肺癌是最常見的腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因[1-2]，大多數肺癌 （80%～90%）是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），最常在疾病晚期（65%）時被診斷出來，并可能已經出現局部或遠處轉移[3]。最近應用免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）的免疫療法正在有效地改善NSCLC患者的預后[4]，但是并非所有患者都能從免疫治療中獲益[5]，反映出需要更多地研究能夠預測免疫反應的生物標志物，可以監測體內的物質、結構或過程產物等[6]，從而預測免疫治療臨床反應。
CiteSpace軟件是由美國德雷塞爾大學（Drexel University，Philadelphia，PA，USA）陳超美團隊開發的文獻計量學分析工具[7]，能夠對學術數據庫的數據進行定量分析，從而了解該研究領域的研究動態。本研究首次通過CiteSpace對預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域的熱點及趨勢進行可視化分析，希望為國內學者的研究提供參考。
1 資料與方法
1.1 數據采集
選取Web of Science（WoS）核心合集數據庫作為文獻檢索平臺，檢索時間為2017—2021年，檢索方式均為主題詞，檢索式：TS=（（“non-small lung cancer”or “NSCLC”）and “predict*”and（“response”or “efficacy”）and “immunotherapy”and “biomarker*”），文獻類型為論著和綜述，共檢索出426篇文獻。
1.2 統計學分析
將在WoS核心合集數據庫檢索到的426篇文獻的全紀錄與引用的參考文獻以Text的格式導出，包括298篇論著、128篇綜述。通過CiteSpace 6.1.R2（64-bit）對文獻的國家、機構、作者、關鍵詞、被引文獻等進行全面分析。
2 結果
2.1 WoS核心合集數據庫年度發文量
檢索到匹配的文獻共426篇，發文量呈現逐年遞增趨勢（圖1），年平均發文量約為85篇。結果顯示，預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究在逐漸得到重視。
圖1
發文數量的年度分析
2.2 來源期刊分布情況
篩選出的426篇預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究的外文文獻被146個期刊收錄，其中發文量位居前10的期刊的JCR分區、發文量、影響因子及數量占比等內容詳見表1。
表1
發文量排名前10的期刊
2.3 國家機構合作可視化
運行CiteSpace軟件，選擇國家分析，得到知識圖譜共41個節點，99條連線（圖2），圖中每個圓形節點代表一個國家，圓形節點的大小反映國家發文數量多少，節點之間的連線代表國家間的合作關系，連線的粗細反映合作關系的緊密程度，節點的不同顏色代表不同的年代[8]，紫色圈的大小反映國家的影響力中心值。表2顯示發文量排名前5名的機構，分別是上海交通大學、華中科技大學、德克薩斯大學安德森癌癥中心、中山大學、中國醫學科學院北京協和醫學院。圖2及表2反映出我國研究者在該研究領域做出了一定的貢獻，與美國相比，雖然發文量領先，但在中心值上仍有較大差距，需要我們更多的與他國合作，擴大自身的影響力。
圖2
國家可視化圖譜
表2
發文量前5的機構
2.4 作者合作可視化
運行CiteSpace軟件，通過WoS 數據庫篩選出的文獻，對該領域的作者團隊合作網絡進行共現分析，該研究領域發文量前5的作者及其所屬機構見表3。
表3
發文量前5的作者
2.5 關鍵詞共現分析
關鍵詞的相關分析作為可視化分析圖譜中最具有指導性的內容，對明確該領域研究熱點及前沿至關重要。運行CiteSpace軟件，節點類型采用作者關鍵詞，得到294個節點、793條連線的關鍵詞共現圖譜（圖3）。去除其中部分與檢索策略重復的主題詞，分析該領域關鍵詞的共現頻次及其中心值可知，熱點關鍵詞為PD-L1 expression（programmed cell death 1 ligand 1，細胞程序性死亡配體1表達）、tumor mutational burden（腫瘤突變負荷）、EGFR mutation（表皮生長因子受體突變）、Tumor microenvironment（腫瘤微環境）、circulating tumor DNA（循環腫瘤DNA）、liquid biopsy（液體活檢）、tumor-infiltrating lymphocyte（腫瘤浸潤淋巴細胞）、neutrophil-to-lymphocyte ratio （中性粒細胞/淋巴細胞比值）、CD8+ T Cell、[18F]FDG PET/CT、immune-related adverse events（irAEs 免疫相關不良反應）、computational biology（生物信息學）、radiomic（影像組學）等。
