期18例；病理學類型：腺癌55例，黏液腺癌10例；分化程度：高分化13例，中分化8例，低分化44例；有淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移24例。所有病例均獲訪，隨訪時間96～216個月，中位隨訪時間為120個月。術后出現遠處轉移39例，局部復發14例，隨訪期間死亡48例。
1.2 方法
采用SP免疫組織化學染色法檢測結直腸癌組織和癌旁組織中ADAMTS1的表達。兔抗人ADAMTS1多克隆抗體（編號：ab39194）為北京中杉生物技術有限公司代理的美國Abcam公司產品，即用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。將石蠟切片（5μm厚）常規脫蠟水化，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，以微波爐加熱修復抗原3 min；加ADAMTS1一抗（1︰500稀釋）4℃冰箱過夜后，滴加山羊抗兔IgG二抗37℃靜置10 min；再以DAB顯色，蘇木精復染，行脫水透明封片后，在顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，采用已經證實ADAMTS1表達陽性的人胎盤組織切片為陽性對照。
1.3 免疫組化染色評分判定
根據以下3個方面進行評分判定：①染色程度評分：0分，無染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強染色。②陽性染色細胞所占百分比評分：0分，所占比例為0；1分，＜10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，＞90%。③染色方式評分：0分，無染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，彌漫染色。標本染色積分=①得分×②得分×③得分。陰性為0分，陽性為1～36分。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學分析。ADAMTS1表達與結直腸癌臨床病理特征關系的分析采用χ2檢驗；生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，生存分析單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險模型。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADAMTS1在結直腸癌和癌旁組織中的表達
ADAMTS1陽性染色主要定位于癌旁組織的細胞漿中，呈黃色或棕黃色顆粒；在結直腸癌組織中呈少量或無表達（圖 1）。在結直腸癌組織中，ADAMTS1的表達陽性率為40%（26/65），癌旁組織為85%（55/65），結直腸癌組織的ADAMTS1表達陽性率低于癌旁組織（χ2=27.546，P＜0.001）。
圖1
示ADAMTS1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達結果（SP×200）。1A：在結直腸癌組織中呈陰性表達；1B：在癌旁組織中呈陽性表達
Figure1.
Expression of ADAMTS1 in colorectal cancer tissues and corr-esponding adjacent benign tissues (SP×200). 1A:Negative expression of ADAMTS-1 was observed in colorectal cancer tissues; 1B:Positive expression of ADAMTS1 was observed in adjacent benign tissues
2.2 結直腸癌組織中ADAMTS1表達與其臨床病理特征的關系
結直腸癌組織中ADAMTS1的表達與其淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的結直腸癌其ADAMTS1的表達陽性率低于無淋巴結轉移者（χ2=5.329，P=0.021），而ADAMTS1的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理學類型、腫瘤大小、分化程度及TNM分期均無關（P＞0.05），見表 1。
表1
ADAMTS1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship between expression of ADAMTS1 and clinico-pathological features of colorectal cancer(case)
2.3 ADAMTS1表達與結直腸癌預后關系的單因素分析結果
高-中分化（χ2=4.452，P=0.035）、Ⅰ～Ⅱ期（χ2=14.356，P＜0.001）、無淋巴結轉移（χ2=8.200，P=0.004）和ADAMTS1表達陽性（χ2=10.151，P=0.001）的結直腸癌其中位生存時間分別高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移和ADAMTS1表達陰性者。而結直腸癌患者的預后與年齡、性別、腫瘤部位、病理學類型及腫瘤大小均無關（P＞0.05）。見表 2。
表2
結直腸癌預后影響因素的單因素分析結果
Table2.
Univariate analysis results on influence factor of prognosis in colorectal cancer
2.4 ADAMTS1表達與結直腸癌預后關系的多因素分析結果
將ADAMTS1的表達情況、性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、病理學類型、分化程度、TNM分期以及淋巴結轉移情況納入Cox比例風險模型進行多因素分析。結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移和ADAMTS1表達情況是結直腸癌患者預后的獨立影響因素（表 3），Ⅰ～Ⅱ期（RR=3.782，95% CI：1.509～9.476，P=0.005）、無淋巴結轉移（RR=3.107，95% CI：1.186～8.138，P=0.021）和ADAMTS1表達陽性者（RR=2.020，95% CI：1.071～3.809，P=0.030）的生存情況較好。
表3
結直腸癌預后影響因素的Cox比例風險模型結果
Table3.
