引用本文： 溫曉曉, 張坤, 潘孔榮, 汪文濤, 潘文志. 一種非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料的生物相容性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(12): 1653-1659. doi: 10.7507/1007-4848.202112069 復制
心臟瓣膜疾病是一種具有高發病率的心血管疾病。據統計，我國心臟瓣膜疾病的加權患病率為3.8%，約有2 500萬患者[1]。由于心臟瓣膜的特殊位置，目前尚無有效的治療藥物，往往需要進行心臟瓣膜置換。用于置換手術的人工瓣膜假體分為機械瓣膜和生物瓣膜，與機械瓣膜相比，生物瓣膜具有更好的血流動力學性能，且不需終身抗凝，患者具有更好的生活質量[2-3]。目前商品化的生物瓣膜往往是采用戊二醛處理的異種生物組織，戊二醛作為一種高效水溶性二元醛，能夠與蛋白質的胺基反應形成交聯，提高生物組織材料的強度和抗酶解性，同時還具有降低材料免疫原性、病毒滅活、滅菌及作為液體環境長期保存生物瓣葉材料的作用[4-8]。然而戊二醛交聯后產生的殘留醛基具有細胞毒性并且會加速鈣化進程，最終可能導致生物瓣膜衰敗[9]。因此，開發全新的非戊二醛化學處理體系，制備具有更好生物相容性的生物瓣膜，成為當前研究熱點之一。目前已有采用碳二亞胺（carbodiimide，EDC）[10-12]、京尼平[13-14]、環氧化物[15-16]等各種非戊二醛交聯劑處理生物組織的相關研究，但是僅替換新的交聯劑并不能在整個處理體系中完全替代戊二醛的作用并達到最優的處理效果。我們在EDC交聯的基礎上，開發了一整套非戊二醛處理技術，采用經過優化的EDC復合交聯處理，在保證最好交聯效果的同時讓材料保持較好的柔韌性能；采用除原體細胞處理技術，進一步降低材料免疫原性，提高抗鈣化性能；同時還采用超臨界流體病毒滅活、抗氧化及超低溫真空干燥、氣體滅菌等一系列新處理技術，在完全替代戊二醛作用的同時，實現了瓣膜材料的干燥保存，從而獲得具有更好生物相容性、抗鈣化性能和耐久性的瓣膜材料。
盡管已有許多研究證明單純EDC交聯的生物材料具有良好的生物相容性，但目前尚未有基于一整套全新的非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料的生物相容性研究。本文從體外細胞毒性、皮膚致敏、皮內反應、急性毒性和亞慢性全身毒性幾方面對制備的生物瓣膜材料進行了初步的生物相容性評估，為其在臨床瓣膜置換中的應用提供參考。
1 實驗材料與方法
1.1 實驗樣品
基于非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料由沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司提供。新鮮牛心包剝離脂肪組織后，清洗數次，固定于定制模具中，經復合交聯、除原體細胞、超臨界流體病毒滅活、抗氧化及超低溫真空干燥、氣體滅菌處理后備用。
1.2 實驗動物
哈特蘭豚鼠，300.0～500.0 g，來源于上海甲干生物科技有限公司，許可證號SCXK（滬）2020-0006；新西蘭大白兔，不低于2.0 kg，來源于蘇州高新區鎮湖實驗動物科技有限公司，許可證號SCXK（蘇）2020-0007；ICR小鼠，18.0～19.5 g，SD大鼠，181.0～207.6 g，均來源于上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2018-0004。
1.3 實驗試劑
主要實驗試劑包括：噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司），胎牛血清（Corning公司），MEM培養基（HyClone公司），異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），弗氏完全佐劑（Sigma公司），十二烷基硫酸鈉（羅恩試劑），0.9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業有限公司），棉籽油（北京百靈威科技有限公司）。
1.4 實驗方法
