引用本文： 楊婷, 金松, 劉彥東. 糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞原代培養方法的改良. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(2): 173-176. doi: 10.7507/1007-9424.20140040 復制
近幾年糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加，引起了血管外科醫生對糖尿病患者慢性血管病變的高度重視，對糖尿病患者動脈平滑肌細胞的生物學特性的研究逐漸成為熱點。因此，提高糖尿病動脈平滑肌細胞體外培養的成活率和穩定性是關鍵。近年來，隨著細胞培養技術的發展，血管平滑肌細胞原代培養的成活率有了明顯提高[1-3]，但是眾多技術仍存在缺陷。我們在比較眾多培養方法[4-5]的情況下，對傳統酶消化法進行大膽改良，從取材方法到酶消化等許多方面進行了改良，結果證明改良的酶消化法簡單，經濟，成活率高，細胞傳代快，生長穩定，純度較高，現將該方法介紹如下。
1 材料與方法
1.1 糖尿病Wister大鼠模型制備
Wister大鼠，鼠齡8周，SPF級，由佳木斯大學實驗動物中心提供。糖尿病大鼠模型采用鏈脲佐菌素腹腔注射+高脂高糖食物飼養自制，一共20只。
1.2 主要試劑及儀器
①主要試劑：0.5%臺盼藍，一抗特異性鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（北京中山生物公司），DAB顯色劑，乙醚，不含鈣鎂磷酸鹽緩沖液（D-PBS），D-Hanks液等。②培養基：在DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）培養基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素，200目篩，一次性過濾除菌器除菌備用（4周內用完）。③酶消化液：0.5%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸· 4鈉（0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na），過濾除菌即用。④75%乙醇：用超純水配制。⑤器械及儀器：齒鑷，平鑷，組織剪，眼科剪，T25培養瓶，培養皿，體式解剖顯微鏡，倒置顯微鏡，細胞計數板，蓋玻片，超凈工作臺，1 mL、5 mL無菌注射器等。
1.3 改良酶消化法體外培養細胞
①糖尿病Wister大鼠用乙醚進行麻醉，待麻醉生效后，將糖尿病Wister大鼠全部浸入75%乙醇中消毒，消毒后在超凈工作臺中打開胸腔及腹腔，暴露心臟、胸主動脈和腹主動脈，止血。②在心臟跳動時，用5 mL注射器穿刺左心室，注入無菌D-PBS，沖洗。③仔細分離主動脈并剪斷，迅速移入無菌平皿，滴入D-Hanks浸過主動脈。④在體式解剖顯微鏡下完整去除血管外膜至血管光滑透明，用無菌棉簽輕輕擦去內膜，用培養液沖洗中膜。⑤將中膜置入另一有D-Hanks的培養皿中，用眼科剪將血管中膜快速剪成1.0 mm2大小組織塊，過200目篩，輕輕研磨，不斷用含15%的胎牛血清的培養液沖洗，直至剩下白色組織間質，取沖洗液，1 500 r/min（r=13.5 cm）離心5 min，棄上清，取沉淀。⑥往沉淀物中加入DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）5 mL，加入0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na消化30 s。⑦加入等體積DMEM培養基終止消化并1 500 r/min（r=13.5 cm）離心5 min，棄上清液，離心管中加入2 mL新鮮培養基重懸細胞，接種于T25培養瓶，常規靜置培養。⑧24 h后在倒置顯微鏡下觀察培養瓶情況，細胞是否處于成團狀態，若團塊較大，則重復⑥、⑦步驟，視情況分階梯重復酶消化直至全部成為單細胞。⑨48 h后觀察培養瓶是否有污染，培養液是否變黃等，如有需換新鮮培養液，靜置培養。于第7、8 d細胞生長達培養皿面積的85%左右時常規方法傳代。
1.4 細胞形態學觀察