Influence factors of prognosis in colorectal cancer by using Cox proportional hazard model
3 討論
ADAMTSs家族是一類新的Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族。研究[3, 9-10]表明，ADAMTSs家族通過與細胞外基質結合及活化生長因子，在細胞增殖、凋亡及腫瘤的發生、發展及轉移中均起重要作用。ADAMTS1是ADAMTSs家族的成員之一，研究[11]發現，ADAMTS1可以結合血管內皮生長因子165（VEGF165），導致VEGF不能激活其受體即血管內皮生長因子受體2（VEGFR2），從而抑制腫瘤的血管生成。它還可以特異性地抑制上皮細胞增生，阻滯成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）誘導的血管生成和VEGF誘導的血管生成，具有抗血管生成作用[12]。研究[13-15]報道，ADAMTS1在多種腫瘤（包括結直腸癌）中的表達下調，其表達下調的原因與基因啟動子的高甲基化密切相關[16]。ADAMTS1在乳腺癌中的表達下調，通過抑制ADAMTS1的表達能夠使VEGF的表達上調，從而促進乳腺腫瘤細胞的遷移和浸潤[17]。ADAMTS1高表達能夠促進乳腺癌細胞的肺轉移[18]，因此其被認為是一種腫瘤生長抑制因子，但目前對ADAMTS1在腫瘤局部侵襲和轉移中的作用機理尚有爭論。有研究[19]認為，ADAMTS1在宮頸癌中的表達上調；還有研究[14, 20]認為，在胰腺癌和乳腺癌中，ADAMTS1可以通過提高癌細胞的遷徙和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移。筆者[21]曾報道，ADAMTS1在胃癌原發灶中的表達水平明顯低于淋巴結轉移灶，且其表達與VEGF的表達呈負相關。因此，目前對ADAMTS1在腫瘤發生、發展及轉移中的確切作用機理還不十分明確。
本研究應用免疫組化染色方法檢測了結直腸癌組織及癌旁組織中ADAMTS1的表達，發現其在結直腸癌組織中的表達陽性率較低，提示其可能是一種腫瘤生長抑制因子。研究[14]表明，ADAMTS1高表達的胰腺癌患者其淋巴結轉移和腹膜后侵襲明顯增多。本組資料結果顯示，結直腸癌組織中ADAMTS1的表達與淋巴結轉移相關，無淋巴結轉移者的ADAMTS1表達陽性率較高。研究[22-24]認為，術前癌胚抗原（CEA）水平、腫瘤病理學類型、淋巴結轉移、腫瘤分期等是結直腸癌最重要的預后指標。本組資料多因素分析結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移結直腸癌患者的預后明顯差于Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結轉移者。有研究[25]報道，ADAMTS8高表達和ADMATS15低表達的乳腺癌患者具有較差的預后，表明此基因家族可能與乳腺癌的預后有關。此外，本組資料結果表明，ADAMTS1表達陽性者的預后明顯好于表達陰性者，提示ADAMTS1可能是預測結直腸癌預后的獨立指標之一。
綜上所述，ADAMTS1可能是一種腫瘤生長抑制因子，它可能與結直腸癌的發展及淋巴結轉移情況的關系更密切，也可能是預測結直腸癌預后的一種新指標。
含血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombos-pondin motifs，ADAMTS）是近年來發現的繼基質金屬蛋白酶（MMPs）后的另外一類Zn2＋依賴的分泌型金屬蛋白酶，它廣泛存在于哺乳動物和無脊椎動物體內[1]。自從1997年發現第1個ADAMTSs家族成員以來[2]，已經有19個成員被發現，其在人體正常生理及病理活動中均起著重要的作用。目前的研究[3-5]發現，ADAMTSs家族參與眾多生理活動過程，如膠原成熟、器官形成、黏蛋白降解、抑制血管生成、神經再生、炎癥等。近來逐漸發現，該家族在腫瘤的發生、發展和轉移過程中亦具有重要的作用[6-8]。而有關ADAMTSs家族中含血小板結合蛋白基序1的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS1）在結直腸癌中的作用，國內外鮮見報道。筆者通過免疫組化染色方法檢測了ADAMTS1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，以探討其表達與結直腸癌臨床病理特征和預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集1995年5月至2005年7月期間中國醫科大學附屬第四醫院胃腸外科經手術切除的結直腸癌組織及癌旁組織（癌組織以遠5 cm）的石蠟包埋標本65例，所有標本均經病理學檢查證實。全部病例均為首發，手術前后均未接受放化療，均行根治性切除術；其中男41例，女24例；＜65歲26例，≥65歲39例；腫瘤部位：直腸22例，結腸43例；手術方式：Dixon術13例，Miles術9例，右半結腸切除術21例，乙狀結腸切除術15例，左半結腸切除術5例，橫結腸切除術2例；腫瘤直徑：＜5 cm者40例，≥5 cm 25例；TNM分期〔根據國際抗癌聯盟（UICC）標準〕：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例，Ⅳ期18例；病理學類型：腺癌55例，黏液腺癌10例；分化程度：高分化13例，中分化8例，低分化44例；有淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移24例。所有病例均獲訪，隨訪時間96～216個月，中位隨訪時間為120個月。術后出現遠處轉移39例，局部復發14例，隨訪期間死亡48例。
