引用本文： 孔德志, 劉傲, 崔健, 冷曉亮, 沃楊, 董燕亭, 矯文捷. 臨床Ⅰ期非小細胞肺癌診斷模型構建：基于臨床影像學特征聯合葉酸受體陽性循環腫瘤細胞檢測的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(10): 1192-1201. doi: 10.7507/1007-4848.202101072 復制
在全球范圍內，肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，2018 年估計有 210 萬肺癌新發病例和 180 萬死亡病例，占與癌癥相關死亡人數的近 1/5（18.4%）[1]。我國約 75% 的肺癌患者在診斷時已屬晚期，5 年生存率為 15.6%，而早期肺癌患者的 5 年生存率為 80%[2]。這一現狀不但與缺乏篩查有關，更與缺乏科學鑒別肺結節的方法有關。
目前針對肺癌高發人群篩查常通過低劑量螺旋計算機斷層掃描（low-dose computed tomography，LDCT）。然而，有研究[3]表明，LDCT 假陽性率較高（18.5%），且存在輻射暴露、隨訪成本高以及發現中央型病灶肺癌患者的效果較差等問題，并不能完全達到有效地早期診斷和預防的目的[4]。傳統的腫瘤相關抗原在肺癌早期診斷中的敏感性和特異性均不理想。其它侵入性診斷方法，如針吸活檢或支氣管鏡刷檢，并發癥發生率高，給患者帶來極大的不適[5]。
隨著精準醫學的發展和技術的進步，液體活檢憑借其無創性、敏感性、動態性等特質，被寄予厚望[6-7]。外周血標本易獲得、侵入性小、可反復采集，是臨床上常規檢測較為理想的標本來源。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是指從原發或轉移病灶脫落到血液循環中的腫瘤細胞。CTC 作為新一代的腫瘤標志物，大量研究[8-10]已經證實 CTC 檢測將有助于腫瘤早期診斷、復發轉移監測、判斷患者預后及指導術后輔助治療。葉酸受體（folate receptor，FR）是一種細胞表面受體糖蛋白，在許多上皮來源的惡性腫瘤細胞中高度表達，在 75.7% 的非小細胞肺癌（NSCLC）患者中顯著上調[11]。
因此，我們致力于研究分析葉酸受體陽性循環腫瘤細胞（folate receptor-positive circulating tumor cells，FR+CTC）在臨床Ⅰ期 NSCLC 患者中的表達，并建立一個基于 FR+CTC 的臨床Ⅰ期 NSCLC 診斷模型，為可疑肺結節的早期診斷提供新的依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
回顧性分析青島大學附屬醫院 2018 年 9 月至 2019 年 12 月入院的 1 520 例進行了 CTC 檢測的患者的臨床資料。這些患者均接受了胸部 CT 掃描和手術治療，并進行了病理檢查。篩選出臨床Ⅰ期 NSCLC 患者及肺部良性疾病患者 1 277 例，其中男 518 例、女 759 例，中位年齡為 57（29～85）歲。納入標準：（1）NSCLC 或良性疾病患者術前胸部 CT 檢查有肺結節。檢查無淋巴結、區域或遠處轉移；（2）術前采集血液樣本進行 FR+CTC 檢測；（3）CT 上病灶直徑≤4 cm；（4）病理組織學檢查有明確的病理診斷結果；（5）患者有完整的臨床病例資料。隨后，為保證有足夠數量的患者建立準確的模型，將符合標準的 1 277 例患者采用隨機數字表法按 4∶1 的比例隨機分為兩組，其中試驗組 1038 例、驗證組 239 例。
1.2 血液樣本中 FR+CTC 的定量檢測