圖3
關鍵詞可視化圖譜
尋找ICI的臨床獲益指標涉及到從傳統的病理學到分子生物學的各個領域。隨著基因測序平臺的技術進步和分析復雜數據集的生物信息學工具的可用性，研究學者們已經在腫瘤細胞、血液和健康組織中，甚至在細胞和分子水平上對假定的反應生物標志物進行了探索。根據所提取出的高頻重點關鍵詞的內容進行了梳理和總結，得出了目前的研究熱點主要集中于腫瘤相關生物標志物、腫瘤微環境相關生物標志物、宿主相關生物標志物、影像組學相關生物標志物這幾個方面。
2.5.1 腫瘤相關生物標志物
2.5.1.1 PD-L1 腫瘤細胞陽性比例分數（tumor proportion score，TPS）
PD-L1 表達是開發的第一個反應生物標志物，也是迄今為止Ⅳ期無驅動基因突變的非小細胞肺癌患者指導治療的首要選擇[9]。目前臨床上使用免疫組織化學方法對腫瘤標本進行 PD-L1 TPS評估存在一些局限性：即使在同一腫瘤病變，它在組織中的表達在時間和空間上是高度可變的。在臨床實踐中，該標志物的效用也有限，因為不表達 PD-L1 的患者可能對 PD-1 或 PD-L1 檢查點抑制劑有反應，相比而言，一些 PD-L1 表達升高的患者卻并未從這些藥物中受益。Yu 等[10]的研究顯示在接受過全外顯子組測序的NSCLC患者中，腫瘤突變負荷結合PD-L1表達的聯合使用與單獨的PD-L1表達相比具有較高的預測價值，包括對無進展生存期、免疫治療完全反應、部分反應預測方面，總結出組織中 PD-L1 表達和腫瘤突變負荷的聯合使用是評估患者存活率和免疫治療反應的具有前景的生物標志物。綜合考慮，PD-L1 表達在單獨使用時是一種弱生物標志物，需要尋找用于綜合評估的更好的選擇。
2.5.1.2 腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）
TMB被定義為癌癥基因組編碼部分內非同義突變的數量，當使用靶向二代測序平臺進行評估時，TMB 被視為可用于新抗原負載的最佳替代物[11]。作為較新的候選生物標志物，與 PD-L1 TPS 相比，前瞻性驗證的結果很少，而且結論往往不一致。值得注意的是，有研究顯示高 TMB 患者的免疫治療無進展生存期獲益與 PD-L1 表達無關[12]。然而基于 KEYNOTE-158 試驗預先計劃的回顧性分析的總體反應率[13]，2020年6月，美國食品藥品監督管理局批準了帕博利珠單抗（pembrolizumab）應用于在一線化療失敗時，晚期實體瘤且組織 TMB 高的患者（≥每兆堿基10個突變，使用 FoundationOneCDx 或 MSK-IMPACT 測定評估）。此外，通過對腫瘤和免疫細胞的分析，發現克隆 TMB（即每個癌細胞中非同義突變的數目）在預測對 ICI 的敏感性方面優于TMB[14]，所以仍需要在大規模前瞻性試驗中進行驗證TMB作為免疫治療療效預測生物標志物的價值。
2.5.2 腫瘤微環境相關生物標志物
2.5.2.1 T淋巴細胞浸潤
腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是由腫瘤、基質和腫瘤浸潤免疫細胞的有機復合體組成的，其中T淋巴細胞浸潤涉及多種細胞類型和細胞因子的復雜網絡，是免疫識別的標志。大量研究表明，活化的 CD8+T 細胞是參與抗腫瘤免疫的主要參與者，在一部分腫瘤中，癌細胞會通過表達諸如PD-L1等與抑制性檢查點結合的配體來抑制CD8+細胞毒性T細胞的激活，這被認為是癌細胞免疫逃逸的一個重要機制[15]。TME 免疫細胞上的 PD-L1 表達，包括骨髓細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞）和 T 細胞[16]，似乎與 ICI 反應的相關性比腫瘤細胞上的表達更相關[17]。然而在 NSCLC 臨床實踐中，組織學表征 T 淋巴細胞浸潤的一個限制是腫瘤組織的稀缺，這影響了對T淋巴細胞在影響 ICI 反應方面的深入了解。
2.5.2.2 癌癥相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）