1.4.1 體外細胞毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以含10%胎牛血清的MEM培養液為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。陰性對照為高密度聚乙烯，陽性對照為二乙基二硫代氨基甲酸鋅。將1×105/mL的L929細胞懸液接種至96孔板，培養24 h后吸去原來培養液，分別加入100 μL 100%、75%、50%、25%的樣品浸提液，以及空白對照、陽性對照和陰性對照液，培養24 h后，吸去培養液，每孔加入50 μL MTT（1 mg/mL），孵育2 h后棄去上清，加入100 μL異丙醇溶解結晶，在酶標儀上以570 nm為主吸收波長，650 nm為參考波長測定吸光度（optical density，OD）。按照下式計算細胞活力：
細胞活力（%）=（OD570?OD650）樣品組/（OD570?OD650）空白對照組×100%
1.4.2 皮膚致敏實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。陰性對照為生理鹽水。取15只豚鼠，隨機分為2組：實驗組10只，對照組5只。在皮內誘導階段，在每只動物肩胛骨內側部位成對皮內注射0.1 mL受試液。注射液分別為：溶液1（弗氏完全佐劑與生理鹽水以50∶50體積比例混合的穩定性乳化劑）、溶液2（實驗組為樣品浸提液，對照組為生理鹽水）、溶液3（溶液1與溶液2以50∶50體積比例混合）。注射6 d后，在實驗區皮膚按摩導入10%的十二烷基硫酸鈉，24 h后，將浸透了0.5 mL受試液的8 cm2大小的紗布貼敷于誘導注射部位48 h。14 d后，將0.5 mL受試液浸透后的2.5 cm×2.5 cm的紗布貼敷于誘導階段未實驗部位24 h。貼敷結束后24 h和48 h觀察實驗部位，根據Magnusson和Kligman分級標準對皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級；見表1。如果對照組動物等級<1，而實驗組等級≥1則提示致敏。
表1
Magnusson和Kligman分級
1.4.3 皮內反應實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。取3只新西蘭大白兔，在兔背一側5個點作為實驗部位，注射0.2 mL樣品浸提液作為實驗部位；兔背另一側5個點作為對照部位，注射0.2 mL生理鹽水。觀察即時、24 h、48 h和72 h注射局部及周圍組織反應，根據標準GB/T 16886.10-2017中皮膚反應記分系統對紅斑、焦痂和水腫反應進行記分；見表2。將每只動物在每一規定時間的計分相加后再除以15即為每只動物的記分，3只實驗動物記分的平均數即為平均記分。實驗樣品的平均記分減去對照樣品的平均記分即為實驗樣品的最終記分。
表2
皮內刺激反應計分（分）
1.4.4 急性全身毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，分別以生理鹽水和植物油為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液，并分別以生理鹽水和植物油作為陰性對照。取20只ICR小鼠，隨機分為4組，每組5只：實驗組（極性介質），尾靜脈注射生理鹽水浸提液；對照組（極性介質），尾靜脈注射生理鹽水；實驗組（非極性介質），腹腔注射植物油浸提液；對照組（非極性介質），腹腔注射植物油。觀察即時、4 h、24 h、48 h和72 h注射局部及周圍組織反應，在24 h、48 h和72 h對動物稱重，并根據標準GB/T 16886.11-2011中常見臨床癥狀與觀察項目對動物的毒性表現進行記錄。
1.4.5 亞慢性全身毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。取40只SD大鼠，實驗組和對照組各20只，雌雄各半，按10 mL/kg的劑量進行尾靜脈注射，實驗組注射樣品浸提液，對照組注射生理鹽水，連續28 d，第28 d所有動物禁食，每日觀察動物狀態，記錄每周及禁食前后動物體重。第29 d，將動物稱重，收集血液標本，進行血液和血生化分析。無痛處死所有動物，取心、胸腺、肝、脾、腎、腎上腺、性腺和腦組織稱濕重。對動物的心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、腸、性腺等主要臟器進行解剖觀察。
