引用本文： 范潔, 陶澤, 李恒, 楊芬, 楊浩, 盧曉風. PDGFRβ 靶向性近紅外熒光探針的制備及其在肺癌光學分子影像中的應用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(7): 841-848. doi: 10.7507/1007-4848.202104050 復制
醫學影像學是腫瘤無創診斷所依賴的主要手段[1]。近年來，隨著精準醫學理念的不斷深入發展，越來越多的分子影像技術被用于腫瘤的早期診斷和精準治療方案的選擇。事實上，腫瘤發生發展過程中，一些腫瘤相關分子的變化通常早于細胞和組織學水平的變化。因此，以識別這些腫瘤相關分子的特異性分子探針為基礎，借助特定的影像設備產生高分辨分子影像，進而實現：（1）鑒別腫瘤及腫瘤微環境，為腫瘤早期診斷提供可靠依據[2]；（2）手術過程中準確指示腫瘤范圍，指導外科醫生精準切除腫瘤組織[3-4]；（3）鑒別腫瘤分子靶標，輔助篩選與之匹配的藥物以實現腫瘤精準治療[5-6]。由于具有傳統醫學影像學不可比擬的靈敏度和精確性，分子影像近年來在腫瘤診斷和治療中越來越受到重視，大量分子影像探針被發展和應用[7]。
獲得高分辨的分子影像需要借助分子影像探針及與之匹配的影像設備[8]。因此，分子影像探針往往又根據對應的影像設備分為超聲、核磁共振、CT、正電子發射掃描（PET）及光學分子影像探針幾大類[7]。外科手術迄今仍是腫瘤治療的重要手段。但是，傳統手術過程中，主要依賴外科醫生通過觸診和肉眼觀察辨別腫瘤組織，難以實現精準切除，腫瘤復發率高。因此，如何盡可能將腫瘤組織切除干凈而又不損失過多正常組織是腫瘤外科手術面臨的挑戰。而通過實時影像指導手術是解決這一問題的可能途徑。但所有依賴放射性同位素的顯像手段均因輻射和設備復雜等問題而未能在術中廣泛使用[9]。新近發展的光學分子影像技術對人體損傷小，設備相對簡單，應用于術中指導醫生精準切除腫瘤組織具有明顯技術優勢[10]。近年，越來越多的外科醫生借助光學分子影像實施腫瘤外科手術。光學分子影像探針，尤其是腫瘤靶向性分子探針的研制也因此而備受關注[11]。
腫瘤靶向性分子影像探針是將造影劑用合適的方式與腫瘤靶向性分子連接而成。通常，造影劑和腫瘤靶向性分子需根據不同的腫瘤類型進行選擇[12]。肺癌是全球發病人數最多、致死率最高的癌癥[13]。盡管近年相應的診斷和治療技術已明顯提高，但肺癌的發生和致死率仍居高不下，僅 2018 年，全球就有肺癌新發病例 210 萬，死亡 180 萬。迄今為止，醫療界仍然共識，適時手術對提高肺癌治療效果、延長患者生存期極為重要[2]。為了精準切除肺癌組織，研究者積極嘗試利用光學分子影像進行術中導航并取得了一定進展[9, 14]。但是，前期研究選擇的熒光素還存在組織穿透力弱，顯像效果不佳的問題[15-16]，具有較強組織穿透力的近紅外熒光染料可能是更佳的選擇[9]。在選擇腫瘤靶向性分子方面，已有研究主要是以靶向腫瘤細胞表面分子為主。事實上，人體組織中腫瘤細胞往往被大量基質細胞包裹，有可能極大地妨礙分子探針對腫瘤細胞的結合。因此，同時靶向腫瘤細胞和腫瘤基質細胞是腫瘤靶向性分子影像探針發展的新趨勢[11]。
研究[17]發現，血小板衍生生長因子受體 β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ）在人體肺癌組織大量表達。PDGFRβ 在肺癌組織中的高表達與預后不良密切相關[18-19]，提示 PDGFRβ 陽性細胞有促進肺癌發展或降低藥效的作用，應盡量清除。因此，有必要制備 PDGFRβ 靶向性分子探針，并探索用其建立肺癌光學分子影像、輔助肺癌分子診斷及指導術中肺癌組織切除的可能性。根據這一設想，我們選擇了 PDGFRβ 特異性親和體 ZPDGFRβ[20]，將其與三聚結構域 tri 融合[21]，重組表達獲得的蛋白 Z-tri 再與近紅外熒光染料 CF750 進行偶聯，制備成 PDGFRβ 靶向性光學分子探針CF750-Z-tri，并用其對肺癌移植瘤模型進行光學成像,進而評價其在肺癌分子影像中的應用潛力。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細菌和質粒
大腸桿菌 Escherichia coli（E. coli）Top10 菌株和 M15 菌株由實驗室保存。pQE30 表達質粒為美國 QIAGEN 公司產品。
1.1.2 細胞株
人腦血管周細胞（human brain vascular pericytes，HBVP）購自美國 ScienCell 公司。人源 NCI-H292 肺癌細胞株、人源淋巴瘤 Raji 細胞株購自美國 ATCC（American Type Culture Collection）細胞庫。
1.1.3 實驗動物及倫理審查
實驗中所用 Balb/c 雌性裸鼠（15~17g）購自北京華阜康生物科技公司，飼養于本院 SPF 級嚙齒類動物實驗中心。涉及的動物實驗經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查批準，備案號為 20211075A。
1.2 方法
1.2.1 重組蛋白的制備
PDGFRβ 的特異性親合體 ZPDGFRβ 由 Lindborg 等通過文庫篩選獲得[20]。為了提高其對 PDGFRβ 的親和力，我們設計將其與來自于膠原蛋白的三聚結構域（trimerizing domain，tri）[21]通過連接子（G4S）3 融合，組建新的融合蛋白 Z-tri。根據融合蛋白的氨基酸序列，設計編碼基因，委托江蘇省心生物科技公司合成并通過 BamHⅠ和 SalⅠ克隆入 pQE30，轉入 Top10 菌株中保存。
