心傳導系統（cardiac conduction system，CCS）是一套能自發地產生并傳導沖動的特化心肌通路，沖動經CCS傳導至整個心臟引發心臟各部分的協調收縮。充分認識CCS在心臟中的解剖特點是研究心臟電生理及治療傳導相關疾病的基礎，同時也是心臟外科手術避免損傷CCS的關鍵。如何識別和定位CCS歷來都是研究熱門的話題。在這里，我們回顧了CCS組織學顯像的方法及其特異性分子靶點和歷來對于CCS定位及可視化的探索，并著重探討近年來出現的CCS的非破壞性成像技術及手術實時定位方法的臨床應用前景及未來發展方向。
心臟沖動的產生及傳導由特化的心肌組織—心傳導系統（cardiac conduction system, CCS）參與。心臟傳導細胞具有自律性，能自發且有節律地產生沖動，其中以竇房結（sinoatrial node，SAN）自律性最強，在傳導系統中起主導作用。沖動首先在SAN自發產生，沖動在向下傳導的過程中，出現任何擾動都有可能誘發嚴重的心律失常。盡管心律失常的發病率及死亡率占人群心血管病事件中的比重并不低，但一些心律失常的病理生理學機制卻尚存爭議。研究CCS在心臟中的解剖結構是研究心臟電生理及傳導相關疾病的基礎。外科手術過程中的縫合、夾持或牽拉等對CCS的直接損傷是術后發生暫時或永久傳導阻滯的重要原因[1]，正確識別判斷CCS，避免其損傷可以有效降低術后傳導阻滯的發病率。
人們對CCS結構的認識經歷了一個漫長的過程，相較于同樣起著傳導電沖動功能的外周神經，CCS體積細小，且包裹在周圍的纖維結締組織鞘不豐富，僅憑肉眼難以識別辨認。依靠一些重要的解剖學標志定位CCS是目前心臟外科醫生避免CCS損傷的基本手段。但CCS往往存在一定的變異性，尤其在先天性心臟病（先心病）患者人群中，越為復雜的畸形其變異度越大。這些變異增大了傳統定位方法的不確定性，CCS定位困難使得術中損傷的可能性大大增加，這體現在越為復雜的先心病矯治手術，術后傳導阻滯的發病率越高，從簡單畸形的3%～6%，到復雜畸形的>20%[2-4]。嚴重的傳導阻滯需植入埋藏式起搏器以維持正常心律，為患者帶來額外的醫療負擔、降低生活質量甚至影響預后。
如何識別和定位CCS歷來都是研究熱門的話題。將肉眼不可見的CCS可視化是最為直接的辦法。在此我們回顧了CCS組織學顯像的方法及其特異性分子靶點和歷來對于CCS定位及可視化的探索，并著重探討近年來出現的CCS的非破壞性成像技術及手術實時定位方法的臨床應用前景及未來發展方向。
1 心臟傳導系統的解剖定位及變異
在大多數脊椎動物中，在心房及心室入口處都可以分別觀察到一個產生沖動的起搏組織（pacemaker tissue）和另一個類-起搏組織（pacemaker-like tissue）—在哺乳動物中能更清楚地從形態學上被劃分為SAN和房室結（atrioventricular node，AVN）；而除鱷魚外的變溫動物則不具有房室束、束支及浦肯野纖維這類特殊的房室傳導系統[5]。對于人類心臟，目前的普遍共識是CCS由SAN、AVN、房室束、左右束支及終末的浦肯野纖維構成。隨著對CCS結構了解的深入，研究者們還發現了與AVN相連且有別于工作心肌細胞的其他組成部分—房室環及主動脈后結[6]等，因其有與傳導細胞高度相似的表達特點，被認為可能是CCS傳導的一部分，且可能與某些心律失常形成機制有關[6-7]。
SAN是心臟的正常起搏點，位于上腔靜脈與右心房界嵴的交界處，SAN的自動去極化是心臟能自發收縮的基礎。SAN主體位于上腔靜脈與右心房交界的終溝處[8-9]，并由寬變窄向下腔靜脈方向延伸，同時向四周投射組織至界嵴、終溝、梳狀肌及房間隔[10]。房室傳導軸（AV conduction axis）由AVN、房室束( atrioventricular bundle，AVB)、左右束支(bundle branch，BB)構成，是正常情況下連接心房與心室電傳導的唯一通道。AVN位于Koch三角內。AVB起源自AVN前端，分為穿透部和分支部，穿透部在中心纖維體中穿行，向前向下延伸到主動脈無冠竇水平時穿出中心纖維體，然后從無冠竇和右冠狀脈竇之間的AVB段（即分支部）上發出細小纖維形成扁平帶狀的左束支（LBB），未參與分散的纖維繼續向下延續形成右束支（RBB）[11]。LBB發出后，在室間隔左側心內膜下走形并再次分支，大致分為兩簇：前簇主要掃過左室流出道區域并深入前乳頭肌；后簇轉向左室后部并深入后乳頭肌[11-12]。右束支在右側室間隔心肌層內穿行一段距離后淺出至右側心內膜深面，并向前下方走行，經隔緣肉柱至前乳頭肌根部，分支分布于右心室壁[12]。左右束支各級分支最終形成心肌內的浦肯野纖維網（Purkinje fiber，PF）。房室環（atrioventricular ring）及主動脈后結（retroaortic node）是近年來發現的CCS的另一成分，在人類和一些動物中均能觀察到[13-15]。房室環由AVN向右下及左下分別發出延伸支并包繞在三尖瓣及二尖瓣周圍形成，即右房室環和左房室環；右側延伸支跨過AVB上方區域和左側延伸支在主動根后方相連續并膨大形成主動脈后結[6]。其功能尚存在爭議，可能參與了房室折返型心律失常的形成[6] 。Atkinson等[7]證實右房室環具有異位起搏點能力，并推測該結構可能是房性心動過速的來源。
前人大量的CCS組織學研究結果為CCS的定位奠定了解剖學基礎，盡管不能肉眼直接識別，但根據一些解剖學標志判斷CCS位置是心臟外科手術避免損傷傳導系統的通行方法。SAN位于上腔靜脈與右心房的交界區，周圍無纖維包鞘，肉眼難以識別，但有時SAN心外膜面會覆蓋一層脂肪墊，或因該區域結締組織豐富而在心外膜面呈現為一白色斑塊[16]，據此也可大致推斷其方位。AVN的解剖學定位標志則為上述的Koch三角。得益于這種定位方式的普及，與20世紀60年代相比，先心病矯治術后傳導阻滯發病率顯著下降[1, 3]，這也驗證了這種定位方式的準確性。