成纖維細胞在器官形成和組織結構、功能的完整性中起著重要的作用。CAF通過有效的免疫抑制活性在腫瘤的起始、進展、轉移和治療耐藥性中發揮關鍵作用[18]。CAF 標志物主要與 T 細胞免疫抑制相關，阻斷 CD8+T 細胞和自然殺傷細胞的作用，尤其是通過釋放各種趨化因子和細胞因子（主要是 IL-6 的產生），導致臨床治療結果不佳[19]。隨著CAF和TME對免疫細胞的作用以及對癌癥免疫療法效率影響的研究不斷深入，研究者們可以開發出針對這些目標的新型化合物，從而對為免疫治療提供了新的思路。
2.5.3 宿主相關生物標志物
2.5.3.1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）
CTC 是具有腫瘤特異性信息的完整活細胞，也可以用于癌癥診斷和治療評估。一些作者研究了基線CTC 與總生存率之間的關系，發現大量 CTC 與死亡和進展風險增加之間存在關聯[20]。此外，在 ICI 治療前存在 PD-L1 陽性表達的 CTC（≥ 1% 的細胞）與不良預后和生存相關[21]，ICI 治療 6 個月后CTC上 PD-L1 的持續存在可能代表腫瘤逃逸的發生，從而導致疾病進展。一些研究對CTC的PD-L1表達和組織中的PD-L1表達之間的一致性進行了評估[22]，但結果存在爭議，需要更多的研究來評估標準化的方法和 PD-L1 抗體來檢測和分析 CTC。
2.5.3.2 循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）
cfDNA是目前臨床實踐中最具潛力的生物標志物，其半衰期較短，約為2 h，可以快速評估腫瘤相關變化，并能夠實時監測反應或復發。據報道[23]，cfDNA含量的變化是評估接受抗 PD-1 藥物治療的患者的腫瘤反應的重要工具。Giroux Leprieur等[24]報道首次評估ICI反應時（2個月時）的低 cfDNA 含量患者與納武單抗（nivolumab）的長期獲益有關。同時也有研究[25]發現cfDNA 含量的降低可能與對免疫療法的療效息息相關，表明 cfDNA 含量可能是治療效果評估的早期生物標志物，并能預測接受ICI治療的NSCLC患者的生存期是否有可能延長。在另一項研究[26]中，接受納武單抗治療且cfDNA 低于中值（3 mL血漿中836.5 ng）的 NSCLC 患者的存活時間明顯長于cfDNA 值高于中值的患者。此外，cfDNA和CTC的聯合分析有助于區分可能在繼續使用納武單抗中受益的低風險人群。這表明，聯合使用cfDNA和CTC可以幫助選擇那些從免疫治療中獲益最多的患者。
2.5.3.3 中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）
許多研究報告了免疫療法與NLR之間的相關性[27]。NLR可視為對不同壓力刺激的免疫反應的標志物，有研究者發現在接受 ICI 治療的 NSCLC患者中，高 NLR 值與較短的無進展生存期和總生存期相關[28]。近來一項針對 NSCLC 患者的研究發現NLR與人類白細胞DR抗原（Human leukocyte antigen DR，HLA-DR）單核細胞和樹突狀細胞的 ICI 反應之間的可能關聯。在使用 ICI 后，中性粒細胞/淋巴細胞比率和 HLA-DR 單核細胞頻率降低以及樹突狀細胞的增加，對ICI的反應和更長的OS起到了預測作用[29]。雖然NLR很容易從常規血細胞計數中評估并且是可重復的，但仍需等待具有臨床意義的閾值以進行前瞻性驗證。
2.5.3.4 外泌體
細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是納米尺寸的顆粒，可以由任何細胞類型（包括癌細胞）釋放。EV最常見的亞型是外泌體，其表面表達蛋白質并含有多種顆粒，例如核酸和脂質等[30]。腫瘤來源的外泌體同時攜帶免疫抑制和免疫刺激介質，并可能參與各種免疫調節作用,它保留了部分腫瘤母體細胞的特征[31]，因此，外泌體也是分析預后、預測治療反應的一種有前景的生物標志物。一項針對 NSCLC 患者的研究得出結論，外泌體中的 PD-L1 表達與疾病進展、腫瘤大小、淋巴結狀態、轉移和TNM分期相關。然而，外泌體和組織中的 PD-L1 表達之間沒有關聯[32]。總之識別腫瘤來源的外泌體并了解其對腫瘤發生和免疫治療反應的貢獻以及其分離方法的標準化仍然是面臨著挑戰。
2.5.4 影像組學