為了表達重組蛋白，將含有表達質粒的 Top10 菌株涂布于含有 100 μg/mL 氨芐西林（ampicillin，AMP）的 LB 固體培養基上，次日挑取單克隆，接種于含有相同濃度 AMP 的液體 LB 培養基中，于 37℃ 培養過夜。收集菌體提取質粒，用常規熱激法將其轉入表達菌 M15 中，再通過含有 AMP（100 μg/mL）和卡那霉素（Kanamycin，Kan，30 μg/mL）的雙抗培養基篩選。獲得的菌株再挑單克隆接種至含有 AMP 和 Kan 的 LB 液體培養基中，37℃ 培養至 A600nm 吸光值為 0.8~1.0，再加入 0.1 mM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），繼續于 24℃，120 rpm 振蕩誘導培養過夜。次日離心收集菌體，用裂解液（500 mM 磷酸鹽，pH 8.0；300 mM 氯化鈉；10% 甘油；5 mM 咪唑）重懸后高壓勻漿。破菌液 4℃，25000 g 離心 20 min，收集上清液，重復 4 次。再向上清液中加入 Ni-NTA 凝膠樹脂，4℃ 結合 4~6 h。然后按照凝膠使用說明書對蛋白進行純化。獲得的蛋白在 4℃ 對 PBS（10 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；137 mM NaCl；2.68 mM KCl，pH 7.4）透析過夜。蛋白濃度用美國 Bio-Rad 公司提供的 DC 試劑盒測定。
1.2.2 蛋白熒光標記
參考 Fan 等[22]描述的方法進行。Z-tri 蛋白用 PBS 稀釋至 1.5 mg/mL，用碳酸氫鈉調節至 pH 8.0 左右，Z-tri 與 CF750 染料（購自美國 Sigma 公司）或 FAM 染料按一定摩爾比混合，室溫避光孵育 1 h。用透析法去除游離染料，通過電泳和熒光掃描檢查蛋白是否標記上熒光染料。
1.2.3 蛋白電泳
蛋白純度和蛋白熒光標記效率通過十二烷基磺酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行檢測。分離膠濃度為 12.75%，濃縮膠濃度為 4%。樣品中加入含有 β-巰基乙醇的樣品處理液，沸水浴 10 min 后加入凝膠電泳。為檢查蛋白是否標記上熒光染料，電泳結束后，凝膠先用熒光掃描儀成像，然后用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶。用同時電泳的商品化分子量標準確定蛋白分子量。
1.2.4 流式細胞術檢測蛋白對細胞的結合
周細胞 HBVP 用專用培養基，按細胞說明書提供的方法培養。NCI-H292 和 Raji 細胞用含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 RPMI1640 培養基，按 ATCC 官方網站提供的方法培養。為檢測細胞表面 PDGFRβ 的表達，先將培養的細胞用胰酶消化，1 000 g離心 5 min，棄掉上清，再加入山羊抗人 PDGFRβ 抗體，室溫孵育 1 h 后用含 0.5% FBS 的 PBS 洗兩次。再加入綠色熒光標記的驢抗山羊二抗于室溫孵育 0.5 h，洗滌兩次后，用含 0.5% FBS 的 PBS 重懸后用于流式檢測。為檢測 Z-tri 蛋白對細胞的結合，將 150 nM FAM 標記的 Z-tri 與細胞于室溫孵育 1 h，洗滌兩次后即用流式檢測。用無關的抗體作為同型對照。
1.2.5 免疫熒光檢測 PDGFRβ 在移植瘤中的表達
Balb/c 雌性裸鼠背部皮下接種腫瘤細胞 NCI-H292（3×106個/只）或 Raji（7.5×106個/只），動態監測瘤體生長狀態。確定成瘤后，定時測量瘤體長（length，L）和寬（eidth，W），按公式 V=L×W2/2 計算腫瘤體積（volume，V）。待瘤體生長至 100～200 mm3，處死小鼠剝取腫瘤，冰凍切片進行免疫熒光染色。按說明書推薦的濃度向腫瘤組織中加入山羊抗人 PDGFRβ 抗體，37℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗滌后再加入驢抗山羊二抗，37℃ 避光孵育 0.5 h。用 DAPI 染液快速顯示細胞核，然后于顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 示蹤法檢測蛋白在瘤內的細胞分布
為了檢測尾靜脈注射的 Z-tri 蛋白是否能進入瘤體并結合到 PDGFRβ 陽性細胞上，按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤體長至 100～200 mm3，尾靜脈注射 FAM 標記的 Z-tri（10 mg/kg），1 h 后處死小鼠剝取腫瘤，冰凍切片，按 1.2.5 描述的免疫熒光法顯示 PDGFRβ 陽性細胞。通過 Z-tri 與 PDGFRβ 的共定位判斷 Z-tri 是否結合到 PDGFRβ 陽性細胞上。同時，還可用 CD31 抗體，通過免疫熒光指示腫瘤血管內皮細胞。通過 Z-tri 與 CD31 的共定位，判斷 Z-tri 的分布與腫瘤血管的關系。
1.2.7 光學成像顯示腫瘤組織