但無論如何，通過解剖學標志定位CCS的方法是經驗性的，并非所有人的CCS都完全一致。在約10%的案例中，SAN可呈馬蹄形出現兩個主體[9]。AVN在Koch三角中的位置也是可變的，Cabrera 等[17]通過解剖41例正常人心臟發現約3/4的AVN向上靠近三尖瓣隔瓣附著緣，約1/4向下靠近Koch三角底部而遠離三尖瓣隔瓣。更大的變異性則體現在先心病患者人群中，以房室傳導軸的變異最為典型。膜周型室間隔缺損邊緣包含中心纖維體或室間隔膜部，AVN在Koch三角中的位置較正常位置要更靠近尾部，AVB則移動到Koch三角的冠狀竇側，BB圍繞隔缺損的邊緣走行。在房室管畸形中，由于房室間隔缺乏連貫性，AVN不再位于Koch三角，而位移至房室交界處的房間隔后方，合并共同房室瓣的畸形房室傳導軸的走行則更為復雜[9]。在更極端的例子如矯正型大動脈轉位中，AVN常分裂為兩個并分別延續出各自的AVB，騎跨肺動脈瓣環后匯合成共干穿入室間隔[18]。
CCS變異的可能性使得其位置的不確定性增大，外科醫生往往會避開整個上腔靜脈與右心房交界區域的操作，以防其中包含有SAN或其滋養血管。對于AVN，即使準確識別出Koch三角，也無法明確判斷其起始及下級延伸所在具體位置。外科醫生謹慎地避開CCS所有可能出現的位置會直接影響手術操作范圍，遺漏殘余畸形的可能性增加而影響手術預后[19]。
2 CCS組織學顯像及特征性分子靶點
最初關于CCS結構的研究都是基于組織切片層面的，自1906年Tawara發現AVN并對其結構、功能進行報道描述以來，有關CCS解剖學結構的爭論便一直存在[20]。房室之間是否真的存在離散的特化的電傳導通路及如何證明其客觀存在是爭論的焦點[21]。Aschoff和Monkeberg根據前人的研究經驗，提出了證明心肌組織中存在特化電通路的組織學依據：（1）傳導系統在組織上與周圍其他組織是互相分離的；（2）傳導系統結構能在連續的切片中被追蹤；（3）傳導系統周圍有絕緣纖維組織將其與周圍工作心肌分隔開來[22-23]。Masson三色染色是常用的心臟切片染色方法，染色后肌肉組織呈紅色，而結締組織呈淺藍或青色，可根據不同區域顏色及細胞形態和排列方式的區別區分工作心肌及CCS組織[17, 24]，但這種方法難以識別細微的CCS結構。隨著現代分子生物技術的發展，根據細胞分子表型的不同能更為精準地識別區分不同的組織結構，這為CCS的識別提供了新的依據[6]。利用CCS細胞表達的特征性靶點并結合免疫組化或免疫熒光技術，可實現對 CCS的直接顯像[7, 14, 25]，對連續切片圖像進行計算機三維重建，能直觀地觀察到CCS在心臟中分布及走向。
超級化激活陽離子電流（If）通道蛋白4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4，HCN4）是介導傳導細胞緩慢自動去極化過程的重要膜蛋白。其在SAN、AVN有高度的表達，而在工作心肌中呈現出極低表達或者無表達[6, 13]。此外，HCN4在右房室環、主動脈后結中也存在表達[6]，表達程度SAN>右房室環>左房室環[7, 13]。HCN4幾乎在所有的CCS結構中都存在表達，是CCS理想的分子標記物。也有人利用電壓門控鈉離子通道（voltage-gated sodium channels，NaVs）對CCS進行熒光染色發現NaV1.5在SAN及AVN中低表達，而在AVB、BB、PF等快傳導結構中高表達，因此NaV1.5可作為識別下游傳導束的標記物 [25] 。
縫隙連接是位于心肌相鄰細胞間的一類跨膜物質交換通道，由縫隙連接蛋白（connexin，Cx）參與構成，允許離子和小分子（<900 Da）滲透通過，是負責細胞間電和代謝偶聯的關鍵結構。在心肌細胞中表達的Cx主要有三種：Cx40、Cx43和Cx45[26]。Cx的不同亞型在CCS及工作心肌中均有表達但存在差異：在SAN及AVN中觀察到Cx45高表達，Cx43低表達，在心房肌中Cx43大量表達Cx45低表達[6, 13]；Cx40在AVN及心室肌中低表達，在AVB、BB和PF中高表達[7, 25]；此外，Cx45在 AVB及房室環中也有大量表達，在周圍工作心肌中低表達[13, 26-28]。因此，CX40及CX45可作為CCS相應結構的標記物，而Cx43常作為工作心肌的標記物。
某些上游轉錄因子也可做為CCS標志物。T盒轉錄因子3（T-box transcription factor,Tbx3）廣泛表達于除PF外的SAN、AVN、AVB及BB中，且在工作心肌細胞中很少表達，可作為中CCS的分子標記物[29]。Sizarov等[14] 在對人類胚胎心臟的研究中，在心房室環及主動脈后結區也觀察到有Tbx3的表達。
基于這些特征性的分子靶點，CCS的顯像更為準確。此外，應用轉基因或基因敲入技術，將CCS標志性基因與報告基因相關聯（如熒光酶基因、β-半乳糖苷酶基因等），利用報告基因的表達產物，僅需添加對應底物（如熒光素、LX-gal等），即可實現CCS顯像，極大地提升了CCA可視化的便利性[30-32]。Liang等[33]綜述了可用于傳導系統顯像的基因小鼠模型。
3 CCS非破壞性定位或顯像技術
傳統對于CCS結構的研究，往往需要制備組織切片，這些操作具有破壞性，因此局限于基礎研究領域而臨床應用價值有限。試圖將CCS由“隱形”轉化為“有形”的探索從未停止，近些年來逐漸出現了一些更有臨床應用價值的非破壞性顯像技術。此外，基于特異性靶點的活體熒光成像技術在CCS顯像上的研究也取得了令人鼓舞成果，為CCS的實時顯像提供了新的思路。