原代及傳代培養時，采用倒置相差顯微鏡常規觀察細胞的生長形態，于72 h后按細胞懸液與0.5%臺盼藍溶液以9：1混合混勻（終濃度0.04%）后染色，用細胞計數板在倒置相差顯微鏡下進行細胞計數，計數3 min，分別計數活細胞和死細胞。鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。隨機計數6個視野，共計數600個細胞，計算活細胞率（%）=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100% [6]。
1.5 血管平滑肌細胞鑒定
細胞免疫化學鑒定血管平滑肌細胞[7]：制備單細胞懸液，鋪板，石蠟包埋，石蠟切片，脫蠟、脫水，蒸餾水沖洗，D-PBS浸泡5 min；3% H2O2室溫孵育5～10 min，D-PBS沖洗5 min，反復3次。5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，棄血清，滴加血管平滑肌細胞特異性鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（1：200），37℃孵育1～2 h，D-PBS沖洗5 min，反復3次，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG工作液（1：100），37℃孵育10～30 min；D-PBS沖洗5 min，反復3次，DAB顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，脫水透明，封固。用熒光顯微鏡觀察。
2 結果
2.1 血管平滑肌細胞體外生長情況
細胞于24 h時開始游離出（圖 1A）；48 h時呈放射狀生長（圖 1B），呈梭形；72 h時呈峰谷樣生長（圖 1C）。傳2代后細胞生長較快，呈典型的峰谷樣生長，細胞形態多呈寬大的長梭形，核大。細胞計數活細胞率達96%。
圖1
示培養不同時相后的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的生長情況（倒置相差顯微鏡×100）。1A：第24 h；1B：第48 h；1C：第72 h，呈峰谷樣生長??圖 2糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白染色結果（熒光顯微鏡×200）
Figure1.
Growth of vascular smooth muscle cells in diabetic rat at different time after culture (Inverted phase contrast microscope×100). 1A:At hour 24;1B:At hour 48;1C:At hour 72, exhibited typical "hill and valley" pattern ??Figure 2 Positiveα-SMA in vascular smooth muscle cells of diabetic rat (Fluorescence microscope×200)
2.2 體外培養的血管平滑肌細胞鑒定結果
細胞免疫化學檢測可見細胞形態不規則，胞漿內出現肌絲，具備平滑肌細胞特征；陽性細胞質內有大量淡藍色、與細胞長軸平行的纖維細絲，細胞核卵圓形居中，不著色。見圖 2。
3 討論
糖尿病血管并發癥是糖尿病患者的主要致殘、致死原因[8]。流行病學調查研究[9-10]表明，糖尿病患者發生心腦血管并發癥的危險性較非糖尿病患者增加34倍。血管平滑肌細胞是動脈壁的主要組成成分，在糖尿病血管并發癥的動脈粥樣硬化形成中起著關鍵作用，因此對血管平滑肌細胞的研究有著重要的意義。在過去的研究[11-15]中，均采用正常大鼠主動脈平滑肌細胞建立體外細胞培養模型，這些方式不能從根本上說明糖尿病血管平滑肌細胞病變的病理機制。本實驗首先將SPF級Wister大鼠成功建立糖尿病模型，再取其主動脈平滑肌細胞進行體外培養，成功培育出糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞。我們在長期的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞體外培養實驗中觀察到：糖尿病大鼠動脈平滑肌細胞與正常大鼠主動脈平滑肌細胞在形態學方面均不存在差異，但其生長速度明顯較正常大鼠快；正常大鼠的主動脈平滑肌細胞需要5～8 d從細胞團中游出，20 d左右才鋪滿培養瓶；而糖尿病大鼠的主動脈平滑肌細胞只需3～4 d即可從細胞團游中出，10 d左右可鋪滿培養瓶，說明糖尿病狀態下主動脈平滑肌細胞呈現異常增殖狀態，這可能與高血糖引起主動脈平滑肌細胞增殖過快[16]有關。