影像學研究是非侵入性的，幾乎所有癌癥患者在他們的診斷和治療過程中都會接受影像檢查，這使得這些類型的數據更加普遍，更重要的是影像學研究可以分析腫瘤的完整空間結構，從而避免穿刺活檢取樣的限制[33]。影像組學[34]（radiomics）作為人工智能時代的產物，能夠高通量地提取肺部圖像的定量特征，挖掘腫瘤的生物學信息[35]。這些新方法可以對肺癌病史的不同方面以及階段進行評估，能夠區分癌癥的組織學亞型，特別是腺癌和鱗狀細胞癌，預測EGFR突變狀態或PD-L1 表達以進行NSCLC 患者的風險分層，從而預測對不同類型療法的反應[36]。蔣等人的一項研究[37]探討了[18F]FDG PET/CT圖像中影像組學特征在評估399個NSCLC中不同PD-L1突變狀態的潛在價值，包含來自CT，PET和PET/CT圖像的影像組學特征的模型分別計算出受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）中曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.97，0.61和0.97，說明了基于影像組學的預測方法，特別是CT衍生的預測模型，可以相對準確地預測NSCLC患者的PD-L1表達狀態。Valentinuzzi等[38]創建了一個影像組學特征（iRADIOMICS），與臨床標準（iRECIST和PD-L1免疫組化）相比，能夠預測轉移性NSCLC（Ⅳ期）對帕博利珠單抗的反應。共有30例接受pembrolizumab治療的患者在基線、第1個月和第4個月接受[18F]FDG PET/CT掃描，多變量基線iRADIOMICS在AUC、準確性預測能力方面均優于當前標準。
2.6 關鍵詞突顯分析
關鍵詞突顯研究分析能了解到該研究領域的研究前沿，對于總結預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域近年來的研究方向并推斷未來研究熱點有著重要作用。運行CiteSpace軟件，以0.2的γ值進行突顯分析，得到前21個突顯詞；見圖4，圖中紅色條帶代表該關鍵詞在相對應的時間段內被引的次數突然增加。從2019年持續至今，特征（signature）、預后價值（prognostic significance）、淋巴細胞（lymphocyte）、DNA、聯合（combination）、預后（prognosis）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA）、敏感性（sensitivity）是預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域的熱點與前沿。
圖4
前21個研究主題突顯詞
2.7 被引文獻
WoS數據庫篩選出的相關文獻總計426篇文獻，共被引用10 174次，平均每篇文獻被引用24次，被引文獻排名前10名文獻如表4。
表4
共被引排名前10的文獻
3 討論
近年來，在肺癌高發生率、高死亡率的背景下，轉化醫學的顯著進步使人們更好地了解腫瘤發展背后的機制以及與腫瘤微環境的相互作用。關于ICI 的治療方案的實施以及更加精準的預測ICI 反應的多變量平臺的創建，依然面臨著考驗。盡管如此，腫瘤學家、病理學家、遺傳學家、核醫學醫師甚至包括生物醫學工程師們之間持續的臨床和科學合作可能是開發組織中循環和體內生物標志物綜合評估的關鍵，期望充分提高我們對ICI 反應預測的能力，最終改善患者選擇，以獲得更加精準的個性化免疫治療方案。
目前尚無關于此主題的文獻可視化分析，本研究首次使用CiteSpace軟件對WoS核心合集數據庫中有關預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究文獻進行系統分析，發現2017—2021年來該領域發文量呈穩步增加的趨勢，有越來越多的雜志在刊登該領域的研究文獻，體現該領域研究受到越來越多的青睞。研究熱點關鍵詞為PD-L1表達、腫瘤突變負荷、EGFR、腫瘤微環境、循環腫瘤DNA、液體活檢、CD8+ T Cell、[18F]FDG PET/CT、生物信息學、影像組學等。
隨著分析技術的持續發展，對敏感性、預后價值更高的免疫治療生物標志物的研究的逐漸重視，研究者們對腫瘤微環境及CTC、cfDNA等對免疫治療的影響有了更充分地認識。未來將CTC以及cfDNA進行液體活檢、腫瘤微環境研究、影像組學分析等多生物標志物聯合起來，對NSCLC患者體內淋巴細胞的免疫狀態以及病灶特征等腫瘤相關信息進行更加精準的評估可能是該領域研究的熱點及前沿，從而為患者提供個性化的治療方案，包括藥物的種類、治療方式的選擇等方面，切實提高患者免疫治療的預后。
綜上所述，本研究通過對WoS核心合集數據庫中有關預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究文獻進行系統分析，初步呈現了近5年該領域的研究動態，預測了未來可能的研究熱點與前沿，希望能夠為國內該領域學者的研究提供一定的參考。
利益沖突：無。
作者貢獻：史宏燦負責課題研究設計及文章指導；孫飛、單一波收集文獻資料；盧毅、朱劍煒分析處理數據；袁磊、沈志明負責綜合整理及文章撰寫。