3.1 電阻抗測量及局部心電圖技術
由于術后傳導阻滯的發生與手術損傷CCS具有高度相關性，早在上世紀便開始有人探索更為直觀的定位CCS的方法。早期的研究基于CCS的電傳導特性，期望通過手持電極探測心臟中的電生理特性來區分CCS及工作心肌。
電阻抗測量法應用一定強度的交流電，通過手持電極探頭即可直接測量局部組織間的電壓差異，并將這種差異轉化為不同頻率和強度的聲音信號。傳導組織的阻抗較工作心肌更小，外科醫生可根據儀器發出的聲音差異來區分CCS和工作心肌，以此判斷CCS的位置[34-35]。但阻抗的測量信號是組織在三維空間內分布的復雜函數結果，這種分布在AVN區表現出高度的異質性，因此阻礙了定位的準確性，20世紀60年代后便再無此類研究。基于局部心電圖的CCS定位方法也出現在早期的一些探索中，應用手持雙極探頭描繪出不同CCS部位的特征性心電圖，根據這些特征性的心電圖以判斷相應CCS的位置[36-37]。這種方法更適用于定位傳導方向明確的結構，如房室束及束支。一項對15例兒童和成人先心病患者的研究[38]表明，這種方法對遠端AVB和RBB可以取得67%的成功率。但其局限在于測量局部心電圖需要保持心肌的電活動，這有悖于體外循環下心內直視手術的心肌保護原則。這種方法在20世紀70年代后也無更進一步的有效性和安全性相關研究。
3.2 高分辨核磁共振成像技術及計算機斷層掃描技術
Li等[39] 利用高分辨率磁共振成像（MRI）對兔心SAN和AVN進行了三維重建。使用Masson三色染色和神經絲免疫酶標染色（神經絲蛋白特異性表達于兔CCS）的方法制作組織切片，識別出SAN和AVN，在高精度MRI掃描圖像中尋找并劃分出相應區域，成功構建了包含有SAN和AVN的兔右心房3D解剖學模型，并在此結構模型基礎上構建電生理模型，成功模擬了正常情況和心房顫動時的右房和房室交界區電生理行為。Bordas 等[40]利用高分辨率MRI成像數據并結合特定的算法分析兔心MRI掃描參數，成功構建了游離浦肯野纖維及末端分支的3D模型并構建了兔心室的電生理模型。CCS在心臟中的分布和形態是研究心臟電生理的基礎，動作電位傳導方向也與工作心肌的排列方向密切相關，因此心肌細胞的排列方向也必須納入此類電生理模型的考慮。但基于MRI成像的原理，獲取心肌排列方向的數據是不可能的。因此，運用MIR技術構建的心臟電生理模型的準確性相對較弱。
Stephenson 等[10]利用高分辨率對比增強型顯微計算機斷層掃描技術（micro-computed tomography，micro-CT）首次在離體的人類完整心臟中實現對CCS的三維成像并利用掃描數據完成了1例室間隔缺損標本的3D打印模型制作[41]。通過對預先固定處理的離體心臟使用7.5% I2KI造影劑染色，利用不同組織對I2KI親和力的不同、掃描時 X射線的衰減程度不同的特點以區別CCS組織，其成像特點為脂肪、工作心肌、結組織（nodal tissue）、結周組織（paranodal tissue）和結締組織體素值依次下降。Micro-CT不但具備非破壞性的特點，同時還有數據獲取時間短、空間分辨率高（可達微米級）的優勢，甚至可觀察到心肌排列方向，從而建立包含心肌向量的電生理模型[42]。對比增強型micro-CT技術目前只能用于離體的小體積樣本，并且需行固定和碘染色預處理，尚未用于真正的活體目標，距離實際臨床應用仍有距離，但其快速、非破壞且相對低成本的特點預示了未來可能的應用前景。
相位對比計算機斷層掃描技術（phase-contrast computed tomography ，PCCT）根據X射線在組織中的相位值變化差異來對組織進行成像。相較于根據不同組織X射線吸收程度不同來區分組織的傳統CT，PCCT的成像分辨率和對比度更高（1 000倍），能對軟組織中的細微結構進行高精度成像[43]。Shinohara等[43,-44]應用PCCT技術對尸檢獲取的新生兒或嬰兒離體心臟進行掃描，掃描圖像中能清晰地識別出包繞在高密度纖維鞘內的、具有連續性的低密度房室傳導軸結構（AVN、AVB、LBB及RBB），三維重建后還能更直觀的顯示其在完整心臟中的分布走行，從而實現對CCS的可視化。進一步利用PCCT對離體室缺畸形患兒心臟進行了非破壞性的解剖學及電生理學研究[45]。相較于對比增強型micro-CT技術，PCCT無需對離體心臟進行額外的碘染色，操作更為簡單。但目前其對CCS成像尚不能用于活體患者，胸廓及肺泡內的氣體會使X射線不均勻吸收和隨機折射，從而干擾心臟內的相移值（phase shift value）探測。事實上PCCT目前尚無適用于臨床使用的研發成果，但隨著這一技術的不斷革新，未來將有機會投入臨床使用。
這些非破壞性的CCS可視化技術有益于更好地理解先心病、后心病及年齡等對CCS帶來的影響及改變，為研究心臟電生理、CCS形態重構與心律失常之間的聯系等研究方向提供新的見解，重建的模型也可為外科手術或內科電生理治療方案的制訂提供信息參考或臨床教學便利。
3.3 CCS實時光學成像技術
利用適當波長的光激發組織產生自體熒光，并根據熒光差異區分不同組織的光譜法被廣泛應用于區別某些正常及病理組織的研究。自上世紀九十年代以來便有人嘗試應用光譜法區別CCS及工作心肌[46-48]。盡管不同組織自體熒光的特定激發光波長和測量的發射光波長不盡相同，但CCS區域和工作心肌之間的光譜學差異足以對其進行區分。心肌組織的自發熒光來源于色氨酸、膠原蛋白和彈性蛋白，CCS和工作心肌光譜的不同提示這些自發熒光基團的分布是有組織特異性的。由于區分CCS和工作心肌的最佳激發光光譜多為紫外光或近紫外光，其潛在的致病性可能限制了其臨床轉化，目前尚無相關的臨床研究，但這為術中實時的CCS熒光顯像定位提供了思路。