1.5 統計學分析
數據統計采用SAS 6.12軟件包進行，數據經正態性檢驗后，服從正態分布的數據以均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究動物實驗通過蘇州大學衛生與技術研究所倫理審查，實驗編號M202005387-2，SDWH-M202005387-3，實驗操作符合實驗動物倫理原則。
2 結果
2.1 體外細胞毒性
采用MTT法檢測非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料細胞毒性。陰性對照組細胞活力為100.3%，陽性對照組細胞活力為22.2%；100%實驗樣品浸提液的細胞活力為75.2%，滿足標準GB/T 16886.5-2017要求的實驗樣品細胞活力>70.0%，表明實驗樣品浸提液對L929細胞無潛在毒性影響；50%實驗樣品浸提液細胞活力為94.9%，符合評價標準要求的實驗樣品50%浸提液的細胞活力比100%浸提液的細胞活力高；見表3。
表3
體外細胞毒性實驗結果（
，n=6）
2.2 皮膚致敏實驗
采用豚鼠最大劑量實驗，評價非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料潛在的皮膚致敏反應。實驗組和對照組在各觀察時間點的皮膚反應計分均為0，實驗樣品浸提液在豚鼠皮膚未發現皮膚致敏反應，致敏陽性率為0.0%。根據標準GB/T16886.10-2017，可以判定樣品無潛在的皮膚致敏反應；見表4。
表4
皮膚致敏實驗結果
2.3 皮內反應實驗
通過皮內注射方法，評價非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料潛在的皮內刺激反應。實驗樣品組浸提液皮內反應未超過對照組，實驗組和對照組平均計分均為0分；實驗過程中動物未出現異常癥狀或死亡。實驗組平均計分減去對照組平均計分為最終計分，結果符合標準GB/T 16886.10-2017要求的實驗樣品最終計分不大于1分。
2.4 急性全身毒性實驗
急性全身毒性實驗前后的小鼠體重變化觀察結果見表5。在72 h觀察期內，無論是生理鹽水浸提還是植物油浸提，實驗組和對照組小鼠體重均穩定增長，差異均無統計學意義（P＞0.05）。實驗組和對照組小鼠均未觀察到臨床毒性癥狀，實驗組小鼠反應不大于對照組，根據標準GB/T 16886.11-2011，表明非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料無急性全身毒性。
表5
急性全身毒性實驗前后小鼠體重變化（n=5，g）
2.5 亞慢性全身毒性實驗
觀察期內，所有動物實驗局部和全身均未觀察到臨床毒性癥狀。各時間點的實驗組和對照組大鼠體重、主要器官重量、血常規和血生化數據差異均無統計學意義（P＞0.05）；見表6～9。解剖觀察發現實驗組和對照組的主要臟器均未見異常表現。根據標準GB/T 16886.11-2011，結果表明非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料無明顯的亞慢性全身毒性。
表6
大鼠體重（n=10，g）
表7
大鼠器官重量（n=10，g）
表8
大鼠血常規數據（n=10）
表9
大鼠血生化數據 （n=10）
3 討論
牛心包作為生物瓣膜材料已有著數十年的應用歷史。為了將此種材料應用于臨床，需要采用交聯劑在牛心包膠原纖維之間建立化學交聯并進行滅病毒、滅菌等處理，以提高其抗酶解性，保證其結締組織的完整性，并降低其抗原性。戊二醛是應用最為廣泛的制備生物瓣膜材料的試劑，能夠橋接不同多肽鏈上賴氨酸或羥賴氨酸殘基上的氨基，在牛心包組織中形成分子間或分子內的交聯，并且也能很好地滅病毒、滅菌。然而，戊二醛處理后可能導致瓣膜材料異位鈣化，并且由于其毒性導致對宿主組織的適應性降低[17-18]。戊二醛可直接誘導細胞死亡和細胞碎片形成，而細胞碎片又會成為鈣化的病灶；此外，不完全與組織蛋白結合的戊二醛也會產生具有細胞毒性的醛基殘留物，這也可以誘導鈣化形成[9, 19]。為克服戊二醛的不足，研究者已進行各種非戊二醛交聯劑的開發，EDC即是其中研究較為廣泛的一種。