引用本文： 徐興偉, 丁博文, 朱傳榮, 鄭鵬, 馮濤, 嵇武. miRNA-155/PU.1信號通路阻滯對大鼠骨髓來源樹突狀細胞成熟及移植免疫的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(2): 168-172. doi: 10.7507/1007-9424.20140039 復制
樹突狀細胞（DCs）作為主要抗原提呈細胞，刺激初始T淋巴細胞增殖，在調節適應性免疫反應中扮演重要的角色。研究[1]表明，DCs誘導或抑制免疫反應與細胞成熟度和細胞表面亞型的表達有關。未成熟DCs提呈抗原能力較弱，在于其低表達主要組織相容性復合體（MHC）-Ⅱ類分子和共刺激分子，如CD80、CD86和CD40。DCs在成熟和發揮作用過程中，受到多種microRNA的調控，而其中miR-155對DCs的免疫反應有深遠的影響，miR-155可以抑制DCs主要分子的表達，如抗原提呈、T淋巴細胞活化及組成T淋巴細胞介導的免疫應答抑制性通路。最近的研究[2]認為，PU.1是DCs的主要調控子，雖然大量的轉錄因子參與了特異DCs的分化，但已經證實PU.1是所有DCs亞群都必需的單個核心轉錄因子。因此在本研究中，我們使用小干擾RNA（siRNA）沉默miRNA-155/PU.1信號通路的關鍵轉錄因子PU.1表達，抑制大鼠骨髓DCs的成熟，得到一種相對穩定的半成熟DCs，探索它們的免疫耐受功能及對大鼠小腸移植的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
F344大鼠和Wistar大鼠，雄性，體質量180～220 g，均購自維通利華公司（北京，中國）。飼養在南京軍區南京總醫院比較醫學科SPF環境。動物實驗經南京軍區南京總醫院倫理委員會批準及監管。
1.2 主要材料與儀器
細胞培養基RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術公司；重組粒-巨細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）及重組白細胞介素（IL）-4（rrIL-4）購自Peprotech公司；藻紅蛋白（PE）標記的抗大鼠CD86、抗大鼠CD80和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗MHC-Ⅱ類購自eBioscience公司；Western blotting抗體（HRP標記的羊抗鼠和兔抗羊抗體）購自美國Santa Cruz公司；大鼠IL-12（IL-12p70）及IL-10購自RD公司；37 kBq [3H]胸腺嘧啶購自Woodbridge公司；S-3400N掃描電子顯微鏡（日立公司，日本）；FACSVantage流式細胞儀（Becton-Dickinson公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 骨髓來源未成熟DCs的體外培養
根據Lutz等[3]和Yang等[4]的方法進行改進，將處死的F344大鼠的股骨和脛骨在無菌條件下取出，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗骨髓腔3次得到骨髓細胞液。1 000×g離心5 min，用0.15 mol/L的NH4Cl洗滌2次去除紅細胞。將收獲的細胞按密度4×106個/mL培養在6孔板中，并加入含5 ng/mL rmGM-CSF、5 ng/mL rrIL-4和10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液。培養4 h后，除去非貼壁細胞繼續培養。從第3 d起，隔天半換液。在第7 d，收獲非貼壁和疏松附著的細胞即為未成熟DCs用于細胞轉染。上清液用于后續細胞因子的鑒定。
1.3.2 脂質體法轉染細胞
收獲上述細胞，由上海吉瑪公司設計含有特定目標的正義、反義序列的PU.1 siRNA。轉染使用美國Invitrogen公司lipo2000瞬時轉染24 h。篩選得到的高沉默效率PU.1特定的siRNA序列如下：正義鏈為5′-AGCGAUCACU-AUUGGGAUUTT-3′，反義鏈為5′-AAUCCCAAUA-GUGAUCGCUTT-3′；陰性對照siRNA序列如下：正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉染完成后將不同DCs與10μg/mL的LPS等密度共培養48 h。收集細胞和上清液備用。將DCs分為3組：PU.1沉默-LPS-DCs組（簡稱PU.1沉默組）、陰性對照-LPS-DCs組（簡稱陰性對照組）和未成熟即沒有轉染或其他處理DCs（簡稱對照組）。
1.3.3 Western blotting法檢測轉染效率