傳統的體外細胞原代培養方法[17-19]有兩種：第一種是酶消化法，將血管組織塊用適宜的酶消化后再行培養，因此方法除去了細胞間質，所以產量高，但是因其步驟繁瑣，易發生污染，材料消耗較多，適用于大塊組織的細胞培養；第二種是組織塊貼壁培養法，在活體時將組織取出，剪切成小塊，貼于瓶壁等待細胞從組織游離出，該法細胞生長慢且不是每塊都能長出細胞，成功率不高，適合組織量少的細胞培養，上述兩種均存在一定的弊端。
我們在長期的實驗中反復探索、對比針對糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞的特點，對傳統的酶消化方法進行大膽改良，建立了上述改良的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞體外原代培養方法，該實驗方法將傳統復雜的酶消化法進行簡化改良：即先在體式解剖顯微鏡下分離血管中膜，將組織塊過200目篩，隨后進行梯度酶消化，顯著降低血管組織的損失，減少對血管平滑肌細胞的損傷，減少操作污染的機會，使操作方法簡單易學，可重復性強，體外培養的細胞活力強、生長快、穩定。如果注意以下6項，可顯著提高細胞成活率：①無菌觀念。所用器械要嚴格按要求消毒滅菌，操作過程均無菌操作。②選鼠齡8周以上5個月以內成年大鼠，若鼠齡在5個月以上，作原代培養時細胞不易從組織塊中游出；若為幼鼠，大鼠在糖尿病造模后的喂養過程中極易衰竭而死。③用體式解剖顯微鏡除去外膜和內膜，因視野放大能去除干凈血管外膜和內膜。④時間控制。原代細胞培養中翻瓶時間以5～7 d為宜，前3 d一定要靜置培養，防止細胞團震蕩降低成功率。⑤掌握好酶消化時間，若為新鮮的胰酶，胰酶濃度不要超過0.5%，消化2 min或略長即可。⑥培養液和血清，選用DMEM高糖培養基，含L-谷氨酰胺，配制時要用新鮮燒制的三蒸水或超純水，嚴格調定pH值，最好使用以胎牛血清：新生牛血清=1：1比例混合血清。
在傳統的酶消化法基礎上進行改良，建立了良好、穩定的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞原代體外培養體系，適用于其外源性增殖、凋亡、死亡、變異、離子通道、基因層次以及其他形態學的研究，為今后糖尿病血管病變的研究和防治提供試驗基礎以及靶向治療的靶點。
近幾年糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加，引起了血管外科醫生對糖尿病患者慢性血管病變的高度重視，對糖尿病患者動脈平滑肌細胞的生物學特性的研究逐漸成為熱點。因此，提高糖尿病動脈平滑肌細胞體外培養的成活率和穩定性是關鍵。近年來，隨著細胞培養技術的發展，血管平滑肌細胞原代培養的成活率有了明顯提高[1-3]，但是眾多技術仍存在缺陷。我們在比較眾多培養方法[4-5]的情況下，對傳統酶消化法進行大膽改良，從取材方法到酶消化等許多方面進行了改良，結果證明改良的酶消化法簡單，經濟，成活率高，細胞傳代快，生長穩定，純度較高，現將該方法介紹如下。
1 材料與方法
1.1 糖尿病Wister大鼠模型制備
Wister大鼠，鼠齡8周，SPF級，由佳木斯大學實驗動物中心提供。糖尿病大鼠模型采用鏈脲佐菌素腹腔注射+高脂高糖食物飼養自制，一共20只。
1.2 主要試劑及儀器
①主要試劑：0.5%臺盼藍，一抗特異性鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（北京中山生物公司），DAB顯色劑，乙醚，不含鈣鎂磷酸鹽緩沖液（D-PBS），D-Hanks液等。②培養基：在DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）培養基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素，200目篩，一次性過濾除菌器除菌備用（4周內用完）。③酶消化液：0.5%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸· 4鈉（0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na），過濾除菌即用。④75%乙醇：用超純水配制。⑤器械及儀器：齒鑷，平鑷，組織剪，眼科剪，T25培養瓶，培養皿，體式解剖顯微鏡，倒置顯微鏡，細胞計數板，蓋玻片，超凈工作臺，1 mL、5 mL無菌注射器等。