臨床檢測樣本為全血樣本，每次采血時用加有 EDTA 抗凝劑的真空采血管抽取患者靜脈血 3 mL，上下顛倒 7～8 次。樣本采用“葉酸受體細胞檢測試劑盒”檢測樣本中 FR+CTC 的數量。根據試劑盒說明書，CTC 是通過紅細胞的裂解和血液中白細胞的免疫磁性去除（通過抗 CD45 和抗 CD14 涂層的磁珠）來富集的。然后用腫瘤特異性配體葉酸和人工合成的寡核苷酸的結合物標記它，收集 CTC 進行定量 PCR 分析。免疫熒光染色后，CTC 被定義為表達葉酸配體和細胞角蛋白（8、18 和 19）的細胞。在本研究中，我們定義 1 個 CTC 單位為在 3 mL 血液中檢測到的 CTC 數量[12]。
樣本一經采集，則盡快送至檢測實驗室。如若不能馬上送檢樣本，則于 4℃～8℃ 暫存，并在 24 h 之內進行檢測。如超出保存時間，則丟棄該血樣，重新采集。樣本如需運輸，用 4℃～8℃ 冰袋保持低溫運輸。FR+CTC 值>8.7 FU/3 mL 定義為陽性。
1.3 數據收集
收集患者的臨床資料、FR+CTC 值、影像學特征及腫瘤標志物。其中，臨床資料包括年齡、性別、吸煙史、臨床癥狀。影像學特征包括結節位置、結節直徑、結節中實性成分直徑比值（consolidation/tumor ratio，CTR）、胸膜牽拉征、毛刺征、肺氣腫。腫瘤標志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、糖類抗原 199（carbohydrate antigen 199，CA199）和糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）。
1.4 統計學分析
正態分布的連續變量采用均數±標準差（
±s）表示，非正態分布的連續變量采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或 Kruskal-Wallis 檢驗。分類變量以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和 Fisher 確切概率法。將數據進行單因素分析，將單因素分析結果中有統計學意義的因素進行 logistic 回歸分析，找出獨立危險因素，建立預測模型，繪制列線圖（Nomogram），對模型進行內部及外部驗證，檢測模型的預測性能。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）檢驗模型的區分度，校準曲線檢驗模型的一致性。在所有分析中，雙側P≤0.05 為差異有統計學意義。采用 SPSS 25.0 軟件、Med-Calc 19.1 軟件、GraphPad Prism 8 軟件和 R 3.6.1 軟件及 RMS 包執行所有分析。
1.5 倫理審查
本研究已通過青島大學附屬醫院倫理委員會批準，批準號為：QYFYWZLL 26169。
2 結果
2.1 研究人群的臨床特征及 FR+CTC 分布
共 925 例經病理證實的 NSCLC 患者和 113 例良性結節患者納入試驗組。其中，907 例 NSCLC 患者病理證實為腺癌，良性結節包括 50 例錯構瘤、27 例炎性假瘤、25 例結核、11 例硬化性肺泡細胞瘤。試驗組患者的平均年齡為 59.15 歲，其中 NSCLC 患者的平均年齡為 60.00 歲，良性結節患者的平均年齡為 57.00 歲；驗證組 NSCLC 患者 219 例，良性結節患者 20 例，患者的平均年齡為 59.29 歲，其中 NSCLC 患者的平均年齡為 59.71 歲，良性結節患者的平均年齡為 54.35 歲。
試驗組中，NSCLC 的女性患者比例明顯高于男性（62.1% vs. 37.9%），沒有吸煙史的患者占大多數（77.2%），有癥狀患者多于沒有癥狀（多為查體發現）患者（63.9% vs. 36.1%）；見表 1；外周血中 FR+CTC 陽性（>8.7 FU/3 mL）的 NSCLC 患者顯著多于 FR+CTC 陰性患者（78.8% vs. 21.2%，P<0.001）；同時，在肺良性結節的患者中，FR+CTC 陰性患者比例則明顯高于 FR+CTC 陽性患者（76.1% vs. 23.9%）。