肺癌是最常見的腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因[1-2]，大多數肺癌 （80%～90%）是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），最常在疾病晚期（65%）時被診斷出來，并可能已經出現局部或遠處轉移[3]。最近應用免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）的免疫療法正在有效地改善NSCLC患者的預后[4]，但是并非所有患者都能從免疫治療中獲益[5]，反映出需要更多地研究能夠預測免疫反應的生物標志物，可以監測體內的物質、結構或過程產物等[6]，從而預測免疫治療臨床反應。
CiteSpace軟件是由美國德雷塞爾大學（Drexel University，Philadelphia，PA，USA）陳超美團隊開發的文獻計量學分析工具[7]，能夠對學術數據庫的數據進行定量分析，從而了解該研究領域的研究動態。本研究首次通過CiteSpace對預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域的熱點及趨勢進行可視化分析，希望為國內學者的研究提供參考。
1 資料與方法
1.1 數據采集
選取Web of Science（WoS）核心合集數據庫作為文獻檢索平臺，檢索時間為2017—2021年，檢索方式均為主題詞，檢索式：TS=（（“non-small lung cancer”or “NSCLC”）and “predict*”and（“response”or “efficacy”）and “immunotherapy”and “biomarker*”），文獻類型為論著和綜述，共檢索出426篇文獻。
1.2 統計學分析
將在WoS核心合集數據庫檢索到的426篇文獻的全紀錄與引用的參考文獻以Text的格式導出，包括298篇論著、128篇綜述。通過CiteSpace 6.1.R2（64-bit）對文獻的國家、機構、作者、關鍵詞、被引文獻等進行全面分析。
2 結果
2.1 WoS核心合集數據庫年度發文量
檢索到匹配的文獻共426篇，發文量呈現逐年遞增趨勢（圖1），年平均發文量約為85篇。結果顯示，預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究在逐漸得到重視。
圖1
發文數量的年度分析
2.2 來源期刊分布情況
篩選出的426篇預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究的外文文獻被146個期刊收錄，其中發文量位居前10的期刊的JCR分區、發文量、影響因子及數量占比等內容詳見表1。
表1
發文量排名前10的期刊
2.3 國家機構合作可視化
運行CiteSpace軟件，選擇國家分析，得到知識圖譜共41個節點，99條連線（圖2），圖中每個圓形節點代表一個國家，圓形節點的大小反映國家發文數量多少，節點之間的連線代表國家間的合作關系，連線的粗細反映合作關系的緊密程度，節點的不同顏色代表不同的年代[8]，紫色圈的大小反映國家的影響力中心值。表2顯示發文量排名前5名的機構，分別是上海交通大學、華中科技大學、德克薩斯大學安德森癌癥中心、中山大學、中國醫學科學院北京協和醫學院。圖2及表2反映出我國研究者在該研究領域做出了一定的貢獻，與美國相比，雖然發文量領先，但在中心值上仍有較大差距，需要我們更多的與他國合作，擴大自身的影響力。
圖2
國家可視化圖譜
表2
發文量前5的機構
2.4 作者合作可視化
運行CiteSpace軟件，通過WoS 數據庫篩選出的文獻，對該領域的作者團隊合作網絡進行共現分析，該研究領域發文量前5的作者及其所屬機構見表3。
表3
發文量前5的作者
2.5 關鍵詞共現分析
關鍵詞的相關分析作為可視化分析圖譜中最具有指導性的內容，對明確該領域研究熱點及前沿至關重要。運行CiteSpace軟件，節點類型采用作者關鍵詞，得到294個節點、793條連線的關鍵詞共現圖譜（圖3）。去除其中部分與檢索策略重復的主題詞，分析該領域關鍵詞的共現頻次及其中心值可知，熱點關鍵詞為PD-L1 expression（programmed cell death 1 ligand 1，細胞程序性死亡配體1表達）、tumor mutational burden（腫瘤突變負荷）、EGFR mutation（表皮生長因子受體突變）、Tumor microenvironment（腫瘤微環境）、circulating tumor DNA（循環腫瘤DNA）、liquid biopsy（液體活檢）、tumor-infiltrating lymphocyte（腫瘤浸潤淋巴細胞）、neutrophil-to-lymphocyte ratio （中性粒細胞/淋巴細胞比值）、CD8+ T Cell、[18F]FDG PET/CT、immune-related adverse events（irAEs 免疫相關不良反應）、computational biology（生物信息學）、radiomic（影像組學）等。