Huang等[49]將熒光偶聯小分子右旋糖苷直接施加在大鼠心外膜和心內膜表面，利用其能快速滲透并擴散入細胞外間隙而不進入細胞內的特點，對大鼠活心臟細胞外間隙進行熒光染色并使用光纖共聚焦顯微鏡（fibre-optic confocal microscopy，FCM）進行觀察。FCM利用CCS與工作心肌微觀結構排列的不同來區分二者：工作心肌表現出細胞外間隙的規則條紋排列，而SAN、AVN則呈現不規則網狀排列，憑肉眼即可直觀辨別。進一步驗證其識別靈敏度及特異性可達99.2%±0.3% 和 98.0%±0.7%[50]。共聚焦顯微鏡能在不同焦平面對一定深度的熒光進行斷層成像，其物鏡偶聯光纖后使用場景更加靈活，可安置于手術室直接于術中進行成像。首個臨床試驗使用熒光素鈉作為細胞外間隙熒光顯色劑，對6例繼發孔型房間隔缺損患者進行了FCM探測，證明了其有效性及安全性[51]。這種FCM技術可以在極短時間內，于術中直接對組織進行實時成像，對手術進程影響小。FCM 有望成為復雜先心病手術期間定位傳導組織區域的有效工具。由于激光穿透深度的限制，此共聚焦技術目前可以實現100 μm深度以內的組織結構顯像[50]，因此僅能觀察位置較為表淺的SAN及AVN，而對于更為深層的結構，如AVB、BB等則不適用。
3.4 基于特征性靶點的活體熒光顯像技術
活體熒光顯像技術是近年應用于臨床的一種實時成像的新技術，利用特殊的熒光染料可以對肉眼難以區分的一些特殊結構或病變組織進行成像，如神經、血管、腫瘤等[52-54]。常用的染料包括吲哚菁綠、熒光素鈉等，這些染料并無特異性結合能力，但不同組織或結構對這類熒光染料攝取、濃集、清除速度的不同，因此能使特定組織顯像。相較于上述非特異性熒光染料，使用抗體偶聯的熒光染料作用于特異性靶點可以更有針對性地對目標部位進行顯像。利用腫瘤標志物在癌細胞中過表達的特點，Kausha 等[55]通過對小鼠靜脈注射CEA抗體偶聯的熒光染料成功實現了胰腺癌及結腸癌病灶的特異性顯像，以指導腫瘤的手術切除。近紅外光(NIR)是指波長位于650～900 nm的光波，相較于傳統熒光，近紅外光具有穿透力強、空間分辨率高、光散射小的特點，對深部組織的成像也能取得良好效果。靜脈注射特異性抗體偶聯的NIR熒光染料甚至可以實現正常組織覆蓋下的腫瘤灶顯像[56-57]。
最近，也有研究利用特異性標志物對CCS的活體熒光顯像進行了探索。Goodyer等[58]選擇了特異性表達于CCS細胞表面的Cntn2 (contactin 2)作為標志物，設計了相應的抗體偶聯的近紅外光染料（mCntn2-800），可在細胞外特異地與Cntn2蛋白相結合。通過對小鼠靜脈注射mCntn2-800，成功實現了對SAN、AVN、PF等結構的活體熒光成像。注射染料前后并未發現小鼠心電圖特征明顯改變，初步證明了其短期的安全性。他們還針對人源Cntn2蛋白設計了全人源單克隆Fab，經驗證，其同樣能夠高度特異地結合于人類CCS，證明了這種方法應用于臨床的可行性。該方法對CCS的顯像具有成像質量高、高度特異性且空間分辨率高的特點，穿透深度達厘米級的INR光對深埋于組織下的BB和細小的PF也能有不錯的成像效果。同時，該方法操作更為簡單，不會影響手術進程，這在一定程度上解決了前述FCM的一些局限性。但目前該技術尚未開展相關臨床實驗，對于CCS埋藏深度更深、表面覆蓋組織更為致密的人類心臟，成像效果未知，其長期安全性尚無法確定。
表1
CCS非破壞性定位或可視化技術
4 總結與討論
CCS的病理學研究奠定了當前識別定位CCS的基礎。基于以往大量的關于CCS的高精度切片研究結果，人們對正常或異常心臟中的CCS結構有了比較完整的認識，熟練使用解剖標志來定位CCS區域已經成為合格的心臟外科醫生的必備技能。得益于此，與上世紀60年代相比，需要術后安置起搏器的傳導阻滯發病率顯著下降。但研究發現，近20年來的先心病矯治術后傳導阻滯的發病率趨于平穩而并無繼續下降趨勢，無論是簡單先心病還是復雜先心病矯治，這說明利用解剖標志定位CCS避免損傷的方法作用已達飽和。新的更加精準的CCS顯像及定位技術的出現勢必將打破這一僵局，在手術干預期間對CCS進行更為準確的定位可能會顯著降低傳導損傷的發生率，特別是在解剖標志定位非常困難的復雜病例中。
高分辨率核磁共振成像技術和各類計算機斷層掃描技術可以實現對完整心臟中CCS進行高精度成像，直觀地顯示CCS與周圍結構之間的關系，為研究心臟電生理、心律失常與CCS結構之間的聯系等研究方向提供新的見解。重建的模型可以3D圖形或3D打印的方式存檔，用于指導醫療方案制定、臨床教學等。相較于傳統的連續病理切片，具有方便快捷、空間分辨率高的優勢。但上述研究僅被應用于離體心臟，尚未應用于活體，其臨床適用性尚待證明，但隨著相關技術的不斷革新，未來將有機會投入臨床使用。利用FCM成功在活體動物中上實現了對CCS的實時定位，彌補了傳統根據解剖標志定位的局限性，使得CCS的定位更為直觀和準確。CCS的FCM術中實時定位技術對降低術后傳導阻滯的發病率，尤其是復雜先心病有著巨大的臨床價值。但FCM只能實現一定深度范圍內的CCS結構成像，主要為SAN及AVN，對于更深層次的AVB和束支則無法探查。長久以來，利用特異性分子靶點的CCS顯像主要依托于組織切片的免疫熒光技術，但得益于活體熒光顯像相關技術和設備的問世及臨床普及，使用抗體偶聯的熒光染料同樣可以實現活體動物的CCS實時熒光成像，這也許可作為CCS術中實時成像的技術思路和未來發展方向。結合高穿透性的近紅外光熒光染料有望解決當前FCM技術成像深度的局限。若臨床試驗能進一步證明其有效性及安全性，并能成功實現臨床轉化，將是手術識別定位CCS的一項里程碑式的突破。