按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤體長至 100～200 mm3，尾靜脈注射 CF750 染料標記過的 Z-tri（6 mg/kg），然后于 1、2、4 和 6 h將小鼠置于活體成像儀中掃描，動態監測CF750-Z-tri 在移植瘤中的富集情況。觀察結束后處死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、結腸、肌肉和腫瘤，按順序整齊擺放于光學成像儀同時掃描。根據CF750-Z-tri 在上述臟器和組織中的分布情況，評價其是否有腫瘤特異性。
2 結果
2.1 Z-tri 在大腸桿菌中大量表達
為了制備足量蛋白，Z-tri 的編碼基因被插入到 pQE30 質粒中構建了表達載體（圖1a）。質粒載體轉入表達菌株 M15，經 IPTG 誘導后，用 Ni-NTA 親和層析法從大腸桿菌上清液中純化出 Z-tri 蛋白。結果如圖1b 所示，親和層析純化后的蛋白在還原 SDS-PAGE 電泳上顯示為單一條帶，說明其純度高。根據分子量標準計算，Z-tri 的分子量大約為 14 KD，與預期分子量相符，說明我們利用大腸桿菌系統成功表達并制備了純度較高的 Z-tri 融合蛋白。
圖1
Z-tri 重組表達及分離純化
a：表達質粒示意圖；b：純化產物 SDS-PAGE 電泳
2.2 Z-tri 容易被熒光染料標記
熒光染料在白光下易于猝滅。因此，快速、高效將熒光染料偶聯到腫瘤靶向性分子上是制備光學影像分子探針的先決條件。將純化的 Z-tri 蛋白，與 CF750 按分子比 1∶6 混合后，室溫下避光孵育 1 h。電泳檢查發現，與染料共同孵育后的 Z-tri 蛋白在凝膠上彌散分布，分子量比未與染料孵育的 Z-tri 蛋白大。將凝膠置于熒光掃描儀下發現，與 CF750 共同孵育后的 Z-tri 顯示熒光，而未與 CF750 共同孵育的 Z-tri 無熒光（圖2a）。這些結果說明 CF750 只需通過簡單孵育，即可偶聯到 Z-tri 上而制備分子探針CF750-Z-tri。用同樣的方法，將 Z-tri 與 FAM 按照 1∶20 的摩爾比混合，也成功地將 FAM 偶聯到 Z-tri 上，制備了分子探針FAM-Z-tri（圖2b）。上述結果說明，熒光染料易于被偶聯到 Z-tri 上，適合于制備光學分子探針。
圖2
CF750-Z-tri（a） 和FAM-Z-tri（b）熒光分子探針的制備
2.3 熒光標記后的 Z-tri 能與體外培養的 PDGFRβ 陽性細胞結合
ZPDGFRβ 能夠與 PDGFRβ 結合。但是，與三聚結構域 tri 融合并偶聯上熒光染料后具有 PDGFRβ 結合能力，也是 Z-tri 能作為光學分子探針的先決條件之一。由于 CF750 產生的熒光不能在現有流式細胞儀上被檢測，我們對FAM-Z-tri 進行檢測，以推測CF750-Z-tri 對 PDGFRβ 的結合能力。結果發現，周細胞 HBVP 和 NCI-H292 肺癌細胞上表達 PDGFRβ，而 Raji 淋巴瘤細胞上不表達 PDGFRβ（圖3a）。相應地，FAM-Z-tri 對 HBVP 和 NCI-H292 顯示了明顯的結合，而不結合 Raji 細胞（圖3b）。這說明 Z-tri 能通過 PDGFRβ 與周細胞和肺癌細胞 NCI-H292 結合。熒光染料標記對 Z-tri 的細胞結合能力影響不大。
圖3
PDGFRβ 表達（a）和 Z-tri 對細胞的結合（b）
2.4 熒光標記后的 Z-tri 能與移植瘤內 PDGFRβ 陽性細胞結合
利用 PDGFRβ 抗體，通過免疫熒光檢測到在 NCI-H292 移植瘤中存在大量 PDGFRβ 陽性細胞，而 Raji 移植瘤中 PDGFRβ 陽性細胞很少（圖4）。進一步分析發現，將FAM-Z-tri 通過尾靜脈注入荷瘤小鼠，循環 1 h 后取瘤體，立即冰凍切片，并通過免疫熒光顯示 PDGFRβ 陽性細胞。結果如圖5a 所示，FAM-Z-tri 廣泛分布于 NCI-H292 移植瘤內，尤其在 PDGFRβ 強陽性細胞上分布較多。進一步用 CD31 抗體顯示腫瘤血管內皮細胞，結果發現大多數FAM-Z-tri 沿血管內皮細胞分布但不完全重合，提示FAM-Z-tri 主要分布在腫瘤血管周細胞上。而FAM-Z-tri 在 Raji 移植瘤內分布較少（圖5b），這與 Raji 瘤內 PDGFRβ 陽性細胞較少（圖4）的結果一致。這些結果提示，Z-tri 在瘤內主要分布在 PDGFRβ 強陽性細胞上。
圖4
移植瘤內 PDGFRβ 陽性細胞
圖5
熒光標記的 Z-tri 在 NCI-H292（a）和 Raji（b）移植瘤內的分布
2.5 熒光標記后的 Z-tri 能快速、清晰地顯示 NCI-H292 肺癌細胞移植瘤
為了檢測熒光標記的分子探針是否能顯示移植瘤，CF750-Z-tri 通過尾靜脈被注入荷瘤小鼠體內，然后定時用小動物活體光學成像系統監測瘤內熒光信號。結果如圖6a 所示，給藥 1 h 后 CF750-Z-tri 就在 NCI-H292 移植瘤內富集。6 h 內，CF750-Z-tri 在瘤內的累積量隨時間延長而增多，且腫瘤組織和周圍正常組織的邊界清楚。這說明CF750-Z-tri 光學分子探針能夠快速、清楚地顯示 PDGFRβ 高表達的肺癌組織。活體成像觀察結束后，處死小鼠取出正常臟器和組織與腫瘤同時進行掃描，比較CF750-Z-tri 的組織分布差異性。結果如圖6b 所示，在 NCI-H292 肺癌移植瘤模型中，除腎臟外，CF750-Z-tri 在腫瘤組織中分布最多，在心、肝、脾、肺、結腸和肌肉中分布很少。腎臟是代謝器官，多數小分子物質都通過腎臟代謝。因此，CF750-Z-tri 在腎臟中的累積可能是代謝所致。這些結果說明CF750-Z-tri 確實能夠在 PDGFRβ 陽性細胞較多的肺癌組織中富集。但是，在 PDGFRβ 陽性細胞很少的 Raji 淋巴瘤細胞移植瘤內，給藥后 6 h 內通過活體成像均未監測到明顯的CF750-Z-tri 富集。剝離臟器和組織掃描發現，與 NCI-H292 移植瘤模型相似，Raji 細胞荷瘤鼠的腎臟中有大量CF750-Z-tri，但瘤內確實未檢測到。這些結果說明，CF750-Z-tri 分子探針對腫瘤組織的顯像與 PDGFRβ 陽性細胞的數量有相關性，能夠快速顯示 PDGFRβ 陽性細胞數量較多的肺癌組織，可以用于肺癌光學分子影像。