圖3
關鍵詞可視化圖譜
尋找ICI的臨床獲益指標涉及到從傳統的病理學到分子生物學的各個領域。隨著基因測序平臺的技術進步和分析復雜數據集的生物信息學工具的可用性，研究學者們已經在腫瘤細胞、血液和健康組織中，甚至在細胞和分子水平上對假定的反應生物標志物進行了探索。根據所提取出的高頻重點關鍵詞的內容進行了梳理和總結，得出了目前的研究熱點主要集中于腫瘤相關生物標志物、腫瘤微環境相關生物標志物、宿主相關生物標志物、影像組學相關生物標志物這幾個方面。
2.5.1 腫瘤相關生物標志物
2.5.1.1 PD-L1 腫瘤細胞陽性比例分數（tumor proportion score，TPS）
PD-L1 表達是開發的第一個反應生物標志物，也是迄今為止Ⅳ期無驅動基因突變的非小細胞肺癌患者指導治療的首要選擇[9]。目前臨床上使用免疫組織化學方法對腫瘤標本進行 PD-L1 TPS評估存在一些局限性：即使在同一腫瘤病變，它在組織中的表達在時間和空間上是高度可變的。在臨床實踐中，該標志物的效用也有限，因為不表達 PD-L1 的患者可能對 PD-1 或 PD-L1 檢查點抑制劑有反應，相比而言，一些 PD-L1 表達升高的患者卻并未從這些藥物中受益。Yu 等[10]的研究顯示在接受過全外顯子組測序的NSCLC患者中，腫瘤突變負荷結合PD-L1表達的聯合使用與單獨的PD-L1表達相比具有較高的預測價值，包括對無進展生存期、免疫治療完全反應、部分反應預測方面，總結出組織中 PD-L1 表達和腫瘤突變負荷的聯合使用是評估患者存活率和免疫治療反應的具有前景的生物標志物。綜合考慮，PD-L1 表達在單獨使用時是一種弱生物標志物，需要尋找用于綜合評估的更好的選擇。
2.5.1.2 腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）
TMB被定義為癌癥基因組編碼部分內非同義突變的數量，當使用靶向二代測序平臺進行評估時，TMB 被視為可用于新抗原負載的最佳替代物[11]。作為較新的候選生物標志物，與 PD-L1 TPS 相比，前瞻性驗證的結果很少，而且結論往往不一致。值得注意的是，有研究顯示高 TMB 患者的免疫治療無進展生存期獲益與 PD-L1 表達無關[12]。然而基于 KEYNOTE-158 試驗預先計劃的回顧性分析的總體反應率[13]，2020年6月，美國食品藥品監督管理局批準了帕博利珠單抗（pembrolizumab）應用于在一線化療失敗時，晚期實體瘤且組織 TMB 高的患者（≥每兆堿基10個突變，使用 FoundationOneCDx 或 MSK-IMPACT 測定評估）。此外，通過對腫瘤和免疫細胞的分析，發現克隆 TMB（即每個癌細胞中非同義突變的數目）在預測對 ICI 的敏感性方面優于TMB[14]，所以仍需要在大規模前瞻性試驗中進行驗證TMB作為免疫治療療效預測生物標志物的價值。
2.5.2 腫瘤微環境相關生物標志物
2.5.2.1 T淋巴細胞浸潤
腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是由腫瘤、基質和腫瘤浸潤免疫細胞的有機復合體組成的，其中T淋巴細胞浸潤涉及多種細胞類型和細胞因子的復雜網絡，是免疫識別的標志。大量研究表明，活化的 CD8+T 細胞是參與抗腫瘤免疫的主要參與者，在一部分腫瘤中，癌細胞會通過表達諸如PD-L1等與抑制性檢查點結合的配體來抑制CD8+細胞毒性T細胞的激活，這被認為是癌細胞免疫逃逸的一個重要機制[15]。TME 免疫細胞上的 PD-L1 表達，包括骨髓細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞）和 T 細胞[16]，似乎與 ICI 反應的相關性比腫瘤細胞上的表達更相關[17]。然而在 NSCLC 臨床實踐中，組織學表征 T 淋巴細胞浸潤的一個限制是腫瘤組織的稀缺，這影響了對T淋巴細胞在影響 ICI 反應方面的深入了解。
2.5.2.2 癌癥相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）