利益沖突：無。
作者貢獻：于鍇參與本文的撰寫和修改；干昌平對文章的內容進行指導和修正。
心臟沖動的產生及傳導由特化的心肌組織—心傳導系統（cardiac conduction system, CCS）參與。心臟傳導細胞具有自律性，能自發且有節律地產生沖動，其中以竇房結（sinoatrial node，SAN）自律性最強，在傳導系統中起主導作用。沖動首先在SAN自發產生，沖動在向下傳導的過程中，出現任何擾動都有可能誘發嚴重的心律失常。盡管心律失常的發病率及死亡率占人群心血管病事件中的比重并不低，但一些心律失常的病理生理學機制卻尚存爭議。研究CCS在心臟中的解剖結構是研究心臟電生理及傳導相關疾病的基礎。外科手術過程中的縫合、夾持或牽拉等對CCS的直接損傷是術后發生暫時或永久傳導阻滯的重要原因[1]，正確識別判斷CCS，避免其損傷可以有效降低術后傳導阻滯的發病率。
人們對CCS結構的認識經歷了一個漫長的過程，相較于同樣起著傳導電沖動功能的外周神經，CCS體積細小，且包裹在周圍的纖維結締組織鞘不豐富，僅憑肉眼難以識別辨認。依靠一些重要的解剖學標志定位CCS是目前心臟外科醫生避免CCS損傷的基本手段。但CCS往往存在一定的變異性，尤其在先天性心臟病（先心病）患者人群中，越為復雜的畸形其變異度越大。這些變異增大了傳統定位方法的不確定性，CCS定位困難使得術中損傷的可能性大大增加，這體現在越為復雜的先心病矯治手術，術后傳導阻滯的發病率越高，從簡單畸形的3%～6%，到復雜畸形的>20%[2-4]。嚴重的傳導阻滯需植入埋藏式起搏器以維持正常心律，為患者帶來額外的醫療負擔、降低生活質量甚至影響預后。
如何識別和定位CCS歷來都是研究熱門的話題。將肉眼不可見的CCS可視化是最為直接的辦法。在此我們回顧了CCS組織學顯像的方法及其特異性分子靶點和歷來對于CCS定位及可視化的探索，并著重探討近年來出現的CCS的非破壞性成像技術及手術實時定位方法的臨床應用前景及未來發展方向。
1 心臟傳導系統的解剖定位及變異
在大多數脊椎動物中，在心房及心室入口處都可以分別觀察到一個產生沖動的起搏組織（pacemaker tissue）和另一個類-起搏組織（pacemaker-like tissue）—在哺乳動物中能更清楚地從形態學上被劃分為SAN和房室結（atrioventricular node，AVN）；而除鱷魚外的變溫動物則不具有房室束、束支及浦肯野纖維這類特殊的房室傳導系統[5]。對于人類心臟，目前的普遍共識是CCS由SAN、AVN、房室束、左右束支及終末的浦肯野纖維構成。隨著對CCS結構了解的深入，研究者們還發現了與AVN相連且有別于工作心肌細胞的其他組成部分—房室環及主動脈后結[6]等，因其有與傳導細胞高度相似的表達特點，被認為可能是CCS傳導的一部分，且可能與某些心律失常形成機制有關[6-7]。
SAN是心臟的正常起搏點，位于上腔靜脈與右心房界嵴的交界處，SAN的自動去極化是心臟能自發收縮的基礎。SAN主體位于上腔靜脈與右心房交界的終溝處[8-9]，并由寬變窄向下腔靜脈方向延伸，同時向四周投射組織至界嵴、終溝、梳狀肌及房間隔[10]。房室傳導軸（AV conduction axis）由AVN、房室束( atrioventricular bundle，AVB)、左右束支(bundle branch，BB)構成，是正常情況下連接心房與心室電傳導的唯一通道。AVN位于Koch三角內。AVB起源自AVN前端，分為穿透部和分支部，穿透部在中心纖維體中穿行，向前向下延伸到主動脈無冠竇水平時穿出中心纖維體，然后從無冠竇和右冠狀脈竇之間的AVB段（即分支部）上發出細小纖維形成扁平帶狀的左束支（LBB），未參與分散的纖維繼續向下延續形成右束支（RBB）[11]。LBB發出后，在室間隔左側心內膜下走形并再次分支，大致分為兩簇：前簇主要掃過左室流出道區域并深入前乳頭肌；后簇轉向左室后部并深入后乳頭肌[11-12]。右束支在右側室間隔心肌層內穿行一段距離后淺出至右側心內膜深面，并向前下方走行，經隔緣肉柱至前乳頭肌根部，分支分布于右心室壁[12]。左右束支各級分支最終形成心肌內的浦肯野纖維網（Purkinje fiber，PF）。房室環（atrioventricular ring）及主動脈后結（retroaortic node）是近年來發現的CCS的另一成分，在人類和一些動物中均能觀察到[13-15]。房室環由AVN向右下及左下分別發出延伸支并包繞在三尖瓣及二尖瓣周圍形成，即右房室環和左房室環；右側延伸支跨過AVB上方區域和左側延伸支在主動根后方相連續并膨大形成主動脈后結[6]。其功能尚存在爭議，可能參與了房室折返型心律失常的形成[6] 。Atkinson等[7]證實右房室環具有異位起搏點能力，并推測該結構可能是房性心動過速的來源。
前人大量的CCS組織學研究結果為CCS的定位奠定了解剖學基礎，盡管不能肉眼直接識別，但根據一些解剖學標志判斷CCS位置是心臟外科手術避免損傷傳導系統的通行方法。SAN位于上腔靜脈與右心房的交界區，周圍無纖維包鞘，肉眼難以識別，但有時SAN心外膜面會覆蓋一層脂肪墊，或因該區域結締組織豐富而在心外膜面呈現為一白色斑塊[16]，據此也可大致推斷其方位。AVN的解剖學定位標志則為上述的Koch三角。得益于這種定位方式的普及，與20世紀60年代相比，先心病矯治術后傳導阻滯發病率顯著下降[1, 3]，這也驗證了這種定位方式的準確性。