上述3組細胞在RIPA裂解緩沖液勻漿后用于蛋白質印跡檢測。等量的蛋白提取物與SDS-緩沖液共煮沸5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到硝酸纖維素膜。牛血清白蛋白室溫下封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜。第2 d繼續羊抗兔二抗（1：2 000稀釋）孵育。洗膜后使用ECL信號檢測試劑盒（Amersham公司，美國）檢測目的蛋白，與內參照進行灰度比較以半定量分析。
1.3.4 用流式細胞學方法檢測DCs表面特異標志分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ
經過7 d培養制備的3組細胞，調整細胞濃度為2×106個/mL，加入1μg的MHC-Ⅱ、CD86及CD80分別染色，遮光4℃孵育30 min，洗滌后加入PBS，樣品上機進行表型分析。觀察各組細胞表面分子的表達情況。
1.3.5 混合淋巴細胞反應
參照文獻[5]，密度梯度離心法得到大鼠同種異體脾臟T淋巴細胞（2×105個/孔）分別與3種實驗細胞（2×104個/孔）按不同比率接種于96孔板。細胞培養3 d，最后18 h加入37 kBq [3H]胸腺嘧啶。隨后將細胞收獲到玻璃纖維濾膜上，用液體閃爍計數器進行放射性定量。結果以[3H]胸腺嘧啶吸收量描述曲線。
1.3.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞因子IL-12p70和IL-10
取各組的細胞培養上清液測量細胞因子IL-12p70和IL-10，按試劑盒說明書操作。通過標準曲線計算各細胞因子濃度。
1.3.7 大鼠異位小腸移植模型建立和實驗干預
健康F344和Wistar大鼠各18只分別作為供體和受體，SPF級雌雄不限，體質量220～280 g，平均248.4 g，6～7周齡，由南京軍區南京總醫院醫學實驗動物中心提供。用隨機數字表法隨機分為3組，每組6對行異位小腸移植。分別在小腸移植術前7 d經受體尾靜脈注射3組細胞（PU.1沉默組、陰性對照組及對照組）。手術采用動脈吻合加靜脈套管法進行大鼠異位小腸移植。術后5 d取近端空腸5 cm進行HE染色，并觀察形態學變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行統計處理。計量數據采用均數±標準差表示，組內分析采用單向方差分析（ANOVA），檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PU.1沉默DCs的特性
陰性對照組CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達分別為（74.0±9.4）%、（76.5±8.7）%及（87.8±11.3）%，符合成熟DCs高表達特征[3]；對照組CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達分別為（6.7±0.6）%、（7.4±1.8）%及（6.8±1.0）%，符合未成熟DCs的低表達特征；PU.1沉默組CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達分別為（27.0±5.6）%、（23.6±4.8）%及（36.8±6.8）%，均明顯低于陰性對照組（P < 0.05）。
2.2 PU.1沉默DCs混合淋巴細胞反應結果
PU.1沉默組在刺激增殖T淋巴細胞的混合淋巴細胞反應中較陰性對照組明顯降低（P < 0.05），與對照組類似，表明PU.1沉默DCs刺激T細胞增殖的能力受損，基本不具有這樣的特性，見圖 1。
圖1
3組細胞刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力
Figure1.
Ability of DCs in each group suppress allogeneic T cell proli-feration
2.3 PU.1沉默DCs細胞因子的表達結果
3組DCs的細胞培養上清液中IL-12p70和IL-10的表達見表 1。作為對DCs成熟發揮重要功能的細胞因子IL-12p70促進DC成熟而IL-10則起抑制作用。代表成熟抑制的PU.1沉默組分泌IL-10較代表成熟的陰性對照組明顯升高（P < 0.05），IL-12p70則明顯降低（P < 0.05）。對照組細胞雖和PU.1沉默組相比未達到統計學差異，也表現出輕度成熟抑制。說明細胞表面分子表達的差異決定了其功能的不同。
表1
3組細胞因子的表達（ng/L，2.4 PU.1沉默的DCs延長移植物功能
3組細胞注入待小腸移植的受體后，受體存活時間陰性對照組為（7.8±1.5）d，對照組為（8.0±2.5）d，PU.1沉默組為（14.3±3.3）d，PU.1沉默組的生存時間明顯長于陰性對照組（P < 0.05）和對照組（P < 0.05）。移植小腸的HE染色結果顯示，PU.1沉默組術后5 d時移植物病理顯示移植腸組織輕度淋巴細胞浸潤和絨毛水腫（圖 2A），而陰性對照組和對照組未成熟DCs均有炎癥細胞浸潤，少部分絨毛融合、脫落及缺損（圖 2B、2C）。
圖2
各組受體大鼠移植小腸病理表現（HE ×100）。2A：PU.1沉默組；2B：陰性對照組；2C：對照組
Figure2.