EDC可以與牛心包膠原中的羧基發生反應，生成O-酰基異脲中間體，在N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）作用下可以形成更穩定的活性酯結構，繼而與氨基發生反應形成酰胺鍵，過程中EDC、NHS不會成為交聯化學鍵的一部分，中間產物可以釋放出來并被清洗掉，具有較小的細胞毒性[20]。有研究比較了EDC和戊二醛交聯對牛心包性能的影響，兩種交聯劑均能提高牛心包對膠原酶降解和溴化氰化學降解的抗性，但在熱變性后，經EDC處理的組織對膠原酶的抗性略強于戊二醛處理，對胰蛋白酶的抗性則明顯強于戊二醛處理組織。在抗鈣化性能方面，有研究[21]表明，EDC交聯的豬主動脈瓣在植入大鼠皮下30 d后，與戊二醛交聯相比，組織鈣化程度明顯降低。但是，單純的EDC交聯不能完全替代戊二醛的病毒滅活和殺菌作用，同時由于EDC屬于零長度交聯，經單純EDC處理后的心包相對天然瓣葉具有較強的硬度，由其制作而成的瓣葉容易應力集中，動態響應略差。因此，我們基于優化的EDC復合處理開發了一整套非戊二醛處理技術以獲得具有良好生物相容性、耐久性和抗鈣化性能的生物瓣膜材料。為了保證非戊二醛體系處理技術在臨床使用中的安全性，有必要對該技術處理的生物瓣膜材料的生物相容性進行系統性評估。本研究通過體外細胞毒性、皮膚致敏、皮內反應、急性毒性和亞慢性全身毒性實驗評價了基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料的生物相容性。
體外細胞毒性結果顯示，L929細胞在基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料浸提液中生長良好，材料無潛在細胞毒性。相關研究也表明EDC交聯膠原能夠支持成骨細胞生長[22]，血管內皮細胞在EDC交聯的豬主動脈瓣材料上也能夠良好增殖[21]，提示EDC交聯生物材料具有良好的細胞相容性。另一方面，有研究[23-25]表明，戊二醛交聯的牛心包或豬心包具有明顯的細胞毒性，在相關材料浸提液中的L929細胞活性受到明顯抑制。這可能是由于EDC分子不會參與到實質交聯中，不易產生因為交聯劑殘留而導致的細胞毒性，而戊二醛則可能形成不穩定的聚合體長期存在于交聯組織間隙中，導致潛在的細胞毒性。
生物瓣膜作為永久植入的醫療器械，必須對其可能引起的接觸性危害進行評價。本研究中皮膚致敏和皮內反應實驗結果表明，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會導致潛在的皮內刺激和皮膚致敏反應。而有研究[25]表明，戊二醛交聯牛心包材料的生理鹽水浸提液則會產生陽性刺激反應。
生物材料在植入體內后可能產生的溶出物有可能導致全身毒性反應。本研究先采用極性和非極性浸提液注射評價急性全身毒性反應，然后又通過生理鹽水浸提液連續給樣28 d，結合大鼠體重、血常規、血生化和組織病理學檢測指標，對亞慢性全身毒性反應進行綜合評價。結果表明，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會導致潛在的急性和亞慢性全身毒性反應。另一方面，有研究[25]表明小鼠靜脈注射戊二醛交聯牛心包的生理鹽水浸提液后，會產生異常反應和死亡。戊二醛的毒性作用已在各種研究中得到證明，采用戊二醛交聯的生物瓣膜材料在植入前一般均需要徹底清洗，或采用中和試劑進行解毒處理。相比之下，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會引起明顯的毒性反應，在臨床應用中具有較大潛力。
綜上所述，非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料無細胞毒性、無致敏性和刺激性、無急性和亞慢性全身毒性，具有良好的生物相容性，符合國家相關標準。本研究為非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料在臨床瓣膜置換中的應用奠定了一定的理論和實驗基礎，但尚不足以識別材料作為醫療器械部件在整個壽命期內所有潛在的生物危害，后續將針對材料的遺傳毒性、血液相容性、生殖/發育毒性以及致癌性等作進一步的深入研究。