但無論如何，通過解剖學標志定位CCS的方法是經驗性的，并非所有人的CCS都完全一致。在約10%的案例中，SAN可呈馬蹄形出現兩個主體[9]。AVN在Koch三角中的位置也是可變的，Cabrera 等[17]通過解剖41例正常人心臟發現約3/4的AVN向上靠近三尖瓣隔瓣附著緣，約1/4向下靠近Koch三角底部而遠離三尖瓣隔瓣。更大的變異性則體現在先心病患者人群中，以房室傳導軸的變異最為典型。膜周型室間隔缺損邊緣包含中心纖維體或室間隔膜部，AVN在Koch三角中的位置較正常位置要更靠近尾部，AVB則移動到Koch三角的冠狀竇側，BB圍繞隔缺損的邊緣走行。在房室管畸形中，由于房室間隔缺乏連貫性，AVN不再位于Koch三角，而位移至房室交界處的房間隔后方，合并共同房室瓣的畸形房室傳導軸的走行則更為復雜[9]。在更極端的例子如矯正型大動脈轉位中，AVN常分裂為兩個并分別延續出各自的AVB，騎跨肺動脈瓣環后匯合成共干穿入室間隔[18]。
CCS變異的可能性使得其位置的不確定性增大，外科醫生往往會避開整個上腔靜脈與右心房交界區域的操作，以防其中包含有SAN或其滋養血管。對于AVN，即使準確識別出Koch三角，也無法明確判斷其起始及下級延伸所在具體位置。外科醫生謹慎地避開CCS所有可能出現的位置會直接影響手術操作范圍，遺漏殘余畸形的可能性增加而影響手術預后[19]。
2 CCS組織學顯像及特征性分子靶點
最初關于CCS結構的研究都是基于組織切片層面的，自1906年Tawara發現AVN并對其結構、功能進行報道描述以來，有關CCS解剖學結構的爭論便一直存在[20]。房室之間是否真的存在離散的特化的電傳導通路及如何證明其客觀存在是爭論的焦點[21]。Aschoff和Monkeberg根據前人的研究經驗，提出了證明心肌組織中存在特化電通路的組織學依據：（1）傳導系統在組織上與周圍其他組織是互相分離的；（2）傳導系統結構能在連續的切片中被追蹤；（3）傳導系統周圍有絕緣纖維組織將其與周圍工作心肌分隔開來[22-23]。Masson三色染色是常用的心臟切片染色方法，染色后肌肉組織呈紅色，而結締組織呈淺藍或青色，可根據不同區域顏色及細胞形態和排列方式的區別區分工作心肌及CCS組織[17, 24]，但這種方法難以識別細微的CCS結構。隨著現代分子生物技術的發展，根據細胞分子表型的不同能更為精準地識別區分不同的組織結構，這為CCS的識別提供了新的依據[6]。利用CCS細胞表達的特征性靶點并結合免疫組化或免疫熒光技術，可實現對 CCS的直接顯像[7, 14, 25]，對連續切片圖像進行計算機三維重建，能直觀地觀察到CCS在心臟中分布及走向。
超級化激活陽離子電流（If）通道蛋白4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4，HCN4）是介導傳導細胞緩慢自動去極化過程的重要膜蛋白。其在SAN、AVN有高度的表達，而在工作心肌中呈現出極低表達或者無表達[6, 13]。此外，HCN4在右房室環、主動脈后結中也存在表達[6]，表達程度SAN>右房室環>左房室環[7, 13]。HCN4幾乎在所有的CCS結構中都存在表達，是CCS理想的分子標記物。也有人利用電壓門控鈉離子通道（voltage-gated sodium channels，NaVs）對CCS進行熒光染色發現NaV1.5在SAN及AVN中低表達，而在AVB、BB、PF等快傳導結構中高表達，因此NaV1.5可作為識別下游傳導束的標記物 [25] 。
縫隙連接是位于心肌相鄰細胞間的一類跨膜物質交換通道，由縫隙連接蛋白（connexin，Cx）參與構成，允許離子和小分子（<900 Da）滲透通過，是負責細胞間電和代謝偶聯的關鍵結構。在心肌細胞中表達的Cx主要有三種：Cx40、Cx43和Cx45[26]。Cx的不同亞型在CCS及工作心肌中均有表達但存在差異：在SAN及AVN中觀察到Cx45高表達，Cx43低表達，在心房肌中Cx43大量表達Cx45低表達[6, 13]；Cx40在AVN及心室肌中低表達，在AVB、BB和PF中高表達[7, 25]；此外，Cx45在 AVB及房室環中也有大量表達，在周圍工作心肌中低表達[13, 26-28]。因此，CX40及CX45可作為CCS相應結構的標記物，而Cx43常作為工作心肌的標記物。
某些上游轉錄因子也可做為CCS標志物。T盒轉錄因子3（T-box transcription factor,Tbx3）廣泛表達于除PF外的SAN、AVN、AVB及BB中，且在工作心肌細胞中很少表達，可作為中CCS的分子標記物[29]。Sizarov等[14] 在對人類胚胎心臟的研究中，在心房室環及主動脈后結區也觀察到有Tbx3的表達。
基于這些特征性的分子靶點，CCS的顯像更為準確。此外，應用轉基因或基因敲入技術，將CCS標志性基因與報告基因相關聯（如熒光酶基因、β-半乳糖苷酶基因等），利用報告基因的表達產物，僅需添加對應底物（如熒光素、LX-gal等），即可實現CCS顯像，極大地提升了CCA可視化的便利性[30-32]。Liang等[33]綜述了可用于傳導系統顯像的基因小鼠模型。
3 CCS非破壞性定位或顯像技術
傳統對于CCS結構的研究，往往需要制備組織切片，這些操作具有破壞性，因此局限于基礎研究領域而臨床應用價值有限。試圖將CCS由“隱形”轉化為“有形”的探索從未停止，近些年來逐漸出現了一些更有臨床應用價值的非破壞性顯像技術。此外，基于特異性靶點的活體熒光成像技術在CCS顯像上的研究也取得了令人鼓舞成果，為CCS的實時顯像提供了新的思路。
3.1 電阻抗測量及局部心電圖技術