影像學特征方面，惡性結節位于右肺的比例明顯高于左肺（60.4% vs. 39.6%）。肺惡性結節直徑的中位值為 17 mm，良性結節直徑的中位值為 13 mm，良惡性結節直徑大小多為 10～<20 mm（45.2% vs. 54.9%），惡性結節其次為 20～<30 mm（25.9%），而良性結節其次為 <10 mm（27.4%）。胸部 CT 中惡性結節胸膜牽拉征和毛刺征出現的頻率顯著高于良性結節，分別為 40.2% vs. 19.5%，62.9% vs. 23.9%。根據結節的 CTR 值，將結節分為實性結節、亞實性結節和純磨玻璃樣結節（pure-ground glass opacity，pGGO），良性結節多數為實性結節（78.8%），而超過一半的惡性結節含有磨玻璃結節成分（53.2%）。CEA 在肺惡性結節的陽性率高于良性結節（23.1% vs. 14.2%），其余的腫瘤標志物如 SCC、CA 199、NSE 則沒有太大差異。以上結果在驗證組也得到了近似的分布趨勢。
表1
兩組患者臨床資料比較［例（%）］
另外，我們也對全組患者的 FR+CTC 值進行了分析；見表 2。NSCLC 患者組的 FR+CTC 值中位數為 11.50 個單位，而肺良性結節患者組的 FR+CTC 值中位數為 7.60 個單位，Mann-Whitney U檢驗結果顯示，差異有統計學意義（P<0.001）；見圖 1；而 FR+CTC 值在年齡、性別、吸煙史的分布上，差異均無統計學意義。值得注意的是，雖然結節直徑沒有檢驗出差異，但是可以看出，隨著結節直徑逐漸增大，FR+CTC 值表現出來逐漸增多的趨勢。
表2
良惡性肺結節患者外周血 FR+CTC 值［M（P25，P75）］
圖1
非小細胞肺癌和良性結節患者外周血中 FR+CTC 值比較
2.2 試驗組的單因素和多因素分析
將試驗組上述因素進行 logistic 單因素分析，結果顯示，試驗組患者中，NSCLC 患者和肺良性結節患者在年齡（P<0.001）、性別（P<0.001）、結節直徑（P<0.001）、臨床癥狀（P=0.030）、FR+CTC 值（P<0.001）、胸膜牽拉征（P<0.001）、毛刺征（P<0.001）、CTR（P<0.001）及 CEA（P=0.032）方面差異均有統計學意義；見表 3。
表3
試驗組的單因素及多因素分析
將年齡、性別、結節直徑、臨床癥狀、FR+CTC 值、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR 及 CEA 共 9 項因素納入 logistic 多因素分析，結果顯示，年齡≥60 歲（OR=1.700，95%CI 1.002～2.884，P=0.049）、女性（OR=2.617，95%CI 1.541～4.442，P<0.001）、FR+CTC 值>8.7 FU/3 mL（OR=16.992，95%CI 9.728～29.682，P<0.001）、胸膜牽拉征陽性（OR=2.199，95%CI 1.195～4.405，P=0.011）、結節直徑（OR=1.728，95%CI 1.244～2.402，P=0.001）、毛刺征陽性（OR=6.322，95%CI 3.561～11.225，P<0.001）、CTR<1（OR=3.172，95%CI 2.264～4.446，P<0.001）是病灶直徑≤4 cm 肺部腫物良惡性病變的獨立危險因素；見表 3。
2.3 建立 Nomogram 預測模型
將 logistic 回歸分析的結果納入 Nomogram 預測模型，即與病灶直徑≤4 cm 肺部腫物良惡性病變的獨立危險因素年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值納入預測模型，繪出 Nomogram；見圖 2。
圖2
臨床Ⅰ期非小細胞肺癌診斷預測模型的列線圖
2.4 Nomogram 預測模型的內部驗證和外部驗證