成纖維細胞在器官形成和組織結構、功能的完整性中起著重要的作用。CAF通過有效的免疫抑制活性在腫瘤的起始、進展、轉移和治療耐藥性中發揮關鍵作用[18]。CAF 標志物主要與 T 細胞免疫抑制相關，阻斷 CD8+T 細胞和自然殺傷細胞的作用，尤其是通過釋放各種趨化因子和細胞因子（主要是 IL-6 的產生），導致臨床治療結果不佳[19]。隨著CAF和TME對免疫細胞的作用以及對癌癥免疫療法效率影響的研究不斷深入，研究者們可以開發出針對這些目標的新型化合物，從而對為免疫治療提供了新的思路。
2.5.3 宿主相關生物標志物
2.5.3.1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）
CTC 是具有腫瘤特異性信息的完整活細胞，也可以用于癌癥診斷和治療評估。一些作者研究了基線CTC 與總生存率之間的關系，發現大量 CTC 與死亡和進展風險增加之間存在關聯[20]。此外，在 ICI 治療前存在 PD-L1 陽性表達的 CTC（≥ 1% 的細胞）與不良預后和生存相關[21]，ICI 治療 6 個月后CTC上 PD-L1 的持續存在可能代表腫瘤逃逸的發生，從而導致疾病進展。一些研究對CTC的PD-L1表達和組織中的PD-L1表達之間的一致性進行了評估[22]，但結果存在爭議，需要更多的研究來評估標準化的方法和 PD-L1 抗體來檢測和分析 CTC。
2.5.3.2 循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）
cfDNA是目前臨床實踐中最具潛力的生物標志物，其半衰期較短，約為2 h，可以快速評估腫瘤相關變化，并能夠實時監測反應或復發。據報道[23]，cfDNA含量的變化是評估接受抗 PD-1 藥物治療的患者的腫瘤反應的重要工具。Giroux Leprieur等[24]報道首次評估ICI反應時（2個月時）的低 cfDNA 含量患者與納武單抗（nivolumab）的長期獲益有關。同時也有研究[25]發現cfDNA 含量的降低可能與對免疫療法的療效息息相關，表明 cfDNA 含量可能是治療效果評估的早期生物標志物，并能預測接受ICI治療的NSCLC患者的生存期是否有可能延長。在另一項研究[26]中，接受納武單抗治療且cfDNA 低于中值（3 mL血漿中836.5 ng）的 NSCLC 患者的存活時間明顯長于cfDNA 值高于中值的患者。此外，cfDNA和CTC的聯合分析有助于區分可能在繼續使用納武單抗中受益的低風險人群。這表明，聯合使用cfDNA和CTC可以幫助選擇那些從免疫治療中獲益最多的患者。
2.5.3.3 中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）
許多研究報告了免疫療法與NLR之間的相關性[27]。NLR可視為對不同壓力刺激的免疫反應的標志物，有研究者發現在接受 ICI 治療的 NSCLC患者中，高 NLR 值與較短的無進展生存期和總生存期相關[28]。近來一項針對 NSCLC 患者的研究發現NLR與人類白細胞DR抗原（Human leukocyte antigen DR，HLA-DR）單核細胞和樹突狀細胞的 ICI 反應之間的可能關聯。在使用 ICI 后，中性粒細胞/淋巴細胞比率和 HLA-DR 單核細胞頻率降低以及樹突狀細胞的增加，對ICI的反應和更長的OS起到了預測作用[29]。雖然NLR很容易從常規血細胞計數中評估并且是可重復的，但仍需等待具有臨床意義的閾值以進行前瞻性驗證。
2.5.3.4 外泌體
細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是納米尺寸的顆粒，可以由任何細胞類型（包括癌細胞）釋放。EV最常見的亞型是外泌體，其表面表達蛋白質并含有多種顆粒，例如核酸和脂質等[30]。腫瘤來源的外泌體同時攜帶免疫抑制和免疫刺激介質，并可能參與各種免疫調節作用,它保留了部分腫瘤母體細胞的特征[31]，因此，外泌體也是分析預后、預測治療反應的一種有前景的生物標志物。一項針對 NSCLC 患者的研究得出結論，外泌體中的 PD-L1 表達與疾病進展、腫瘤大小、淋巴結狀態、轉移和TNM分期相關。然而，外泌體和組織中的 PD-L1 表達之間沒有關聯[32]。總之識別腫瘤來源的外泌體并了解其對腫瘤發生和免疫治療反應的貢獻以及其分離方法的標準化仍然是面臨著挑戰。
2.5.4 影像組學