利益沖突：溫曉曉、張坤、潘孔榮、汪文濤為沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司在職員工，本研究由沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司資助，研究結果客觀公正。
作者貢獻：溫曉曉負責實驗設計與論文撰寫；張坤、汪文濤負責實驗執行與論文修改；潘孔榮、潘文志負責論文審閱與修改。
心臟瓣膜疾病是一種具有高發病率的心血管疾病。據統計，我國心臟瓣膜疾病的加權患病率為3.8%，約有2 500萬患者[1]。由于心臟瓣膜的特殊位置，目前尚無有效的治療藥物，往往需要進行心臟瓣膜置換。用于置換手術的人工瓣膜假體分為機械瓣膜和生物瓣膜，與機械瓣膜相比，生物瓣膜具有更好的血流動力學性能，且不需終身抗凝，患者具有更好的生活質量[2-3]。目前商品化的生物瓣膜往往是采用戊二醛處理的異種生物組織，戊二醛作為一種高效水溶性二元醛，能夠與蛋白質的胺基反應形成交聯，提高生物組織材料的強度和抗酶解性，同時還具有降低材料免疫原性、病毒滅活、滅菌及作為液體環境長期保存生物瓣葉材料的作用[4-8]。然而戊二醛交聯后產生的殘留醛基具有細胞毒性并且會加速鈣化進程，最終可能導致生物瓣膜衰敗[9]。因此，開發全新的非戊二醛化學處理體系，制備具有更好生物相容性的生物瓣膜，成為當前研究熱點之一。目前已有采用碳二亞胺（carbodiimide，EDC）[10-12]、京尼平[13-14]、環氧化物[15-16]等各種非戊二醛交聯劑處理生物組織的相關研究，但是僅替換新的交聯劑并不能在整個處理體系中完全替代戊二醛的作用并達到最優的處理效果。我們在EDC交聯的基礎上，開發了一整套非戊二醛處理技術，采用經過優化的EDC復合交聯處理，在保證最好交聯效果的同時讓材料保持較好的柔韌性能；采用除原體細胞處理技術，進一步降低材料免疫原性，提高抗鈣化性能；同時還采用超臨界流體病毒滅活、抗氧化及超低溫真空干燥、氣體滅菌等一系列新處理技術，在完全替代戊二醛作用的同時，實現了瓣膜材料的干燥保存，從而獲得具有更好生物相容性、抗鈣化性能和耐久性的瓣膜材料。
盡管已有許多研究證明單純EDC交聯的生物材料具有良好的生物相容性，但目前尚未有基于一整套全新的非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料的生物相容性研究。本文從體外細胞毒性、皮膚致敏、皮內反應、急性毒性和亞慢性全身毒性幾方面對制備的生物瓣膜材料進行了初步的生物相容性評估，為其在臨床瓣膜置換中的應用提供參考。
1 實驗材料與方法
1.1 實驗樣品
基于非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料由沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司提供。新鮮牛心包剝離脂肪組織后，清洗數次，固定于定制模具中，經復合交聯、除原體細胞、超臨界流體病毒滅活、抗氧化及超低溫真空干燥、氣體滅菌處理后備用。
1.2 實驗動物
哈特蘭豚鼠，300.0～500.0 g，來源于上海甲干生物科技有限公司，許可證號SCXK（滬）2020-0006；新西蘭大白兔，不低于2.0 kg，來源于蘇州高新區鎮湖實驗動物科技有限公司，許可證號SCXK（蘇）2020-0007；ICR小鼠，18.0～19.5 g，SD大鼠，181.0～207.6 g，均來源于上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2018-0004。
1.3 實驗試劑
主要實驗試劑包括：噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司），胎牛血清（Corning公司），MEM培養基（HyClone公司），異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），弗氏完全佐劑（Sigma公司），十二烷基硫酸鈉（羅恩試劑），0.9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業有限公司），棉籽油（北京百靈威科技有限公司）。
1.4 實驗方法