Histopathology of intestinal allograft from recipient rats in each group (HE ×100). 2A:PU.1 silent group; 2B:Negative control group; 2C:Control group
3 討論
近年來，越來越多的研究關注器官移植中固有免疫系統對適應性免疫的作用。已有研究表明，輸注供者未成熟DCs可以延長移植物存活時間[6]，主要在于它們能通過誘導T淋巴細胞無反應性或凋亡介導免疫耐受[7-8]。器官移植后，最常見的急性排斥反應主要由T淋巴細胞介導，而它們需要抗原提呈細胞提呈第一、第二活化信號才能激活，從而發揮免疫作用。未成熟DCs低表達MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，阻斷幼稚T淋巴細胞的信號提呈，導致調節適應性免疫不能激活。然而他們并不穩定，可以通過多條信號通路很容易地轉變成成熟DCs，因此限制了這類細胞的保存和利用[9]。Yang等[4]發現，通過沉默核因子（NF）-κB信號通路中的MyD88，可以有效干擾未成熟DCs的成熟，增加免疫抑制型細胞因子IL-10的分泌，并降低IL-12p70。本實驗經檢測，代表成熟抑制的PU.1沉默組DCs較陰性對照組中成熟的DCs分泌IL-10明顯升高，表明PU.1基因的沉默阻止了DCs的成熟路徑。IL-10又稱細胞因子分泌抑制因子，是體內重要的免疫負調控分子，可通過下調主要組織相容性抗原、共刺激分子、抑制多種炎性細胞因子的分泌而誘導DCs耐受及誘導調節性T淋巴細胞的生成，直接或間接抑制異基因淋巴細胞的活化[9]。而IL-12p70是活化T淋巴細胞的重要信號，也是T淋巴細胞活化的標志。NF-κB信號通路在DCs成熟中起關鍵的作用，IL-10可以表達協同刺激分子B7-H，下調一系列炎性細胞因子的合成，并抑制同種異體T淋巴細胞增殖。因此，這些研究提示我們，沉默DCs成熟信號通路中的關鍵因子可能有助于獲得期待的免疫抑制功能和更好的穩定性。
miRNA-155在免疫反應中是一個重要的調節因子[10]。miRNA-155基因敲除的小鼠表現出異常的免疫功能，包括有缺陷的B和T淋巴細胞功能、免疫異常的抗原提呈細胞以及高親和力的IgG1抗體的生成缺陷[11-12]，這些都與作用于3′-非編碼區的轉錄因子PU.1有關[13-14]。PU.1在cDC和pDC譜系都是必不可少的調節因子，它可以調節髓系和淋巴系的大多數基因[15]。最近的研究[16-17]還表明，PU.1部分調控細胞因子受體FLT3，并能通過DC-SIGN的調節參與DCs的成熟。因此，PU.1在DCs成熟中是一個關鍵調控因子[16, 18]，選擇該基因作為目的沉默基因可能使細胞成熟抑制[19]。我們通過siRNA沉默基因，并與LPS共培養后，得到的這種DCs具有體內外免疫抑制的效果。這類半成熟DCs更穩定，能更大程度減少小腸移植后的炎癥反應和免疫反應。
在本實驗中，受體小腸移植大鼠的術后存活時間和移植腸的病理學變化作為測試PU.1沉默的DCs體內免疫抑制功能指標，與另兩組相比，PU.1沉默組大鼠移植小腸的排斥反應有明顯緩解，且整體生存時間延長和生存質量提高，這些結果和前期體外實驗表現一致：增加IL-10和減少IL-12p70的分泌，表面分子CD86、CD80低表達和抑制T淋巴細胞增殖，表明體內實驗延續了DCs成熟抑制的表現，克服了對照組DCs在體內易于受刺激而誘導成熟的缺點。IL-10的增加在未成熟DCs的功能表現中發揮核心作用[20]。既往研究[4]發現，未成熟DCs注入受體后血清中促炎癥因子IL-2和干擾素-γ的水平明顯降低，IL-10增高，減輕了受體對移植物的排斥反應，從而誘導免疫耐受。本實驗中PU.1沉默的DCs在將細胞注入受體體內后，PU.1沉默的DCs具有明顯的穩定性，得到更高的IL-10水平，繼續保持其免疫抑制，而未成熟DCs則極易受刺激誘導，失去其原有特性。
本實驗證實了PU.1基因沉默的DCs成熟度和誘導免疫功能均減弱，并延長了大鼠小腸移植受體的生存時間，改善了移植物的功能，這為移植免疫的研究提供了新思路。