1.2 方法
采用SP免疫組織化學染色法檢測結直腸癌組織和癌旁組織中ADAMTS1的表達。兔抗人ADAMTS1多克隆抗體（編號：ab39194）為北京中杉生物技術有限公司代理的美國Abcam公司產品，即用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。將石蠟切片（5μm厚）常規脫蠟水化，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，以微波爐加熱修復抗原3 min；加ADAMTS1一抗（1︰500稀釋）4℃冰箱過夜后，滴加山羊抗兔IgG二抗37℃靜置10 min；再以DAB顯色，蘇木精復染，行脫水透明封片后，在顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，采用已經證實ADAMTS1表達陽性的人胎盤組織切片為陽性對照。
1.3 免疫組化染色評分判定
根據以下3個方面進行評分判定：①染色程度評分：0分，無染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強染色。②陽性染色細胞所占百分比評分：0分，所占比例為0；1分，＜10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，＞90%。③染色方式評分：0分，無染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，彌漫染色。標本染色積分=①得分×②得分×③得分。陰性為0分，陽性為1～36分。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學分析。ADAMTS1表達與結直腸癌臨床病理特征關系的分析采用χ2檢驗；生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，生存分析單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險模型。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADAMTS1在結直腸癌和癌旁組織中的表達
ADAMTS1陽性染色主要定位于癌旁組織的細胞漿中，呈黃色或棕黃色顆粒；在結直腸癌組織中呈少量或無表達（圖 1）。在結直腸癌組織中，ADAMTS1的表達陽性率為40%（26/65），癌旁組織為85%（55/65），結直腸癌組織的ADAMTS1表達陽性率低于癌旁組織（χ2=27.546，P＜0.001）。
圖1
示ADAMTS1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達結果（SP×200）。1A：在結直腸癌組織中呈陰性表達；1B：在癌旁組織中呈陽性表達
Figure1.
Expression of ADAMTS1 in colorectal cancer tissues and corr-esponding adjacent benign tissues (SP×200). 1A:Negative expression of ADAMTS-1 was observed in colorectal cancer tissues; 1B:Positive expression of ADAMTS1 was observed in adjacent benign tissues
2.2 結直腸癌組織中ADAMTS1表達與其臨床病理特征的關系
結直腸癌組織中ADAMTS1的表達與其淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的結直腸癌其ADAMTS1的表達陽性率低于無淋巴結轉移者（χ2=5.329，P=0.021），而ADAMTS1的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理學類型、腫瘤大小、分化程度及TNM分期均無關（P＞0.05），見表 1。
表1
ADAMTS1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship between expression of ADAMTS1 and clinico-pathological features of colorectal cancer(case)
2.3 ADAMTS1表達與結直腸癌預后關系的單因素分析結果
高-中分化（χ2=4.452，P=0.035）、Ⅰ～Ⅱ期（χ2=14.356，P＜0.001）、無淋巴結轉移（χ2=8.200，P=0.004）和ADAMTS1表達陽性（χ2=10.151，P=0.001）的結直腸癌其中位生存時間分別高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移和ADAMTS1表達陰性者。而結直腸癌患者的預后與年齡、性別、腫瘤部位、病理學類型及腫瘤大小均無關（P＞0.05）。見表 2。
表2
結直腸癌預后影響因素的單因素分析結果
Table2.