1.3 改良酶消化法體外培養細胞
①糖尿病Wister大鼠用乙醚進行麻醉，待麻醉生效后，將糖尿病Wister大鼠全部浸入75%乙醇中消毒，消毒后在超凈工作臺中打開胸腔及腹腔，暴露心臟、胸主動脈和腹主動脈，止血。②在心臟跳動時，用5 mL注射器穿刺左心室，注入無菌D-PBS，沖洗。③仔細分離主動脈并剪斷，迅速移入無菌平皿，滴入D-Hanks浸過主動脈。④在體式解剖顯微鏡下完整去除血管外膜至血管光滑透明，用無菌棉簽輕輕擦去內膜，用培養液沖洗中膜。⑤將中膜置入另一有D-Hanks的培養皿中，用眼科剪將血管中膜快速剪成1.0 mm2大小組織塊，過200目篩，輕輕研磨，不斷用含15%的胎牛血清的培養液沖洗，直至剩下白色組織間質，取沖洗液，1 500 r/min（r=13.5 cm）離心5 min，棄上清，取沉淀。⑥往沉淀物中加入DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）5 mL，加入0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na消化30 s。⑦加入等體積DMEM培養基終止消化并1 500 r/min（r=13.5 cm）離心5 min，棄上清液，離心管中加入2 mL新鮮培養基重懸細胞，接種于T25培養瓶，常規靜置培養。⑧24 h后在倒置顯微鏡下觀察培養瓶情況，細胞是否處于成團狀態，若團塊較大，則重復⑥、⑦步驟，視情況分階梯重復酶消化直至全部成為單細胞。⑨48 h后觀察培養瓶是否有污染，培養液是否變黃等，如有需換新鮮培養液，靜置培養。于第7、8 d細胞生長達培養皿面積的85%左右時常規方法傳代。
1.4 細胞形態學觀察
原代及傳代培養時，采用倒置相差顯微鏡常規觀察細胞的生長形態，于72 h后按細胞懸液與0.5%臺盼藍溶液以9：1混合混勻（終濃度0.04%）后染色，用細胞計數板在倒置相差顯微鏡下進行細胞計數，計數3 min，分別計數活細胞和死細胞。鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。隨機計數6個視野，共計數600個細胞，計算活細胞率（%）=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100% [6]。
1.5 血管平滑肌細胞鑒定
細胞免疫化學鑒定血管平滑肌細胞[7]：制備單細胞懸液，鋪板，石蠟包埋，石蠟切片，脫蠟、脫水，蒸餾水沖洗，D-PBS浸泡5 min；3% H2O2室溫孵育5～10 min，D-PBS沖洗5 min，反復3次。5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，棄血清，滴加血管平滑肌細胞特異性鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（1：200），37℃孵育1～2 h，D-PBS沖洗5 min，反復3次，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG工作液（1：100），37℃孵育10～30 min；D-PBS沖洗5 min，反復3次，DAB顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，脫水透明，封固。用熒光顯微鏡觀察。
2 結果
2.1 血管平滑肌細胞體外生長情況
細胞于24 h時開始游離出（圖 1A）；48 h時呈放射狀生長（圖 1B），呈梭形；72 h時呈峰谷樣生長（圖 1C）。傳2代后細胞生長較快，呈典型的峰谷樣生長，細胞形態多呈寬大的長梭形，核大。細胞計數活細胞率達96%。
圖1
示培養不同時相后的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的生長情況（倒置相差顯微鏡×100）。1A：第24 h；1B：第48 h；1C：第72 h，呈峰谷樣生長??圖 2糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白染色結果（熒光顯微鏡×200）
Figure1.