樹突狀細胞（DCs）作為主要抗原提呈細胞，刺激初始T淋巴細胞增殖，在調節適應性免疫反應中扮演重要的角色。研究[1]表明，DCs誘導或抑制免疫反應與細胞成熟度和細胞表面亞型的表達有關。未成熟DCs提呈抗原能力較弱，在于其低表達主要組織相容性復合體（MHC）-Ⅱ類分子和共刺激分子，如CD80、CD86和CD40。DCs在成熟和發揮作用過程中，受到多種microRNA的調控，而其中miR-155對DCs的免疫反應有深遠的影響，miR-155可以抑制DCs主要分子的表達，如抗原提呈、T淋巴細胞活化及組成T淋巴細胞介導的免疫應答抑制性通路。最近的研究[2]認為，PU.1是DCs的主要調控子，雖然大量的轉錄因子參與了特異DCs的分化，但已經證實PU.1是所有DCs亞群都必需的單個核心轉錄因子。因此在本研究中，我們使用小干擾RNA（siRNA）沉默miRNA-155/PU.1信號通路的關鍵轉錄因子PU.1表達，抑制大鼠骨髓DCs的成熟，得到一種相對穩定的半成熟DCs，探索它們的免疫耐受功能及對大鼠小腸移植的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
F344大鼠和Wistar大鼠，雄性，體質量180～220 g，均購自維通利華公司（北京，中國）。飼養在南京軍區南京總醫院比較醫學科SPF環境。動物實驗經南京軍區南京總醫院倫理委員會批準及監管。
1.2 主要材料與儀器
細胞培養基RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術公司；重組粒-巨細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）及重組白細胞介素（IL）-4（rrIL-4）購自Peprotech公司；藻紅蛋白（PE）標記的抗大鼠CD86、抗大鼠CD80和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗MHC-Ⅱ類購自eBioscience公司；Western blotting抗體（HRP標記的羊抗鼠和兔抗羊抗體）購自美國Santa Cruz公司；大鼠IL-12（IL-12p70）及IL-10購自RD公司；37 kBq [3H]胸腺嘧啶購自Woodbridge公司；S-3400N掃描電子顯微鏡（日立公司，日本）；FACSVantage流式細胞儀（Becton-Dickinson公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 骨髓來源未成熟DCs的體外培養
根據Lutz等[3]和Yang等[4]的方法進行改進，將處死的F344大鼠的股骨和脛骨在無菌條件下取出，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗骨髓腔3次得到骨髓細胞液。1 000×g離心5 min，用0.15 mol/L的NH4Cl洗滌2次去除紅細胞。將收獲的細胞按密度4×106個/mL培養在6孔板中，并加入含5 ng/mL rmGM-CSF、5 ng/mL rrIL-4和10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液。培養4 h后，除去非貼壁細胞繼續培養。從第3 d起，隔天半換液。在第7 d，收獲非貼壁和疏松附著的細胞即為未成熟DCs用于細胞轉染。上清液用于后續細胞因子的鑒定。
1.3.2 脂質體法轉染細胞
收獲上述細胞，由上海吉瑪公司設計含有特定目標的正義、反義序列的PU.1 siRNA。轉染使用美國Invitrogen公司lipo2000瞬時轉染24 h。篩選得到的高沉默效率PU.1特定的siRNA序列如下：正義鏈為5′-AGCGAUCACU-AUUGGGAUUTT-3′，反義鏈為5′-AAUCCCAAUA-GUGAUCGCUTT-3′；陰性對照siRNA序列如下：正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉染完成后將不同DCs與10μg/mL的LPS等密度共培養48 h。收集細胞和上清液備用。將DCs分為3組：PU.1沉默-LPS-DCs組（簡稱PU.1沉默組）、陰性對照-LPS-DCs組（簡稱陰性對照組）和未成熟即沒有轉染或其他處理DCs（簡稱對照組）。
1.3.3 Western blotting法檢測轉染效率
上述3組細胞在RIPA裂解緩沖液勻漿后用于蛋白質印跡檢測。等量的蛋白提取物與SDS-緩沖液共煮沸5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到硝酸纖維素膜。牛血清白蛋白室溫下封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜。第2 d繼續羊抗兔二抗（1：2 000稀釋）孵育。洗膜后使用ECL信號檢測試劑盒（Amersham公司，美國）檢測目的蛋白，與內參照進行灰度比較以半定量分析。
1.3.4 用流式細胞學方法檢測DCs表面特異標志分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ
經過7 d培養制備的3組細胞，調整細胞濃度為2×106個/mL，加入1μg的MHC-Ⅱ、CD86及CD80分別染色，遮光4℃孵育30 min，洗滌后加入PBS，樣品上機進行表型分析。觀察各組細胞表面分子的表達情況。
1.3.5 混合淋巴細胞反應
參照文獻[5]，密度梯度離心法得到大鼠同種異體脾臟T淋巴細胞（2×105個/孔）分別與3種實驗細胞（2×104個/孔）按不同比率接種于96孔板。細胞培養3 d，最后18 h加入37 kBq [3H]胸腺嘧啶。隨后將細胞收獲到玻璃纖維濾膜上，用液體閃爍計數器進行放射性定量。結果以[3H]胸腺嘧啶吸收量描述曲線。
1.3.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞因子IL-12p70和IL-10
取各組的細胞培養上清液測量細胞因子IL-12p70和IL-10，按試劑盒說明書操作。通過標準曲線計算各細胞因子濃度。
1.3.7 大鼠異位小腸移植模型建立和實驗干預
健康F344和Wistar大鼠各18只分別作為供體和受體，SPF級雌雄不限，體質量220～280 g，平均248.4 g，6～7周齡，由南京軍區南京總醫院醫學實驗動物中心提供。用隨機數字表法隨機分為3組，每組6對行異位小腸移植。分別在小腸移植術前7 d經受體尾靜脈注射3組細胞（PU.1沉默組、陰性對照組及對照組）。手術采用動脈吻合加靜脈套管法進行大鼠異位小腸移植。術后5 d取近端空腸5 cm進行HE染色，并觀察形態學變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行統計處理。計量數據采用均數±標準差表示，組內分析采用單向方差分析（ANOVA），檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PU.1沉默DCs的特性
陰性對照組CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達分別為（74.0±9.4）%、（76.5±8.7）%及（87.8±11.3）%，符合成熟DCs高表達特征[3]；對照組CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達分別為（6.7±0.6）%、（7.4±1.8）%及（6.8±1.0）%，符合未成熟DCs的低表達特征；PU.1沉默組CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達分別為（27.0±5.6）%、（23.6±4.8）%及（36.8±6.8）%，均明顯低于陰性對照組（P < 0.05）。
2.2 PU.1沉默DCs混合淋巴細胞反應結果
PU.1沉默組在刺激增殖T淋巴細胞的混合淋巴細胞反應中較陰性對照組明顯降低（P < 0.05），與對照組類似，表明PU.1沉默DCs刺激T細胞增殖的能力受損，基本不具有這樣的特性，見圖 1。
圖1
3組細胞刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力
Figure1.
Ability of DCs in each group suppress allogeneic T cell proli-feration
2.3 PU.1沉默DCs細胞因子的表達結果
3組DCs的細胞培養上清液中IL-12p70和IL-10的表達見表 1。作為對DCs成熟發揮重要功能的細胞因子IL-12p70促進DC成熟而IL-10則起抑制作用。代表成熟抑制的PU.1沉默組分泌IL-10較代表成熟的陰性對照組明顯升高（P < 0.05），IL-12p70則明顯降低（P < 0.05）。對照組細胞雖和PU.1沉默組相比未達到統計學差異，也表現出輕度成熟抑制。說明細胞表面分子表達的差異決定了其功能的不同。
表1
3組細胞因子的表達（ng/L，2.4 PU.1沉默的DCs延長移植物功能
3組細胞注入待小腸移植的受體后，受體存活時間陰性對照組為（7.8±1.5）d，對照組為（8.0±2.5）d，PU.1沉默組為（14.3±3.3）d，PU.1沉默組的生存時間明顯長于陰性對照組（P < 0.05）和對照組（P < 0.05）。移植小腸的HE染色結果顯示，PU.1沉默組術后5 d時移植物病理顯示移植腸組織輕度淋巴細胞浸潤和絨毛水腫（圖 2A），而陰性對照組和對照組未成熟DCs均有炎癥細胞浸潤，少部分絨毛融合、脫落及缺損（圖 2B、2C）。
圖2
各組受體大鼠移植小腸病理表現（HE ×100）。2A：PU.1沉默組；2B：陰性對照組；2C：對照組
Figure2.