由于術后傳導阻滯的發生與手術損傷CCS具有高度相關性，早在上世紀便開始有人探索更為直觀的定位CCS的方法。早期的研究基于CCS的電傳導特性，期望通過手持電極探測心臟中的電生理特性來區分CCS及工作心肌。
電阻抗測量法應用一定強度的交流電，通過手持電極探頭即可直接測量局部組織間的電壓差異，并將這種差異轉化為不同頻率和強度的聲音信號。傳導組織的阻抗較工作心肌更小，外科醫生可根據儀器發出的聲音差異來區分CCS和工作心肌，以此判斷CCS的位置[34-35]。但阻抗的測量信號是組織在三維空間內分布的復雜函數結果，這種分布在AVN區表現出高度的異質性，因此阻礙了定位的準確性，20世紀60年代后便再無此類研究。基于局部心電圖的CCS定位方法也出現在早期的一些探索中，應用手持雙極探頭描繪出不同CCS部位的特征性心電圖，根據這些特征性的心電圖以判斷相應CCS的位置[36-37]。這種方法更適用于定位傳導方向明確的結構，如房室束及束支。一項對15例兒童和成人先心病患者的研究[38]表明，這種方法對遠端AVB和RBB可以取得67%的成功率。但其局限在于測量局部心電圖需要保持心肌的電活動，這有悖于體外循環下心內直視手術的心肌保護原則。這種方法在20世紀70年代后也無更進一步的有效性和安全性相關研究。
3.2 高分辨核磁共振成像技術及計算機斷層掃描技術
Li等[39] 利用高分辨率磁共振成像（MRI）對兔心SAN和AVN進行了三維重建。使用Masson三色染色和神經絲免疫酶標染色（神經絲蛋白特異性表達于兔CCS）的方法制作組織切片，識別出SAN和AVN，在高精度MRI掃描圖像中尋找并劃分出相應區域，成功構建了包含有SAN和AVN的兔右心房3D解剖學模型，并在此結構模型基礎上構建電生理模型，成功模擬了正常情況和心房顫動時的右房和房室交界區電生理行為。Bordas 等[40]利用高分辨率MRI成像數據并結合特定的算法分析兔心MRI掃描參數，成功構建了游離浦肯野纖維及末端分支的3D模型并構建了兔心室的電生理模型。CCS在心臟中的分布和形態是研究心臟電生理的基礎，動作電位傳導方向也與工作心肌的排列方向密切相關，因此心肌細胞的排列方向也必須納入此類電生理模型的考慮。但基于MRI成像的原理，獲取心肌排列方向的數據是不可能的。因此，運用MIR技術構建的心臟電生理模型的準確性相對較弱。
Stephenson 等[10]利用高分辨率對比增強型顯微計算機斷層掃描技術（micro-computed tomography，micro-CT）首次在離體的人類完整心臟中實現對CCS的三維成像并利用掃描數據完成了1例室間隔缺損標本的3D打印模型制作[41]。通過對預先固定處理的離體心臟使用7.5% I2KI造影劑染色，利用不同組織對I2KI親和力的不同、掃描時 X射線的衰減程度不同的特點以區別CCS組織，其成像特點為脂肪、工作心肌、結組織（nodal tissue）、結周組織（paranodal tissue）和結締組織體素值依次下降。Micro-CT不但具備非破壞性的特點，同時還有數據獲取時間短、空間分辨率高（可達微米級）的優勢，甚至可觀察到心肌排列方向，從而建立包含心肌向量的電生理模型[42]。對比增強型micro-CT技術目前只能用于離體的小體積樣本，并且需行固定和碘染色預處理，尚未用于真正的活體目標，距離實際臨床應用仍有距離，但其快速、非破壞且相對低成本的特點預示了未來可能的應用前景。
相位對比計算機斷層掃描技術（phase-contrast computed tomography ，PCCT）根據X射線在組織中的相位值變化差異來對組織進行成像。相較于根據不同組織X射線吸收程度不同來區分組織的傳統CT，PCCT的成像分辨率和對比度更高（1 000倍），能對軟組織中的細微結構進行高精度成像[43]。Shinohara等[43,-44]應用PCCT技術對尸檢獲取的新生兒或嬰兒離體心臟進行掃描，掃描圖像中能清晰地識別出包繞在高密度纖維鞘內的、具有連續性的低密度房室傳導軸結構（AVN、AVB、LBB及RBB），三維重建后還能更直觀的顯示其在完整心臟中的分布走行，從而實現對CCS的可視化。進一步利用PCCT對離體室缺畸形患兒心臟進行了非破壞性的解剖學及電生理學研究[45]。相較于對比增強型micro-CT技術，PCCT無需對離體心臟進行額外的碘染色，操作更為簡單。但目前其對CCS成像尚不能用于活體患者，胸廓及肺泡內的氣體會使X射線不均勻吸收和隨機折射，從而干擾心臟內的相移值（phase shift value）探測。事實上PCCT目前尚無適用于臨床使用的研發成果，但隨著這一技術的不斷革新，未來將有機會投入臨床使用。
這些非破壞性的CCS可視化技術有益于更好地理解先心病、后心病及年齡等對CCS帶來的影響及改變，為研究心臟電生理、CCS形態重構與心律失常之間的聯系等研究方向提供新的見解，重建的模型也可為外科手術或內科電生理治療方案的制訂提供信息參考或臨床教學便利。
3.3 CCS實時光學成像技術
利用適當波長的光激發組織產生自體熒光，并根據熒光差異區分不同組織的光譜法被廣泛應用于區別某些正常及病理組織的研究。自上世紀九十年代以來便有人嘗試應用光譜法區別CCS及工作心肌[46-48]。盡管不同組織自體熒光的特定激發光波長和測量的發射光波長不盡相同，但CCS區域和工作心肌之間的光譜學差異足以對其進行區分。心肌組織的自發熒光來源于色氨酸、膠原蛋白和彈性蛋白，CCS和工作心肌光譜的不同提示這些自發熒光基團的分布是有組織特異性的。由于區分CCS和工作心肌的最佳激發光光譜多為紫外光或近紫外光，其潛在的致病性可能限制了其臨床轉化，目前尚無相關的臨床研究，但這為術中實時的CCS熒光顯像定位提供了思路。