Growth of vascular smooth muscle cells in diabetic rat at different time after culture (Inverted phase contrast microscope×100). 1A:At hour 24;1B:At hour 48;1C:At hour 72, exhibited typical "hill and valley" pattern ??Figure 2 Positiveα-SMA in vascular smooth muscle cells of diabetic rat (Fluorescence microscope×200)
2.2 體外培養的血管平滑肌細胞鑒定結果
細胞免疫化學檢測可見細胞形態不規則，胞漿內出現肌絲，具備平滑肌細胞特征；陽性細胞質內有大量淡藍色、與細胞長軸平行的纖維細絲，細胞核卵圓形居中，不著色。見圖 2。
3 討論
糖尿病血管并發癥是糖尿病患者的主要致殘、致死原因[8]。流行病學調查研究[9-10]表明，糖尿病患者發生心腦血管并發癥的危險性較非糖尿病患者增加34倍。血管平滑肌細胞是動脈壁的主要組成成分，在糖尿病血管并發癥的動脈粥樣硬化形成中起著關鍵作用，因此對血管平滑肌細胞的研究有著重要的意義。在過去的研究[11-15]中，均采用正常大鼠主動脈平滑肌細胞建立體外細胞培養模型，這些方式不能從根本上說明糖尿病血管平滑肌細胞病變的病理機制。本實驗首先將SPF級Wister大鼠成功建立糖尿病模型，再取其主動脈平滑肌細胞進行體外培養，成功培育出糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞。我們在長期的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞體外培養實驗中觀察到：糖尿病大鼠動脈平滑肌細胞與正常大鼠主動脈平滑肌細胞在形態學方面均不存在差異，但其生長速度明顯較正常大鼠快；正常大鼠的主動脈平滑肌細胞需要5～8 d從細胞團中游出，20 d左右才鋪滿培養瓶；而糖尿病大鼠的主動脈平滑肌細胞只需3～4 d即可從細胞團游中出，10 d左右可鋪滿培養瓶，說明糖尿病狀態下主動脈平滑肌細胞呈現異常增殖狀態，這可能與高血糖引起主動脈平滑肌細胞增殖過快[16]有關。
傳統的體外細胞原代培養方法[17-19]有兩種：第一種是酶消化法，將血管組織塊用適宜的酶消化后再行培養，因此方法除去了細胞間質，所以產量高，但是因其步驟繁瑣，易發生污染，材料消耗較多，適用于大塊組織的細胞培養；第二種是組織塊貼壁培養法，在活體時將組織取出，剪切成小塊，貼于瓶壁等待細胞從組織游離出，該法細胞生長慢且不是每塊都能長出細胞，成功率不高，適合組織量少的細胞培養，上述兩種均存在一定的弊端。
我們在長期的實驗中反復探索、對比針對糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞的特點，對傳統的酶消化方法進行大膽改良，建立了上述改良的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞體外原代培養方法，該實驗方法將傳統復雜的酶消化法進行簡化改良：即先在體式解剖顯微鏡下分離血管中膜，將組織塊過200目篩，隨后進行梯度酶消化，顯著降低血管組織的損失，減少對血管平滑肌細胞的損傷，減少操作污染的機會，使操作方法簡單易學，可重復性強，體外培養的細胞活力強、生長快、穩定。如果注意以下6項，可顯著提高細胞成活率：①無菌觀念。所用器械要嚴格按要求消毒滅菌，操作過程均無菌操作。②選鼠齡8周以上5個月以內成年大鼠，若鼠齡在5個月以上，作原代培養時細胞不易從組織塊中游出；若為幼鼠，大鼠在糖尿病造模后的喂養過程中極易衰竭而死。③用體式解剖顯微鏡除去外膜和內膜，因視野放大能去除干凈血管外膜和內膜。④時間控制。原代細胞培養中翻瓶時間以5～7 d為宜，前3 d一定要靜置培養，防止細胞團震蕩降低成功率。⑤掌握好酶消化時間，若為新鮮的胰酶，胰酶濃度不要超過0.5%，消化2 min或略長即可。⑥培養液和血清，選用DMEM高糖培養基，含L-谷氨酰胺，配制時要用新鮮燒制的三蒸水或超純水，嚴格調定pH值，最好使用以胎牛血清：新生牛血清=1：1比例混合血清。
在傳統的酶消化法基礎上進行改良，建立了良好、穩定的糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞原代體外培養體系，適用于其外源性增殖、凋亡、死亡、變異、離子通道、基因層次以及其他形態學的研究，為今后糖尿病血管病變的研究和防治提供試驗基礎以及靶向治療的靶點。