Histopathology of intestinal allograft from recipient rats in each group (HE ×100). 2A:PU.1 silent group; 2B:Negative control group; 2C:Control group
3 討論
近年來，越來越多的研究關注器官移植中固有免疫系統對適應性免疫的作用。已有研究表明，輸注供者未成熟DCs可以延長移植物存活時間[6]，主要在于它們能通過誘導T淋巴細胞無反應性或凋亡介導免疫耐受[7-8]。器官移植后，最常見的急性排斥反應主要由T淋巴細胞介導，而它們需要抗原提呈細胞提呈第一、第二活化信號才能激活，從而發揮免疫作用。未成熟DCs低表達MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，阻斷幼稚T淋巴細胞的信號提呈，導致調節適應性免疫不能激活。然而他們并不穩定，可以通過多條信號通路很容易地轉變成成熟DCs，因此限制了這類細胞的保存和利用[9]。Yang等[4]發現，通過沉默核因子（NF）-κB信號通路中的MyD88，可以有效干擾未成熟DCs的成熟，增加免疫抑制型細胞因子IL-10的分泌，并降低IL-12p70。本實驗經檢測，代表成熟抑制的PU.1沉默組DCs較陰性對照組中成熟的DCs分泌IL-10明顯升高，表明PU.1基因的沉默阻止了DCs的成熟路徑。IL-10又稱細胞因子分泌抑制因子，是體內重要的免疫負調控分子，可通過下調主要組織相容性抗原、共刺激分子、抑制多種炎性細胞因子的分泌而誘導DCs耐受及誘導調節性T淋巴細胞的生成，直接或間接抑制異基因淋巴細胞的活化[9]。而IL-12p70是活化T淋巴細胞的重要信號，也是T淋巴細胞活化的標志。NF-κB信號通路在DCs成熟中起關鍵的作用，IL-10可以表達協同刺激分子B7-H，下調一系列炎性細胞因子的合成，并抑制同種異體T淋巴細胞增殖。因此，這些研究提示我們，沉默DCs成熟信號通路中的關鍵因子可能有助于獲得期待的免疫抑制功能和更好的穩定性。
miRNA-155在免疫反應中是一個重要的調節因子[10]。miRNA-155基因敲除的小鼠表現出異常的免疫功能，包括有缺陷的B和T淋巴細胞功能、免疫異常的抗原提呈細胞以及高親和力的IgG1抗體的生成缺陷[11-12]，這些都與作用于3′-非編碼區的轉錄因子PU.1有關[13-14]。PU.1在cDC和pDC譜系都是必不可少的調節因子，它可以調節髓系和淋巴系的大多數基因[15]。最近的研究[16-17]還表明，PU.1部分調控細胞因子受體FLT3，并能通過DC-SIGN的調節參與DCs的成熟。因此，PU.1在DCs成熟中是一個關鍵調控因子[16, 18]，選擇該基因作為目的沉默基因可能使細胞成熟抑制[19]。我們通過siRNA沉默基因，并與LPS共培養后，得到的這種DCs具有體內外免疫抑制的效果。這類半成熟DCs更穩定，能更大程度減少小腸移植后的炎癥反應和免疫反應。
在本實驗中，受體小腸移植大鼠的術后存活時間和移植腸的病理學變化作為測試PU.1沉默的DCs體內免疫抑制功能指標，與另兩組相比，PU.1沉默組大鼠移植小腸的排斥反應有明顯緩解，且整體生存時間延長和生存質量提高，這些結果和前期體外實驗表現一致：增加IL-10和減少IL-12p70的分泌，表面分子CD86、CD80低表達和抑制T淋巴細胞增殖，表明體內實驗延續了DCs成熟抑制的表現，克服了對照組DCs在體內易于受刺激而誘導成熟的缺點。IL-10的增加在未成熟DCs的功能表現中發揮核心作用[20]。既往研究[4]發現，未成熟DCs注入受體后血清中促炎癥因子IL-2和干擾素-γ的水平明顯降低，IL-10增高，減輕了受體對移植物的排斥反應，從而誘導免疫耐受。本實驗中PU.1沉默的DCs在將細胞注入受體體內后，PU.1沉默的DCs具有明顯的穩定性，得到更高的IL-10水平，繼續保持其免疫抑制，而未成熟DCs則極易受刺激誘導，失去其原有特性。
本實驗證實了PU.1基因沉默的DCs成熟度和誘導免疫功能均減弱，并延長了大鼠小腸移植受體的生存時間，改善了移植物的功能，這為移植免疫的研究提供了新思路。