首先，對建立的 Nomogram 預測模型進行內部驗證，ROC 曲線用于驗證模型的區分度，試驗組 AUC 值為 0.918（95%CI 0.900～0.934）。當截斷點 T=0.6955 時，約登指數最大，此時模型敏感性為 86.36%，特異性為 83.19%；見圖 3a。校準曲線用于驗證 Nomogram 模型的預測一致性，顯示了肺結節良惡性的預測精度；見圖 3b。預測概率的校準曲線圖表明，Nomogram 預測模型估計的預測值與實際觀測結果有很大的一致性。
圖3
臨床Ⅰ期非小細胞肺癌診斷預測模型的內部及外部驗證
a：試驗組 ROC 曲線評價 Nomogram 模型的診斷價值；b：內部驗證 Nomogram 模型的校準曲線；c：驗證組 ROC 曲線評價 Nomogram 模型的診斷價值；d：外部驗證 Nomogram 模型的校準曲線
同時，我們在驗證隊列評估了包括年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值在內的 Nomogram 預測模型的預測價值，即 Nomogram 預測模型的外部驗證。在驗證隊列中，同樣通過 ROC 曲線驗證模型的區分度，驗證組 AUC 值為 0.903（95%CI 0.859～0.938），模型敏感性為 79.45%，特異性為 90.00%；見圖 3c。校準曲線驗證 Nomogram 預測模型的預測一致性，預測肺結節良惡性的校準曲線表明 Nomogram 預測模型一致性良好；見圖 3d。
3 討論
我國肺惡性腫瘤發病率和死亡率高居全國首位，其中 NSCLC 約占 85%。與之前相比，肺腺癌發病率顯著升高，女性發病率和死亡率上升，青年發病率顯著上升[13]。NSCLC 患者的預后主要取決于病理分期，Ⅰ/Ⅱ期患者的 5 年生存率為 68%～92%，而晚期患者的 5 年生存率只有 1%～13%。然而，由于缺乏有效的方法，只有 16% 的肺癌患者在早期被診斷出來[8]。目前一般應用 LDCT 進行早期肺癌的篩查，但是存在診斷小結節的假陽性率較高等缺陷，對 LDCT 在肺癌篩查及指導治療中的有效性存在一些爭議[14]。目前世界上常用對肺結節進行良惡性預測的模型，包括 Mayo 模型[15]、VA 模型[16]和 Brock 模型[17]等，都包括一定時效性、地域性、人群分布等局限，且大多只納入了可疑肺結節的影像學特征，并未將腫瘤標記物等資料納入聯合診斷模型。隨著近年來高分辨率 CT 的發展，越來越多的肺結節，特別是磨玻璃結節被發現，毛刺征、胸膜牽拉征等影像學特征也較 LDCT 更為清晰。因此，迫切需要尋找新的聯合診斷因素，結合新的技術，建立 NSCLC 的早期診斷預測模型，以提高總體生存率。
1869 年，澳大利亞醫生 Thomas Ashworth 解剖了 1 例晚期癌癥患者，意外地在他的外周血液中發現了與原發腫瘤大小和形狀相似的細胞，隨后提出了 CTC 的概念[18]。基于 Ashworth 的發現，英國病理學家 Stephen Paget 于 1889 年提出了著名的種子和土壤假說，成功地解釋了腫瘤復發和轉移的機制[19]。2010 年，CTC 分析被寫入美國癌癥聯合委員會（AJCC）癌癥分期手冊，作為補充病理分期的新指標，作為 cM0（i+）出現在 M0 和 M1 之間[20]，CTC 和循環腫瘤 DNA（CtDNA）是主要的候選標志物[9]。在先前的研究[21]中，CTC 和血清標志物被用作早期 NSCLC 的預后和預測生物標志物。CTC 在肺癌進展和預后中的作用，以及評估療效、開發靶向藥物和個體化治療也是一個普遍的研究方向[22-24]。FR 是一種跨膜單鏈糖蛋白，含有 α、β 和 γ 三種亞型，在人體大部分的腫瘤細胞中都有特異性的高表達，如卵巢癌、肺癌和泌尿系統癌，而在正常器官中很少表達。研究[25]發現 72%～83%的肺腫瘤細胞表面高表達 FR，因此 FR 被選為一種理想的肺腫瘤細胞篩選靶標。