圖6
基于 CF750-Z-tri 的移植瘤模型光學分子影像
a：活體成像；b：器官/組織成像
3 討論
通過手術切除病變組織是腫瘤治療的重要環節。但傳統手術過程中，主要依賴外科醫生通過觸診或肉眼觀察辨別腫瘤組織，經驗性強，容易導致切除不干凈或過度切除。因此，如何精準切除腫瘤組織是外科手術面臨的挑戰之一。實時影像導航可能是解決該難題的有效方法。因此，自醫學影像技術建立后，不少研究者對術中實時影像導航進行了探索。放射影像是目前最成熟的腫瘤顯像方法，很早就被用于包括肺癌手術切除在內的術中導航[23]。但是，除放射性同位素的輻射作用外，放射影像術中導航還受到設備限制。比如，PET 具有很高的靈敏度，也能夠檢測深部組織而被廣泛用于實體瘤診斷。但是，大型 PET 設備基本不可能用于術中導航。有人嘗試利用手持小型 PET 探頭進行術中導航，但又面臨著探頭太小、捕獲的放射性信號不足等問題[24]。而基于熒光探針的光學影像技術，因無輻射，且對設備要求低而逐漸成為術中導航使用的主流方法[9, 25- 26]。
顯像劑無疑是探針的重要組成部分。早期用于肺癌術中導航的光學顯像劑主要是熒光素，如異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）等。這些熒光素的發射波長較短（<600 nm），組織穿透能力弱，只能顯示很淺的腫瘤組織。加之正常組織中自發熒光強，信噪比低。因此，該類熒光探針的顯像效果不好[15-16]。新近研究發現，熒光染料發射波長越長，組織穿透能力越強，正常組織背景越低，更容易獲得高清圖像。比如，近紅外染料吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），發射波長達到 800 nm，已廣泛用于腫瘤的術中導航[27]。課題組前期工作中使用一種新的近紅外染料 CF750，發射波長為 750 nm，也具有良好的成像效果[22]。由于課題組已建立成熟的偶聯技術，本研究也選擇 CF750 作為顯像劑。但是，與 ICG 不同的是，CF750 尚未獲批臨床使用，臨床安全性還需進一步評價。最近，國內學者還研制了波長更長的近紅外染料，產生圖像的信噪比更高[28]。這些染料也可在未來的工作中使用。
一些熒光染料，如 ICG，能夠被腫瘤細胞大量攝取而可直接用于腫瘤顯像。但是，為了增強其靶向性，研究者更傾向于將這些熒光染料與腫瘤靶向分子偶聯制備成影像探針[12]。因此，腫瘤靶向分子的選擇又成為分子影像探針制備過程中的重要環節。理論上講，只要是在腫瘤微環境中高表達的分子均可作為靶標分子。但這些分子可能分別或同時高表達于腫瘤細胞和腫瘤基質細胞。早期的研究主要選擇直接靶向腫瘤細胞[11]。但事實上，人體腫瘤組織中，腫瘤細胞往往被大量基質細胞包裹。這些細胞極有可能妨礙分子探針與腫瘤細胞的結合，因而直接靶向腫瘤細胞的探針顯像效果不一定好。比如在肺癌組織中，就存在大量高表達 PDGFRβ 的基質細胞[17]。本研究也證實肺癌細胞 NCI-H292 裸鼠移植瘤高表達 PDGFRβ（圖4）。這些信息提示，PDGFRβ 也可能作為肺癌分子探針的靶標。更有研究發現，PDGFRβ 的高表達是肺癌預后不良的獨立因素，提示手術治療時更應盡可能清除這些 PDGFRβ 陽性細胞。盡管 PDGFRβ 可能高表達于某些腫瘤細胞，但腫瘤新生血管周細胞和成纖維細胞等基質細胞則是組成型表達 PDGFRβ[29]。而且，腫瘤新生血管和成纖維細胞往往在腫瘤生長前緣更豐富。因此，若以 PDGFRβ 為靶標，可能更準確地顯示腫瘤組織的邊緣。若能制備出 PDGFRβ 靶向性分子探針，借助光學分子影像術中導航，可能更有利于指導將腫瘤組織切除干凈。
根據這一設想，本研究選擇了能特異性結合 PDGFRβ 的親和體 ZPDGFRβ 與近紅外染料 CF750 偶聯，制備了CF750-Z-tri 分子探針。結果發現，尾靜脈注射該分子探針 1 h 后，即可顯示 NCI-H292 肺癌細胞裸鼠移植瘤。隨著時間延長，瘤內熒光信號逐漸增強，但腫瘤組織與正常組織的邊界清楚。6 h 后處死小鼠，取出重要臟器，發現CF750-Z-tri 主要富集于瘤體和腎臟。CF750-Z-tri 在腎臟中累積較多的主要原因在于其分子量較小，主要通過腎臟代謝。而瘤體中的富集說明CF750-Z-tri 具有腫瘤靶向性，能夠清楚地顯示腫瘤組織。當然，為了觀察方便，本研究選擇了裸鼠皮下移植瘤模型對該探針進行了測試。后續研究中還應該選擇肺癌原位模型及轉移模型進行成像，進而指導手術切除。在腫瘤靶向分子的選擇中，已有研究通常選擇靶向性和特異性很好的抗體及抗體片段。這些分子，尤其是完整抗體分子量大，對實體瘤的穿透能力弱。加之其半衰期長，需要更長時間代謝，難以在短時間內獲得高清圖像[30]。而本研究選擇的親和體分子，對靶標分子的親和力和特異性與抗體相似，但分子量只有 7 KD，是完整抗體（150 KD）的 1/20，腫瘤組織穿透性更強，代謝更快，能夠在數小時內產生并維持高清影像[31]。即便將其改造后分子量有所增大，但仍屬于小分子蛋白。基于這些蛋白制備的熒光分子探針，用于腫瘤組織切除的術中導航別具優勢。
利益沖突：無。