1.4.1 體外細胞毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以含10%胎牛血清的MEM培養液為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。陰性對照為高密度聚乙烯，陽性對照為二乙基二硫代氨基甲酸鋅。將1×105/mL的L929細胞懸液接種至96孔板，培養24 h后吸去原來培養液，分別加入100 μL 100%、75%、50%、25%的樣品浸提液，以及空白對照、陽性對照和陰性對照液，培養24 h后，吸去培養液，每孔加入50 μL MTT（1 mg/mL），孵育2 h后棄去上清，加入100 μL異丙醇溶解結晶，在酶標儀上以570 nm為主吸收波長，650 nm為參考波長測定吸光度（optical density，OD）。按照下式計算細胞活力：
細胞活力（%）=（OD570?OD650）樣品組/（OD570?OD650）空白對照組×100%
1.4.2 皮膚致敏實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。陰性對照為生理鹽水。取15只豚鼠，隨機分為2組：實驗組10只，對照組5只。在皮內誘導階段，在每只動物肩胛骨內側部位成對皮內注射0.1 mL受試液。注射液分別為：溶液1（弗氏完全佐劑與生理鹽水以50∶50體積比例混合的穩定性乳化劑）、溶液2（實驗組為樣品浸提液，對照組為生理鹽水）、溶液3（溶液1與溶液2以50∶50體積比例混合）。注射6 d后，在實驗區皮膚按摩導入10%的十二烷基硫酸鈉，24 h后，將浸透了0.5 mL受試液的8 cm2大小的紗布貼敷于誘導注射部位48 h。14 d后，將0.5 mL受試液浸透后的2.5 cm×2.5 cm的紗布貼敷于誘導階段未實驗部位24 h。貼敷結束后24 h和48 h觀察實驗部位，根據Magnusson和Kligman分級標準對皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級；見表1。如果對照組動物等級<1，而實驗組等級≥1則提示致敏。
表1
Magnusson和Kligman分級
1.4.3 皮內反應實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。取3只新西蘭大白兔，在兔背一側5個點作為實驗部位，注射0.2 mL樣品浸提液作為實驗部位；兔背另一側5個點作為對照部位，注射0.2 mL生理鹽水。觀察即時、24 h、48 h和72 h注射局部及周圍組織反應，根據標準GB/T 16886.10-2017中皮膚反應記分系統對紅斑、焦痂和水腫反應進行記分；見表2。將每只動物在每一規定時間的計分相加后再除以15即為每只動物的記分，3只實驗動物記分的平均數即為平均記分。實驗樣品的平均記分減去對照樣品的平均記分即為實驗樣品的最終記分。
表2
皮內刺激反應計分（分）
1.4.4 急性全身毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，分別以生理鹽水和植物油為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液，并分別以生理鹽水和植物油作為陰性對照。取20只ICR小鼠，隨機分為4組，每組5只：實驗組（極性介質），尾靜脈注射生理鹽水浸提液；對照組（極性介質），尾靜脈注射生理鹽水；實驗組（非極性介質），腹腔注射植物油浸提液；對照組（非極性介質），腹腔注射植物油。觀察即時、4 h、24 h、48 h和72 h注射局部及周圍組織反應，在24 h、48 h和72 h對動物稱重，并根據標準GB/T 16886.11-2011中常見臨床癥狀與觀察項目對動物的毒性表現進行記錄。
1.4.5 亞慢性全身毒性實驗
無菌條件下，取生物瓣膜樣品，以生理鹽水為浸提介質，37℃下浸提72 h，按照6 cm2/mL的浸提比例制備浸提液。取40只SD大鼠，實驗組和對照組各20只，雌雄各半，按10 mL/kg的劑量進行尾靜脈注射，實驗組注射樣品浸提液，對照組注射生理鹽水，連續28 d，第28 d所有動物禁食，每日觀察動物狀態，記錄每周及禁食前后動物體重。第29 d，將動物稱重，收集血液標本，進行血液和血生化分析。無痛處死所有動物，取心、胸腺、肝、脾、腎、腎上腺、性腺和腦組織稱濕重。對動物的心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、腸、性腺等主要臟器進行解剖觀察。