FR 還可用于識別活的 CTC，其豐度不受上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響[25-26]，因此被選為 CTC 特異性標記物。一項“葉酸受體細胞檢測試劑盒”多中心、隨機、單盲上市前臨床驗證試驗結果證明試劑盒檢測的 FR+CTC 作為肺癌的輔助診斷手段具有高敏感性（79.6%）和特異性（88.2%），對肺癌的診斷效能優于目前臨床常用的其它血液標志物[12, 27-28]。綜上所述，我們選擇納入 FR+CTC 值，探討結合臨床資料和影像學特征，構建臨床Ⅰ期 NSCLC 的診斷預測模型的可能性。
本研究結果顯示，年齡（≥60 歲）、性別（女）、FR+CTC 值（>8.7 FU/3 mL）、胸膜牽拉征（陽性）、病灶直徑（越大）、毛刺征（陽性）、CTR（<1）是判斷≤4 cm 肺病灶良惡性的獨立危險因素。與之前的研究[12, 29]結果一致，我們發現早期 NSCLC 患者的外周血中 CTC 數量明顯高于肺部良性疾病患者。其原因可能是盡管高分辨率 CT 未見明顯異常，但早期肺癌可能存在腫瘤細胞從病灶中脫落并進入血液循環。在逃避免疫清除的情況下，腫瘤細胞通常通過外周血聚集并定植于其它器官，形成轉移灶（12～15 個）。研究[30]表明，即使是從原發灶脫落的少量 CTC 在沒有被免疫系統識別和清除的情況下存活下來，也可能在某個時間或其它時候發生遠處轉移。此外，FR+CTC 在年齡較高的人群中也稍高，這可能是因為老年人長期葉酸缺乏導致腫瘤組織中 FR 的過度表達，從而促使 FR+CTC 水平升高[31]。結節直徑的大小與 CTC 值關系密切，這與之前 Ding 等[32]的研究結果一致，需要我們進一步挖掘 CTC 與肺癌診斷、預后的關系[33]。考慮到亞洲地區空氣污染狀況、亞洲非吸煙女性腺癌的高患病率[34]，與基于歐美人群為樣本研究建立 Mayo 模型、VA 模型和 Brock 模型等相比，我們的預測模型更適用于我國患者可疑肺部腫物良惡性的診斷。
至于此 Nomogram 診斷模型的應用，假如胸部 CT 上有 1 個 15 mm 可疑肺結節的 55 歲男性患者，胸部 CT 顯示結節有胸膜牽拉征，無毛刺征，CTR 為 0.5，外周血中 FR+CTC 值為陽性，則利用 Nomogram 診斷模型計算該患者的肺結節惡性概率是 95%，如圖 2 所示，Nomogram 圖中計算如下：年齡<60 歲、男性、無毛刺征，對應于 0 分；結節直徑位于 10～20 區間，對應于 22 分；存在胸膜牽拉，對應于 27 分；CTR=0.5，相當于 41 分；外周血中 FR+CTC 值為陽性，相當于 100 分；最后總分等于 190 分，對應肺結節惡性概率為 95%。模型區分度由 ROC 曲線來檢驗。在試驗隊列中，Nomogram 診斷模型的 ROC 曲線的 AUC 值為 0.918（95%CI 0.900～0.934），而驗證隊列的 AUC 值為 0.903（95%CI 0.859～0.938）。這表明，此 Nomogram 診斷模型可以從沒有事件發生的患者中分辨出有事件發生的患者，其診斷效能大約是 91.9%。因此，我們可以認為，包含年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值的診斷模型可以診斷臨床Ⅰ期 NSCLC。
我們的預測模型的敏感性為 82.91%（86.36% vs. 79.45%），特異性為 86.60%（83.19% vs. 90.00%），均高于或者近似于此前應用 CTC 診斷肺癌的模型的結果[12, 32, 35-36]。Moon 等[35]建立了一個基于 CTC 和 CtDNA 的肺癌聯合診斷模型，敏感性為 95%，特異性為 16.7%，與之相比我們納入了影像學特征及其它臨床因素，盡可能地提高了模型的穩定性，較其模型的特異性顯著提高。Chen 等[12]建立了一個基于 FR+CTC 聯合 CEA、NSE 和 Cyfra21-1 診斷肺癌的預測模型，AUC 值為 0.883（0.841～0.925），敏感性為 84.21%，特異性為 83.91%。與之相比，我們的研究對象為早期肺癌患者，且絕大多數為肺腺癌[37]，CEA 在單因素分析中被認為與 NSCLC 有關，其它腫瘤標志物在分析中沒有被驗證為獨立危險因素，有必要進一步研究 FR+CTC 與腫瘤標志物表達在肺癌聯合診斷中的作用。