作者貢獻：范潔負責探針制備及成像，論文撰寫；陶澤負責細胞結合測試；李恒負責腫瘤模型建立；楊芬負責凝膠電泳；楊浩負責質量控制與數據分析；盧曉風負責課題設計及論文撰寫。
醫學影像學是腫瘤無創診斷所依賴的主要手段[1]。近年來，隨著精準醫學理念的不斷深入發展，越來越多的分子影像技術被用于腫瘤的早期診斷和精準治療方案的選擇。事實上，腫瘤發生發展過程中，一些腫瘤相關分子的變化通常早于細胞和組織學水平的變化。因此，以識別這些腫瘤相關分子的特異性分子探針為基礎，借助特定的影像設備產生高分辨分子影像，進而實現：（1）鑒別腫瘤及腫瘤微環境，為腫瘤早期診斷提供可靠依據[2]；（2）手術過程中準確指示腫瘤范圍，指導外科醫生精準切除腫瘤組織[3-4]；（3）鑒別腫瘤分子靶標，輔助篩選與之匹配的藥物以實現腫瘤精準治療[5-6]。由于具有傳統醫學影像學不可比擬的靈敏度和精確性，分子影像近年來在腫瘤診斷和治療中越來越受到重視，大量分子影像探針被發展和應用[7]。
獲得高分辨的分子影像需要借助分子影像探針及與之匹配的影像設備[8]。因此，分子影像探針往往又根據對應的影像設備分為超聲、核磁共振、CT、正電子發射掃描（PET）及光學分子影像探針幾大類[7]。外科手術迄今仍是腫瘤治療的重要手段。但是，傳統手術過程中，主要依賴外科醫生通過觸診和肉眼觀察辨別腫瘤組織，難以實現精準切除，腫瘤復發率高。因此，如何盡可能將腫瘤組織切除干凈而又不損失過多正常組織是腫瘤外科手術面臨的挑戰。而通過實時影像指導手術是解決這一問題的可能途徑。但所有依賴放射性同位素的顯像手段均因輻射和設備復雜等問題而未能在術中廣泛使用[9]。新近發展的光學分子影像技術對人體損傷小，設備相對簡單，應用于術中指導醫生精準切除腫瘤組織具有明顯技術優勢[10]。近年，越來越多的外科醫生借助光學分子影像實施腫瘤外科手術。光學分子影像探針，尤其是腫瘤靶向性分子探針的研制也因此而備受關注[11]。
腫瘤靶向性分子影像探針是將造影劑用合適的方式與腫瘤靶向性分子連接而成。通常，造影劑和腫瘤靶向性分子需根據不同的腫瘤類型進行選擇[12]。肺癌是全球發病人數最多、致死率最高的癌癥[13]。盡管近年相應的診斷和治療技術已明顯提高，但肺癌的發生和致死率仍居高不下，僅 2018 年，全球就有肺癌新發病例 210 萬，死亡 180 萬。迄今為止，醫療界仍然共識，適時手術對提高肺癌治療效果、延長患者生存期極為重要[2]。為了精準切除肺癌組織，研究者積極嘗試利用光學分子影像進行術中導航并取得了一定進展[9, 14]。但是，前期研究選擇的熒光素還存在組織穿透力弱，顯像效果不佳的問題[15-16]，具有較強組織穿透力的近紅外熒光染料可能是更佳的選擇[9]。在選擇腫瘤靶向性分子方面，已有研究主要是以靶向腫瘤細胞表面分子為主。事實上，人體組織中腫瘤細胞往往被大量基質細胞包裹，有可能極大地妨礙分子探針對腫瘤細胞的結合。因此，同時靶向腫瘤細胞和腫瘤基質細胞是腫瘤靶向性分子影像探針發展的新趨勢[11]。
研究[17]發現，血小板衍生生長因子受體 β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ）在人體肺癌組織大量表達。PDGFRβ 在肺癌組織中的高表達與預后不良密切相關[18-19]，提示 PDGFRβ 陽性細胞有促進肺癌發展或降低藥效的作用，應盡量清除。因此，有必要制備 PDGFRβ 靶向性分子探針，并探索用其建立肺癌光學分子影像、輔助肺癌分子診斷及指導術中肺癌組織切除的可能性。根據這一設想，我們選擇了 PDGFRβ 特異性親和體 ZPDGFRβ[20]，將其與三聚結構域 tri 融合[21]，重組表達獲得的蛋白 Z-tri 再與近紅外熒光染料 CF750 進行偶聯，制備成 PDGFRβ 靶向性光學分子探針CF750-Z-tri，并用其對肺癌移植瘤模型進行光學成像,進而評價其在肺癌分子影像中的應用潛力。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細菌和質粒
大腸桿菌 Escherichia coli（E. coli）Top10 菌株和 M15 菌株由實驗室保存。pQE30 表達質粒為美國 QIAGEN 公司產品。
1.1.2 細胞株
人腦血管周細胞（human brain vascular pericytes，HBVP）購自美國 ScienCell 公司。人源 NCI-H292 肺癌細胞株、人源淋巴瘤 Raji 細胞株購自美國 ATCC（American Type Culture Collection）細胞庫。
1.1.3 實驗動物及倫理審查
實驗中所用 Balb/c 雌性裸鼠（15~17g）購自北京華阜康生物科技公司，飼養于本院 SPF 級嚙齒類動物實驗中心。涉及的動物實驗經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查批準，備案號為 20211075A。
1.2 方法
1.2.1 重組蛋白的制備
PDGFRβ 的特異性親合體 ZPDGFRβ 由 Lindborg 等通過文庫篩選獲得[20]。為了提高其對 PDGFRβ 的親和力，我們設計將其與來自于膠原蛋白的三聚結構域（trimerizing domain，tri）[21]通過連接子（G4S）3 融合，組建新的融合蛋白 Z-tri。根據融合蛋白的氨基酸序列，設計編碼基因，委托江蘇省心生物科技公司合成并通過 BamHⅠ和 SalⅠ克隆入 pQE30，轉入 Top10 菌株中保存。