Univariate analysis results on influence factor of prognosis in colorectal cancer
2.4 ADAMTS1表達與結直腸癌預后關系的多因素分析結果
將ADAMTS1的表達情況、性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、病理學類型、分化程度、TNM分期以及淋巴結轉移情況納入Cox比例風險模型進行多因素分析。結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移和ADAMTS1表達情況是結直腸癌患者預后的獨立影響因素（表 3），Ⅰ～Ⅱ期（RR=3.782，95% CI：1.509～9.476，P=0.005）、無淋巴結轉移（RR=3.107，95% CI：1.186～8.138，P=0.021）和ADAMTS1表達陽性者（RR=2.020，95% CI：1.071～3.809，P=0.030）的生存情況較好。
表3
結直腸癌預后影響因素的Cox比例風險模型結果
Table3.
Influence factors of prognosis in colorectal cancer by using Cox proportional hazard model
3 討論
ADAMTSs家族是一類新的Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族。研究[3, 9-10]表明，ADAMTSs家族通過與細胞外基質結合及活化生長因子，在細胞增殖、凋亡及腫瘤的發生、發展及轉移中均起重要作用。ADAMTS1是ADAMTSs家族的成員之一，研究[11]發現，ADAMTS1可以結合血管內皮生長因子165（VEGF165），導致VEGF不能激活其受體即血管內皮生長因子受體2（VEGFR2），從而抑制腫瘤的血管生成。它還可以特異性地抑制上皮細胞增生，阻滯成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）誘導的血管生成和VEGF誘導的血管生成，具有抗血管生成作用[12]。研究[13-15]報道，ADAMTS1在多種腫瘤（包括結直腸癌）中的表達下調，其表達下調的原因與基因啟動子的高甲基化密切相關[16]。ADAMTS1在乳腺癌中的表達下調，通過抑制ADAMTS1的表達能夠使VEGF的表達上調，從而促進乳腺腫瘤細胞的遷移和浸潤[17]。ADAMTS1高表達能夠促進乳腺癌細胞的肺轉移[18]，因此其被認為是一種腫瘤生長抑制因子，但目前對ADAMTS1在腫瘤局部侵襲和轉移中的作用機理尚有爭論。有研究[19]認為，ADAMTS1在宮頸癌中的表達上調；還有研究[14, 20]認為，在胰腺癌和乳腺癌中，ADAMTS1可以通過提高癌細胞的遷徙和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移。筆者[21]曾報道，ADAMTS1在胃癌原發灶中的表達水平明顯低于淋巴結轉移灶，且其表達與VEGF的表達呈負相關。因此，目前對ADAMTS1在腫瘤發生、發展及轉移中的確切作用機理還不十分明確。
本研究應用免疫組化染色方法檢測了結直腸癌組織及癌旁組織中ADAMTS1的表達，發現其在結直腸癌組織中的表達陽性率較低，提示其可能是一種腫瘤生長抑制因子。研究[14]表明，ADAMTS1高表達的胰腺癌患者其淋巴結轉移和腹膜后侵襲明顯增多。本組資料結果顯示，結直腸癌組織中ADAMTS1的表達與淋巴結轉移相關，無淋巴結轉移者的ADAMTS1表達陽性率較高。研究[22-24]認為，術前癌胚抗原（CEA）水平、腫瘤病理學類型、淋巴結轉移、腫瘤分期等是結直腸癌最重要的預后指標。本組資料多因素分析結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移結直腸癌患者的預后明顯差于Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結轉移者。有研究[25]報道，ADAMTS8高表達和ADMATS15低表達的乳腺癌患者具有較差的預后，表明此基因家族可能與乳腺癌的預后有關。此外，本組資料結果表明，ADAMTS1表達陽性者的預后明顯好于表達陰性者，提示ADAMTS1可能是預測結直腸癌預后的獨立指標之一。
綜上所述，ADAMTS1可能是一種腫瘤生長抑制因子，它可能與結直腸癌的發展及淋巴結轉移情況的關系更密切，也可能是預測結直腸癌預后的一種新指標。