本研究應用了 FR+CTC 聯合影像學特征診斷臨床Ⅰ期 NSCLC，并開發了 Nomogram 模型。目前這項研究的優勢在于，它專門調查了早期 NSCLC 患者，并驗證了結合 CTC 和影像學特征的診斷準確性。結合液體活檢的非侵入性等特點，可以更好地優化個人的預測準確性，幫助臨床醫生診斷肺結節，有助于減少低危疾病的誤診和過度治療。一些不能進行病理活檢的患者，將直接從本研究中獲益。
本研究存在一些局限性。首先，本研究為單中心、回顧性研究，樣本量較少，模型需經過前瞻性、多中心、大樣本研究進一步檢驗；其次，在本研究中，研究對象人群為可疑惡性結節且有外科手術治療傾向的患者，存在一定的選擇偏倚。同時，經本模型診斷的惡性概率低的結節同樣需要隨訪，尤其是 CEA 高的患者，要根據結節的動態變化由有經驗的胸外科醫師制定下一步診療計劃[38]。
綜上所述，我們研究了 FR+CTC 在臨床Ⅰ期 NSCLC 患者和肺良性結節患者血液中表達的差異，發現 NSCLC 患者外周血中 FR+CTC 明顯高于肺部良性疾病患者，年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值是臨床Ⅰ期 NSCLC 的獨立危險因素，并建立了一個由此組成的新的可疑肺部腫物診斷預測模型，并且我們證實此預測模型是有意義的，可以為臨床診斷提供依據。
利益沖突：無。
作者貢獻：孔德志完善研究設計、查閱資料、數據整理與分析及論文初稿撰寫與修改等；劉傲指導數據的統計學分析等；崔健、冷曉亮負責細化寫作思路、對文章中圖表進一步完善加工；沃楊、董燕亭負責收集數據、文章潤色；矯文捷負責論文設計、指導、審閱與修改等。
在全球范圍內，肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，2018 年估計有 210 萬肺癌新發病例和 180 萬死亡病例，占與癌癥相關死亡人數的近 1/5（18.4%）[1]。我國約 75% 的肺癌患者在診斷時已屬晚期，5 年生存率為 15.6%，而早期肺癌患者的 5 年生存率為 80%[2]。這一現狀不但與缺乏篩查有關，更與缺乏科學鑒別肺結節的方法有關。
目前針對肺癌高發人群篩查常通過低劑量螺旋計算機斷層掃描（low-dose computed tomography，LDCT）。然而，有研究[3]表明，LDCT 假陽性率較高（18.5%），且存在輻射暴露、隨訪成本高以及發現中央型病灶肺癌患者的效果較差等問題，并不能完全達到有效地早期診斷和預防的目的[4]。傳統的腫瘤相關抗原在肺癌早期診斷中的敏感性和特異性均不理想。其它侵入性診斷方法，如針吸活檢或支氣管鏡刷檢，并發癥發生率高，給患者帶來極大的不適[5]。
隨著精準醫學的發展和技術的進步，液體活檢憑借其無創性、敏感性、動態性等特質，被寄予厚望[6-7]。外周血標本易獲得、侵入性小、可反復采集，是臨床上常規檢測較為理想的標本來源。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是指從原發或轉移病灶脫落到血液循環中的腫瘤細胞。CTC 作為新一代的腫瘤標志物，大量研究[8-10]已經證實 CTC 檢測將有助于腫瘤早期診斷、復發轉移監測、判斷患者預后及指導術后輔助治療。葉酸受體（folate receptor，FR）是一種細胞表面受體糖蛋白，在許多上皮來源的惡性腫瘤細胞中高度表達，在 75.7% 的非小細胞肺癌（NSCLC）患者中顯著上調[11]。