Huang等[49]將熒光偶聯小分子右旋糖苷直接施加在大鼠心外膜和心內膜表面，利用其能快速滲透并擴散入細胞外間隙而不進入細胞內的特點，對大鼠活心臟細胞外間隙進行熒光染色并使用光纖共聚焦顯微鏡（fibre-optic confocal microscopy，FCM）進行觀察。FCM利用CCS與工作心肌微觀結構排列的不同來區分二者：工作心肌表現出細胞外間隙的規則條紋排列，而SAN、AVN則呈現不規則網狀排列，憑肉眼即可直觀辨別。進一步驗證其識別靈敏度及特異性可達99.2%±0.3% 和 98.0%±0.7%[50]。共聚焦顯微鏡能在不同焦平面對一定深度的熒光進行斷層成像，其物鏡偶聯光纖后使用場景更加靈活，可安置于手術室直接于術中進行成像。首個臨床試驗使用熒光素鈉作為細胞外間隙熒光顯色劑，對6例繼發孔型房間隔缺損患者進行了FCM探測，證明了其有效性及安全性[51]。這種FCM技術可以在極短時間內，于術中直接對組織進行實時成像，對手術進程影響小。FCM 有望成為復雜先心病手術期間定位傳導組織區域的有效工具。由于激光穿透深度的限制，此共聚焦技術目前可以實現100 μm深度以內的組織結構顯像[50]，因此僅能觀察位置較為表淺的SAN及AVN，而對于更為深層的結構，如AVB、BB等則不適用。
3.4 基于特征性靶點的活體熒光顯像技術
活體熒光顯像技術是近年應用于臨床的一種實時成像的新技術，利用特殊的熒光染料可以對肉眼難以區分的一些特殊結構或病變組織進行成像，如神經、血管、腫瘤等[52-54]。常用的染料包括吲哚菁綠、熒光素鈉等，這些染料并無特異性結合能力，但不同組織或結構對這類熒光染料攝取、濃集、清除速度的不同，因此能使特定組織顯像。相較于上述非特異性熒光染料，使用抗體偶聯的熒光染料作用于特異性靶點可以更有針對性地對目標部位進行顯像。利用腫瘤標志物在癌細胞中過表達的特點，Kausha 等[55]通過對小鼠靜脈注射CEA抗體偶聯的熒光染料成功實現了胰腺癌及結腸癌病灶的特異性顯像，以指導腫瘤的手術切除。近紅外光(NIR)是指波長位于650～900 nm的光波，相較于傳統熒光，近紅外光具有穿透力強、空間分辨率高、光散射小的特點，對深部組織的成像也能取得良好效果。靜脈注射特異性抗體偶聯的NIR熒光染料甚至可以實現正常組織覆蓋下的腫瘤灶顯像[56-57]。
最近，也有研究利用特異性標志物對CCS的活體熒光顯像進行了探索。Goodyer等[58]選擇了特異性表達于CCS細胞表面的Cntn2 (contactin 2)作為標志物，設計了相應的抗體偶聯的近紅外光染料（mCntn2-800），可在細胞外特異地與Cntn2蛋白相結合。通過對小鼠靜脈注射mCntn2-800，成功實現了對SAN、AVN、PF等結構的活體熒光成像。注射染料前后并未發現小鼠心電圖特征明顯改變，初步證明了其短期的安全性。他們還針對人源Cntn2蛋白設計了全人源單克隆Fab，經驗證，其同樣能夠高度特異地結合于人類CCS，證明了這種方法應用于臨床的可行性。該方法對CCS的顯像具有成像質量高、高度特異性且空間分辨率高的特點，穿透深度達厘米級的INR光對深埋于組織下的BB和細小的PF也能有不錯的成像效果。同時，該方法操作更為簡單，不會影響手術進程，這在一定程度上解決了前述FCM的一些局限性。但目前該技術尚未開展相關臨床實驗，對于CCS埋藏深度更深、表面覆蓋組織更為致密的人類心臟，成像效果未知，其長期安全性尚無法確定。
表1
CCS非破壞性定位或可視化技術
4 總結與討論
CCS的病理學研究奠定了當前識別定位CCS的基礎。基于以往大量的關于CCS的高精度切片研究結果，人們對正常或異常心臟中的CCS結構有了比較完整的認識，熟練使用解剖標志來定位CCS區域已經成為合格的心臟外科醫生的必備技能。得益于此，與上世紀60年代相比，需要術后安置起搏器的傳導阻滯發病率顯著下降。但研究發現，近20年來的先心病矯治術后傳導阻滯的發病率趨于平穩而并無繼續下降趨勢，無論是簡單先心病還是復雜先心病矯治，這說明利用解剖標志定位CCS避免損傷的方法作用已達飽和。新的更加精準的CCS顯像及定位技術的出現勢必將打破這一僵局，在手術干預期間對CCS進行更為準確的定位可能會顯著降低傳導損傷的發生率，特別是在解剖標志定位非常困難的復雜病例中。
高分辨率核磁共振成像技術和各類計算機斷層掃描技術可以實現對完整心臟中CCS進行高精度成像，直觀地顯示CCS與周圍結構之間的關系，為研究心臟電生理、心律失常與CCS結構之間的聯系等研究方向提供新的見解。重建的模型可以3D圖形或3D打印的方式存檔，用于指導醫療方案制定、臨床教學等。相較于傳統的連續病理切片，具有方便快捷、空間分辨率高的優勢。但上述研究僅被應用于離體心臟，尚未應用于活體，其臨床適用性尚待證明，但隨著相關技術的不斷革新，未來將有機會投入臨床使用。利用FCM成功在活體動物中上實現了對CCS的實時定位，彌補了傳統根據解剖標志定位的局限性，使得CCS的定位更為直觀和準確。CCS的FCM術中實時定位技術對降低術后傳導阻滯的發病率，尤其是復雜先心病有著巨大的臨床價值。但FCM只能實現一定深度范圍內的CCS結構成像，主要為SAN及AVN，對于更深層次的AVB和束支則無法探查。長久以來，利用特異性分子靶點的CCS顯像主要依托于組織切片的免疫熒光技術，但得益于活體熒光顯像相關技術和設備的問世及臨床普及，使用抗體偶聯的熒光染料同樣可以實現活體動物的CCS實時熒光成像，這也許可作為CCS術中實時成像的技術思路和未來發展方向。結合高穿透性的近紅外光熒光染料有望解決當前FCM技術成像深度的局限。若臨床試驗能進一步證明其有效性及安全性，并能成功實現臨床轉化，將是手術識別定位CCS的一項里程碑式的突破。
利益沖突：無。
作者貢獻：于鍇參與本文的撰寫和修改；干昌平對文章的內容進行指導和修正。