1.5 統計學分析
數據統計采用SAS 6.12軟件包進行，數據經正態性檢驗后，服從正態分布的數據以均數±標準差（±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究動物實驗通過蘇州大學衛生與技術研究所倫理審查，實驗編號M202005387-2，SDWH-M202005387-3，實驗操作符合實驗動物倫理原則。
2 結果
2.1 體外細胞毒性
采用MTT法檢測非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料細胞毒性。陰性對照組細胞活力為100.3%，陽性對照組細胞活力為22.2%；100%實驗樣品浸提液的細胞活力為75.2%，滿足標準GB/T 16886.5-2017要求的實驗樣品細胞活力>70.0%，表明實驗樣品浸提液對L929細胞無潛在毒性影響；50%實驗樣品浸提液細胞活力為94.9%，符合評價標準要求的實驗樣品50%浸提液的細胞活力比100%浸提液的細胞活力高；見表3。
表3
體外細胞毒性實驗結果（，n=6）
2.2 皮膚致敏實驗
采用豚鼠最大劑量實驗，評價非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料潛在的皮膚致敏反應。實驗組和對照組在各觀察時間點的皮膚反應計分均為0，實驗樣品浸提液在豚鼠皮膚未發現皮膚致敏反應，致敏陽性率為0.0%。根據標準GB/T16886.10-2017，可以判定樣品無潛在的皮膚致敏反應；見表4。
表4
皮膚致敏實驗結果
2.3 皮內反應實驗
通過皮內注射方法，評價非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料潛在的皮內刺激反應。實驗樣品組浸提液皮內反應未超過對照組，實驗組和對照組平均計分均為0分；實驗過程中動物未出現異常癥狀或死亡。實驗組平均計分減去對照組平均計分為最終計分，結果符合標準GB/T 16886.10-2017要求的實驗樣品最終計分不大于1分。
2.4 急性全身毒性實驗
急性全身毒性實驗前后的小鼠體重變化觀察結果見表5。在72 h觀察期內，無論是生理鹽水浸提還是植物油浸提，實驗組和對照組小鼠體重均穩定增長，差異均無統計學意義（P＞0.05）。實驗組和對照組小鼠均未觀察到臨床毒性癥狀，實驗組小鼠反應不大于對照組，根據標準GB/T 16886.11-2011，表明非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料無急性全身毒性。
表5
急性全身毒性實驗前后小鼠體重變化（n=5，g）
2.5 亞慢性全身毒性實驗
觀察期內，所有動物實驗局部和全身均未觀察到臨床毒性癥狀。各時間點的實驗組和對照組大鼠體重、主要器官重量、血常規和血生化數據差異均無統計學意義（P＞0.05）；見表6～9。解剖觀察發現實驗組和對照組的主要臟器均未見異常表現。根據標準GB/T 16886.11-2011，結果表明非戊二醛化學體系處理的牛心包生物瓣膜材料無明顯的亞慢性全身毒性。
表6
大鼠體重（n=10，g）
表7
大鼠器官重量（n=10，g）
表8
大鼠血常規數據（n=10）
表9
大鼠血生化數據 （n=10）
3 討論
牛心包作為生物瓣膜材料已有著數十年的應用歷史。為了將此種材料應用于臨床，需要采用交聯劑在牛心包膠原纖維之間建立化學交聯并進行滅病毒、滅菌等處理，以提高其抗酶解性，保證其結締組織的完整性，并降低其抗原性。戊二醛是應用最為廣泛的制備生物瓣膜材料的試劑，能夠橋接不同多肽鏈上賴氨酸或羥賴氨酸殘基上的氨基，在牛心包組織中形成分子間或分子內的交聯，并且也能很好地滅病毒、滅菌。然而，戊二醛處理后可能導致瓣膜材料異位鈣化，并且由于其毒性導致對宿主組織的適應性降低[17-18]。戊二醛可直接誘導細胞死亡和細胞碎片形成，而細胞碎片又會成為鈣化的病灶；此外，不完全與組織蛋白結合的戊二醛也會產生具有細胞毒性的醛基殘留物，這也可以誘導鈣化形成[9, 19]。為克服戊二醛的不足，研究者已進行各種非戊二醛交聯劑的開發，EDC即是其中研究較為廣泛的一種。EDC可以與牛心包膠原中的羧基發生反應，生成O-酰基異脲中間體，在N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）作用下可以形成更穩定的活性酯結構，繼而與氨基發生反應形成酰胺鍵，過程中EDC、NHS不會成為交聯化學鍵的一部分，中間產物可以釋放出來并被清洗掉，具有較小的細胞毒性[20]。