為了表達重組蛋白，將含有表達質粒的 Top10 菌株涂布于含有 100 μg/mL 氨芐西林（ampicillin，AMP）的 LB 固體培養基上，次日挑取單克隆，接種于含有相同濃度 AMP 的液體 LB 培養基中，于 37℃ 培養過夜。收集菌體提取質粒，用常規熱激法將其轉入表達菌 M15 中，再通過含有 AMP（100 μg/mL）和卡那霉素（Kanamycin，Kan，30 μg/mL）的雙抗培養基篩選。獲得的菌株再挑單克隆接種至含有 AMP 和 Kan 的 LB 液體培養基中，37℃ 培養至 A600nm 吸光值為 0.8~1.0，再加入 0.1 mM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），繼續于 24℃，120 rpm 振蕩誘導培養過夜。次日離心收集菌體，用裂解液（500 mM 磷酸鹽，pH 8.0；300 mM 氯化鈉；10% 甘油；5 mM 咪唑）重懸后高壓勻漿。破菌液 4℃，25000 g 離心 20 min，收集上清液，重復 4 次。再向上清液中加入 Ni-NTA 凝膠樹脂，4℃ 結合 4~6 h。然后按照凝膠使用說明書對蛋白進行純化。獲得的蛋白在 4℃ 對 PBS（10 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；137 mM NaCl；2.68 mM KCl，pH 7.4）透析過夜。蛋白濃度用美國 Bio-Rad 公司提供的 DC 試劑盒測定。
1.2.2 蛋白熒光標記
參考 Fan 等[22]描述的方法進行。Z-tri 蛋白用 PBS 稀釋至 1.5 mg/mL，用碳酸氫鈉調節至 pH 8.0 左右，Z-tri 與 CF750 染料（購自美國 Sigma 公司）或 FAM 染料按一定摩爾比混合，室溫避光孵育 1 h。用透析法去除游離染料，通過電泳和熒光掃描檢查蛋白是否標記上熒光染料。
1.2.3 蛋白電泳
蛋白純度和蛋白熒光標記效率通過十二烷基磺酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行檢測。分離膠濃度為 12.75%，濃縮膠濃度為 4%。樣品中加入含有 β-巰基乙醇的樣品處理液，沸水浴 10 min 后加入凝膠電泳。為檢查蛋白是否標記上熒光染料，電泳結束后，凝膠先用熒光掃描儀成像，然后用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶。用同時電泳的商品化分子量標準確定蛋白分子量。
1.2.4 流式細胞術檢測蛋白對細胞的結合
周細胞 HBVP 用專用培養基，按細胞說明書提供的方法培養。NCI-H292 和 Raji 細胞用含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 RPMI1640 培養基，按 ATCC 官方網站提供的方法培養。為檢測細胞表面 PDGFRβ 的表達，先將培養的細胞用胰酶消化，1 000 g離心 5 min，棄掉上清，再加入山羊抗人 PDGFRβ 抗體，室溫孵育 1 h 后用含 0.5% FBS 的 PBS 洗兩次。再加入綠色熒光標記的驢抗山羊二抗于室溫孵育 0.5 h，洗滌兩次后，用含 0.5% FBS 的 PBS 重懸后用于流式檢測。為檢測 Z-tri 蛋白對細胞的結合，將 150 nM FAM 標記的 Z-tri 與細胞于室溫孵育 1 h，洗滌兩次后即用流式檢測。用無關的抗體作為同型對照。
1.2.5 免疫熒光檢測 PDGFRβ 在移植瘤中的表達
Balb/c 雌性裸鼠背部皮下接種腫瘤細胞 NCI-H292（3×106個/只）或 Raji（7.5×106個/只），動態監測瘤體生長狀態。確定成瘤后，定時測量瘤體長（length，L）和寬（eidth，W），按公式 V=L×W2/2 計算腫瘤體積（volume，V）。待瘤體生長至 100～200 mm3，處死小鼠剝取腫瘤，冰凍切片進行免疫熒光染色。按說明書推薦的濃度向腫瘤組織中加入山羊抗人 PDGFRβ 抗體，37℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗滌后再加入驢抗山羊二抗，37℃ 避光孵育 0.5 h。用 DAPI 染液快速顯示細胞核，然后于顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 示蹤法檢測蛋白在瘤內的細胞分布
為了檢測尾靜脈注射的 Z-tri 蛋白是否能進入瘤體并結合到 PDGFRβ 陽性細胞上，按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤體長至 100～200 mm3，尾靜脈注射 FAM 標記的 Z-tri（10 mg/kg），1 h 后處死小鼠剝取腫瘤，冰凍切片，按 1.2.5 描述的免疫熒光法顯示 PDGFRβ 陽性細胞。通過 Z-tri 與 PDGFRβ 的共定位判斷 Z-tri 是否結合到 PDGFRβ 陽性細胞上。同時，還可用 CD31 抗體，通過免疫熒光指示腫瘤血管內皮細胞。通過 Z-tri 與 CD31 的共定位，判斷 Z-tri 的分布與腫瘤血管的關系。
1.2.7 光學成像顯示腫瘤組織
按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤體長至 100～200 mm3，尾靜脈注射 CF750 染料標記過的 Z-tri（6 mg/kg），然后于 1、2、4 和 6 h將小鼠置于活體成像儀中掃描，動態監測CF750-Z-tri 在移植瘤中的富集情況。觀察結束后處死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、結腸、肌肉和腫瘤，按順序整齊擺放于光學成像儀同時掃描。根據CF750-Z-tri 在上述臟器和組織中的分布情況，評價其是否有腫瘤特異性。