影像學研究是非侵入性的，幾乎所有癌癥患者在他們的診斷和治療過程中都會接受影像檢查，這使得這些類型的數據更加普遍，更重要的是影像學研究可以分析腫瘤的完整空間結構，從而避免穿刺活檢取樣的限制[33]。影像組學[34]（radiomics）作為人工智能時代的產物，能夠高通量地提取肺部圖像的定量特征，挖掘腫瘤的生物學信息[35]。這些新方法可以對肺癌病史的不同方面以及階段進行評估，能夠區分癌癥的組織學亞型，特別是腺癌和鱗狀細胞癌，預測EGFR突變狀態或PD-L1 表達以進行NSCLC 患者的風險分層，從而預測對不同類型療法的反應[36]。蔣等人的一項研究[37]探討了[18F]FDG PET/CT圖像中影像組學特征在評估399個NSCLC中不同PD-L1突變狀態的潛在價值，包含來自CT，PET和PET/CT圖像的影像組學特征的模型分別計算出受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）中曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.97，0.61和0.97，說明了基于影像組學的預測方法，特別是CT衍生的預測模型，可以相對準確地預測NSCLC患者的PD-L1表達狀態。Valentinuzzi等[38]創建了一個影像組學特征（iRADIOMICS），與臨床標準（iRECIST和PD-L1免疫組化）相比，能夠預測轉移性NSCLC（Ⅳ期）對帕博利珠單抗的反應。共有30例接受pembrolizumab治療的患者在基線、第1個月和第4個月接受[18F]FDG PET/CT掃描，多變量基線iRADIOMICS在AUC、準確性預測能力方面均優于當前標準。
2.6 關鍵詞突顯分析
關鍵詞突顯研究分析能了解到該研究領域的研究前沿，對于總結預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域近年來的研究方向并推斷未來研究熱點有著重要作用。運行CiteSpace軟件，以0.2的γ值進行突顯分析，得到前21個突顯詞；見圖4，圖中紅色條帶代表該關鍵詞在相對應的時間段內被引的次數突然增加。從2019年持續至今，特征（signature）、預后價值（prognostic significance）、淋巴細胞（lymphocyte）、DNA、聯合（combination）、預后（prognosis）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA）、敏感性（sensitivity）是預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究領域的熱點與前沿。
圖4
前21個研究主題突顯詞
2.7 被引文獻
WoS數據庫篩選出的相關文獻總計426篇文獻，共被引用10 174次，平均每篇文獻被引用24次，被引文獻排名前10名文獻如表4。
表4
共被引排名前10的文獻
3 討論
近年來，在肺癌高發生率、高死亡率的背景下，轉化醫學的顯著進步使人們更好地了解腫瘤發展背后的機制以及與腫瘤微環境的相互作用。關于ICI 的治療方案的實施以及更加精準的預測ICI 反應的多變量平臺的創建，依然面臨著考驗。盡管如此，腫瘤學家、病理學家、遺傳學家、核醫學醫師甚至包括生物醫學工程師們之間持續的臨床和科學合作可能是開發組織中循環和體內生物標志物綜合評估的關鍵，期望充分提高我們對ICI 反應預測的能力，最終改善患者選擇，以獲得更加精準的個性化免疫治療方案。
目前尚無關于此主題的文獻可視化分析，本研究首次使用CiteSpace軟件對WoS核心合集數據庫中有關預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究文獻進行系統分析，發現2017—2021年來該領域發文量呈穩步增加的趨勢，有越來越多的雜志在刊登該領域的研究文獻，體現該領域研究受到越來越多的青睞。研究熱點關鍵詞為PD-L1表達、腫瘤突變負荷、EGFR、腫瘤微環境、循環腫瘤DNA、液體活檢、CD8+ T Cell、[18F]FDG PET/CT、生物信息學、影像組學等。
隨著分析技術的持續發展，對敏感性、預后價值更高的免疫治療生物標志物的研究的逐漸重視，研究者們對腫瘤微環境及CTC、cfDNA等對免疫治療的影響有了更充分地認識。未來將CTC以及cfDNA進行液體活檢、腫瘤微環境研究、影像組學分析等多生物標志物聯合起來，對NSCLC患者體內淋巴細胞的免疫狀態以及病灶特征等腫瘤相關信息進行更加精準的評估可能是該領域研究的熱點及前沿，從而為患者提供個性化的治療方案，包括藥物的種類、治療方式的選擇等方面，切實提高患者免疫治療的預后。
綜上所述，本研究通過對WoS核心合集數據庫中有關預測NSCLC免疫治療療效的生物標志物研究文獻進行系統分析，初步呈現了近5年該領域的研究動態，預測了未來可能的研究熱點與前沿，希望能夠為國內該領域學者的研究提供一定的參考。
利益沖突：無。
作者貢獻：史宏燦負責課題研究設計及文章指導；孫飛、單一波收集文獻資料；盧毅、朱劍煒分析處理數據；袁磊、沈志明負責綜合整理及文章撰寫。