有研究比較了EDC和戊二醛交聯對牛心包性能的影響，兩種交聯劑均能提高牛心包對膠原酶降解和溴化氰化學降解的抗性，但在熱變性后，經EDC處理的組織對膠原酶的抗性略強于戊二醛處理，對胰蛋白酶的抗性則明顯強于戊二醛處理組織。在抗鈣化性能方面，有研究[21]表明，EDC交聯的豬主動脈瓣在植入大鼠皮下30 d后，與戊二醛交聯相比，組織鈣化程度明顯降低。但是，單純的EDC交聯不能完全替代戊二醛的病毒滅活和殺菌作用，同時由于EDC屬于零長度交聯，經單純EDC處理后的心包相對天然瓣葉具有較強的硬度，由其制作而成的瓣葉容易應力集中，動態響應略差。因此，我們基于優化的EDC復合處理開發了一整套非戊二醛處理技術以獲得具有良好生物相容性、耐久性和抗鈣化性能的生物瓣膜材料。為了保證非戊二醛體系處理技術在臨床使用中的安全性，有必要對該技術處理的生物瓣膜材料的生物相容性進行系統性評估。本研究通過體外細胞毒性、皮膚致敏、皮內反應、急性毒性和亞慢性全身毒性實驗評價了基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料的生物相容性。
體外細胞毒性結果顯示，L929細胞在基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料浸提液中生長良好，材料無潛在細胞毒性。相關研究也表明EDC交聯膠原能夠支持成骨細胞生長[22]，血管內皮細胞在EDC交聯的豬主動脈瓣材料上也能夠良好增殖[21]，提示EDC交聯生物材料具有良好的細胞相容性。另一方面，有研究[23-25]表明，戊二醛交聯的牛心包或豬心包具有明顯的細胞毒性，在相關材料浸提液中的L929細胞活性受到明顯抑制。這可能是由于EDC分子不會參與到實質交聯中，不易產生因為交聯劑殘留而導致的細胞毒性，而戊二醛則可能形成不穩定的聚合體長期存在于交聯組織間隙中，導致潛在的細胞毒性。
生物瓣膜作為永久植入的醫療器械，必須對其可能引起的接觸性危害進行評價。本研究中皮膚致敏和皮內反應實驗結果表明，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會導致潛在的皮內刺激和皮膚致敏反應。而有研究[25]表明，戊二醛交聯牛心包材料的生理鹽水浸提液則會產生陽性刺激反應。
生物材料在植入體內后可能產生的溶出物有可能導致全身毒性反應。本研究先采用極性和非極性浸提液注射評價急性全身毒性反應，然后又通過生理鹽水浸提液連續給樣28 d，結合大鼠體重、血常規、血生化和組織病理學檢測指標，對亞慢性全身毒性反應進行綜合評價。結果表明，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會導致潛在的急性和亞慢性全身毒性反應。另一方面，有研究[25]表明小鼠靜脈注射戊二醛交聯牛心包的生理鹽水浸提液后，會產生異常反應和死亡。戊二醛的毒性作用已在各種研究中得到證明，采用戊二醛交聯的生物瓣膜材料在植入前一般均需要徹底清洗，或采用中和試劑進行解毒處理。相比之下，基于非戊二醛體系技術處理的牛心包生物瓣膜材料不會引起明顯的毒性反應，在臨床應用中具有較大潛力。
綜上所述，非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料無細胞毒性、無致敏性和刺激性、無急性和亞慢性全身毒性，具有良好的生物相容性，符合國家相關標準。本研究為非戊二醛化學體系處理的生物瓣膜材料在臨床瓣膜置換中的應用奠定了一定的理論和實驗基礎，但尚不足以識別材料作為醫療器械部件在整個壽命期內所有潛在的生物危害，后續將針對材料的遺傳毒性、血液相容性、生殖/發育毒性以及致癌性等作進一步的深入研究。
利益沖突：溫曉曉、張坤、潘孔榮、汪文濤為沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司在職員工，本研究由沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司資助，研究結果客觀公正。
作者貢獻：溫曉曉負責實驗設計與論文撰寫；張坤、汪文濤負責實驗執行與論文修改；潘孔榮、潘文志負責論文審閱與修改。