2 結果
2.1 Z-tri 在大腸桿菌中大量表達
為了制備足量蛋白，Z-tri 的編碼基因被插入到 pQE30 質粒中構建了表達載體（圖1a）。質粒載體轉入表達菌株 M15，經 IPTG 誘導后，用 Ni-NTA 親和層析法從大腸桿菌上清液中純化出 Z-tri 蛋白。結果如圖1b 所示，親和層析純化后的蛋白在還原 SDS-PAGE 電泳上顯示為單一條帶，說明其純度高。根據分子量標準計算，Z-tri 的分子量大約為 14 KD，與預期分子量相符，說明我們利用大腸桿菌系統成功表達并制備了純度較高的 Z-tri 融合蛋白。
圖1
Z-tri 重組表達及分離純化
a：表達質粒示意圖；b：純化產物 SDS-PAGE 電泳
2.2 Z-tri 容易被熒光染料標記
熒光染料在白光下易于猝滅。因此，快速、高效將熒光染料偶聯到腫瘤靶向性分子上是制備光學影像分子探針的先決條件。將純化的 Z-tri 蛋白，與 CF750 按分子比 1∶6 混合后，室溫下避光孵育 1 h。電泳檢查發現，與染料共同孵育后的 Z-tri 蛋白在凝膠上彌散分布，分子量比未與染料孵育的 Z-tri 蛋白大。將凝膠置于熒光掃描儀下發現，與 CF750 共同孵育后的 Z-tri 顯示熒光，而未與 CF750 共同孵育的 Z-tri 無熒光（圖2a）。這些結果說明 CF750 只需通過簡單孵育，即可偶聯到 Z-tri 上而制備分子探針CF750-Z-tri。用同樣的方法，將 Z-tri 與 FAM 按照 1∶20 的摩爾比混合，也成功地將 FAM 偶聯到 Z-tri 上，制備了分子探針FAM-Z-tri（圖2b）。上述結果說明，熒光染料易于被偶聯到 Z-tri 上，適合于制備光學分子探針。
圖2
CF750-Z-tri（a） 和FAM-Z-tri（b）熒光分子探針的制備
2.3 熒光標記后的 Z-tri 能與體外培養的 PDGFRβ 陽性細胞結合
ZPDGFRβ 能夠與 PDGFRβ 結合。但是，與三聚結構域 tri 融合并偶聯上熒光染料后具有 PDGFRβ 結合能力，也是 Z-tri 能作為光學分子探針的先決條件之一。由于 CF750 產生的熒光不能在現有流式細胞儀上被檢測，我們對FAM-Z-tri 進行檢測，以推測CF750-Z-tri 對 PDGFRβ 的結合能力。結果發現，周細胞 HBVP 和 NCI-H292 肺癌細胞上表達 PDGFRβ，而 Raji 淋巴瘤細胞上不表達 PDGFRβ（圖3a）。相應地，FAM-Z-tri 對 HBVP 和 NCI-H292 顯示了明顯的結合，而不結合 Raji 細胞（圖3b）。這說明 Z-tri 能通過 PDGFRβ 與周細胞和肺癌細胞 NCI-H292 結合。熒光染料標記對 Z-tri 的細胞結合能力影響不大。
圖3
PDGFRβ 表達（a）和 Z-tri 對細胞的結合（b）
2.4 熒光標記后的 Z-tri 能與移植瘤內 PDGFRβ 陽性細胞結合
利用 PDGFRβ 抗體，通過免疫熒光檢測到在 NCI-H292 移植瘤中存在大量 PDGFRβ 陽性細胞，而 Raji 移植瘤中 PDGFRβ 陽性細胞很少（圖4）。進一步分析發現，將FAM-Z-tri 通過尾靜脈注入荷瘤小鼠，循環 1 h 后取瘤體，立即冰凍切片，并通過免疫熒光顯示 PDGFRβ 陽性細胞。結果如圖5a 所示，FAM-Z-tri 廣泛分布于 NCI-H292 移植瘤內，尤其在 PDGFRβ 強陽性細胞上分布較多。進一步用 CD31 抗體顯示腫瘤血管內皮細胞，結果發現大多數FAM-Z-tri 沿血管內皮細胞分布但不完全重合，提示FAM-Z-tri 主要分布在腫瘤血管周細胞上。而FAM-Z-tri 在 Raji 移植瘤內分布較少（圖5b），這與 Raji 瘤內 PDGFRβ 陽性細胞較少（圖4）的結果一致。這些結果提示，Z-tri 在瘤內主要分布在 PDGFRβ 強陽性細胞上。
圖4
移植瘤內 PDGFRβ 陽性細胞
圖5
熒光標記的 Z-tri 在 NCI-H292（a）和 Raji（b）移植瘤內的分布
2.5 熒光標記后的 Z-tri 能快速、清晰地顯示 NCI-H292 肺癌細胞移植瘤
為了檢測熒光標記的分子探針是否能顯示移植瘤，CF750-Z-tri 通過尾靜脈被注入荷瘤小鼠體內，然后定時用小動物活體光學成像系統監測瘤內熒光信號。結果如圖6a 所示，給藥 1 h 后 CF750-Z-tri 就在 NCI-H292 移植瘤內富集。6 h 內，CF750-Z-tri 在瘤內的累積量隨時間延長而增多，且腫瘤組織和周圍正常組織的邊界清楚。這說明CF750-Z-tri 光學分子探針能夠快速、清楚地顯示 PDGFRβ 高表達的肺癌組織。活體成像觀察結束后，處死小鼠取出正常臟器和組織與腫瘤同時進行掃描，比較CF750-Z-tri 的組織分布差異性。結果如圖6b 所示，在 NCI-H292 肺癌移植瘤模型中，除腎臟外，CF750-Z-tri 在腫瘤組織中分布最多，在心、肝、脾、肺、結腸和肌肉中分布很少。腎臟是代謝器官，多數小分子物質都通過腎臟代謝。因此，CF750-Z-tri 在腎臟中的累積可能是代謝所致。這些結果說明CF750-Z-tri 確實能夠在 PDGFRβ 陽性細胞較多的肺癌組織中富集。但是，在 PDGFRβ 陽性細胞很少的 Raji 淋巴瘤細胞移植瘤內，給藥后 6 h 內通過活體成像均未監測到明顯的CF750-Z-tri 富集。剝離臟器和組織掃描發現，與 NCI-H292 移植瘤模型相似，Raji 細胞荷瘤鼠的腎臟中有大量CF750-Z-tri，但瘤內確實未檢測到。這些結果說明，CF750-Z-tri 分子探針對腫瘤組織的顯像與 PDGFRβ 陽性細胞的數量有相關性，能夠快速顯示 PDGFRβ 陽性細胞數量較多的肺癌組織，可以用于肺癌光學分子影像。
圖6
基于 CF750-Z-tri 的移植瘤模型光學分子影像
a：活體成像；b：器官/組織成像
3 討論
通過手術切除病變組織是腫瘤治療的重要環節。但傳統手術過程中，主要依賴外科醫生通過觸診或肉眼觀察辨別腫瘤組織，經驗性強，容易導致切除不干凈或過度切除。因此，如何精準切除腫瘤組織是外科手術面臨的挑戰之一。實時影像導航可能是解決該難題的有效方法。因此，自醫學影像技術建立后，不少研究者對術中實時影像導航進行了探索。放射影像是目前最成熟的腫瘤顯像方法，很早就被用于包括肺癌手術切除在內的術中導航[23]。但是，除放射性同位素的輻射作用外，放射影像術中導航還受到設備限制。比如，PET 具有很高的靈敏度，也能夠檢測深部組織而被廣泛用于實體瘤診斷。但是，大型 PET 設備基本不可能用于術中導航。有人嘗試利用手持小型 PET 探頭進行術中導航，但又面臨著探頭太小、捕獲的放射性信號不足等問題[24]。而基于熒光探針的光學影像技術，因無輻射，且對設備要求低而逐漸成為術中導航使用的主流方法[9, 25- 26]。
顯像劑無疑是探針的重要組成部分。早期用于肺癌術中導航的光學顯像劑主要是熒光素，如異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）等。這些熒光素的發射波長較短（<600 nm），組織穿透能力弱，只能顯示很淺的腫瘤組織。加之正常組織中自發熒光強，信噪比低。因此，該類熒光探針的顯像效果不好[15-16]。新近研究發現，熒光染料發射波長越長，組織穿透能力越強，正常組織背景越低，更容易獲得高清圖像。比如，近紅外染料吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），發射波長達到 800 nm，已廣泛用于腫瘤的術中導航[27]。課題組前期工作中使用一種新的近紅外染料 CF750，發射波長為 750 nm，也具有良好的成像效果[22]。由于課題組已建立成熟的偶聯技術，本研究也選擇 CF750 作為顯像劑。但是，與 ICG 不同的是，CF750 尚未獲批臨床使用，臨床安全性還需進一步評價。最近，國內學者還研制了波長更長的近紅外染料，產生圖像的信噪比更高[28]。這些染料也可在未來的工作中使用。
一些熒光染料，如 ICG，能夠被腫瘤細胞大量攝取而可直接用于腫瘤顯像。但是，為了增強其靶向性，研究者更傾向于將這些熒光染料與腫瘤靶向分子偶聯制備成影像探針[12]。因此，腫瘤靶向分子的選擇又成為分子影像探針制備過程中的重要環節。理論上講，只要是在腫瘤微環境中高表達的分子均可作為靶標分子。但這些分子可能分別或同時高表達于腫瘤細胞和腫瘤基質細胞。早期的研究主要選擇直接靶向腫瘤細胞[11]。但事實上，人體腫瘤組織中，腫瘤細胞往往被大量基質細胞包裹。這些細胞極有可能妨礙分子探針與腫瘤細胞的結合，因而直接靶向腫瘤細胞的探針顯像效果不一定好。比如在肺癌組織中，就存在大量高表達 PDGFRβ 的基質細胞[17]。本研究也證實肺癌細胞 NCI-H292 裸鼠移植瘤高表達 PDGFRβ（圖4）。這些信息提示，PDGFRβ 也可能作為肺癌分子探針的靶標。更有研究發現，PDGFRβ 的高表達是肺癌預后不良的獨立因素，提示手術治療時更應盡可能清除這些 PDGFRβ 陽性細胞。盡管 PDGFRβ 可能高表達于某些腫瘤細胞，但腫瘤新生血管周細胞和成纖維細胞等基質細胞則是組成型表達 PDGFRβ[29]。而且，腫瘤新生血管和成纖維細胞往往在腫瘤生長前緣更豐富。因此，若以 PDGFRβ 為靶標，可能更準確地顯示腫瘤組織的邊緣。若能制備出 PDGFRβ 靶向性分子探針，借助光學分子影像術中導航，可能更有利于指導將腫瘤組織切除干凈。
根據這一設想，本研究選擇了能特異性結合 PDGFRβ 的親和體 ZPDGFRβ 與近紅外染料 CF750 偶聯，制備了CF750-Z-tri 分子探針。結果發現，尾靜脈注射該分子探針 1 h 后，即可顯示 NCI-H292 肺癌細胞裸鼠移植瘤。隨著時間延長，瘤內熒光信號逐漸增強，但腫瘤組織與正常組織的邊界清楚。6 h 后處死小鼠，取出重要臟器，發現CF750-Z-tri 主要富集于瘤體和腎臟。CF750-Z-tri 在腎臟中累積較多的主要原因在于其分子量較小，主要通過腎臟代謝。而瘤體中的富集說明CF750-Z-tri 具有腫瘤靶向性，能夠清楚地顯示腫瘤組織。當然，為了觀察方便，本研究選擇了裸鼠皮下移植瘤模型對該探針進行了測試。后續研究中還應該選擇肺癌原位模型及轉移模型進行成像，進而指導手術切除。在腫瘤靶向分子的選擇中，已有研究通常選擇靶向性和特異性很好的抗體及抗體片段。這些分子，尤其是完整抗體分子量大，對實體瘤的穿透能力弱。加之其半衰期長，需要更長時間代謝，難以在短時間內獲得高清圖像[30]。而本研究選擇的親和體分子，對靶標分子的親和力和特異性與抗體相似，但分子量只有 7 KD，是完整抗體（150 KD）的 1/20，腫瘤組織穿透性更強，代謝更快，能夠在數小時內產生并維持高清影像[31]。即便將其改造后分子量有所增大，但仍屬于小分子蛋白。基于這些蛋白制備的熒光分子探針，用于腫瘤組織切除的術中導航別具優勢。
利益沖突：無。
作者貢獻：范潔負責探針制備及成像，論文撰寫；陶澤負責細胞結合測試；李恒負責腫瘤模型建立；楊芬負責凝膠電泳；楊浩負責質量控制與數據分析；盧曉風負責課題設計及論文撰寫。