因此，我們致力于研究分析葉酸受體陽性循環腫瘤細胞（folate receptor-positive circulating tumor cells，FR+CTC）在臨床Ⅰ期 NSCLC 患者中的表達，并建立一個基于 FR+CTC 的臨床Ⅰ期 NSCLC 診斷模型，為可疑肺結節的早期診斷提供新的依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
回顧性分析青島大學附屬醫院 2018 年 9 月至 2019 年 12 月入院的 1 520 例進行了 CTC 檢測的患者的臨床資料。這些患者均接受了胸部 CT 掃描和手術治療，并進行了病理檢查。篩選出臨床Ⅰ期 NSCLC 患者及肺部良性疾病患者 1 277 例，其中男 518 例、女 759 例，中位年齡為 57（29～85）歲。納入標準：（1）NSCLC 或良性疾病患者術前胸部 CT 檢查有肺結節。檢查無淋巴結、區域或遠處轉移；（2）術前采集血液樣本進行 FR+CTC 檢測；（3）CT 上病灶直徑≤4 cm；（4）病理組織學檢查有明確的病理診斷結果；（5）患者有完整的臨床病例資料。隨后，為保證有足夠數量的患者建立準確的模型，將符合標準的 1 277 例患者采用隨機數字表法按 4∶1 的比例隨機分為兩組，其中試驗組 1038 例、驗證組 239 例。
1.2 血液樣本中 FR+CTC 的定量檢測
臨床檢測樣本為全血樣本，每次采血時用加有 EDTA 抗凝劑的真空采血管抽取患者靜脈血 3 mL，上下顛倒 7～8 次。樣本采用“葉酸受體細胞檢測試劑盒”檢測樣本中 FR+CTC 的數量。根據試劑盒說明書，CTC 是通過紅細胞的裂解和血液中白細胞的免疫磁性去除（通過抗 CD45 和抗 CD14 涂層的磁珠）來富集的。然后用腫瘤特異性配體葉酸和人工合成的寡核苷酸的結合物標記它，收集 CTC 進行定量 PCR 分析。免疫熒光染色后，CTC 被定義為表達葉酸配體和細胞角蛋白（8、18 和 19）的細胞。在本研究中，我們定義 1 個 CTC 單位為在 3 mL 血液中檢測到的 CTC 數量[12]。
樣本一經采集，則盡快送至檢測實驗室。如若不能馬上送檢樣本，則于 4℃～8℃ 暫存，并在 24 h 之內進行檢測。如超出保存時間，則丟棄該血樣，重新采集。樣本如需運輸，用 4℃～8℃ 冰袋保持低溫運輸。FR+CTC 值>8.7 FU/3 mL 定義為陽性。
1.3 數據收集
收集患者的臨床資料、FR+CTC 值、影像學特征及腫瘤標志物。其中，臨床資料包括年齡、性別、吸煙史、臨床癥狀。影像學特征包括結節位置、結節直徑、結節中實性成分直徑比值（consolidation/tumor ratio，CTR）、胸膜牽拉征、毛刺征、肺氣腫。腫瘤標志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、糖類抗原 199（carbohydrate antigen 199，CA199）和糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）。
1.4 統計學分析
正態分布的連續變量采用均數±標準差（±s）表示，非正態分布的連續變量采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或 Kruskal-Wallis 檢驗。分類變量以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和 Fisher 確切概率法。將數據進行單因素分析，將單因素分析結果中有統計學意義的因素進行 logistic 回歸分析，找出獨立危險因素，建立預測模型，繪制列線圖（Nomogram），對模型進行內部及外部驗證，檢測模型的預測性能。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）檢驗模型的區分度，校準曲線檢驗模型的一致性。在所有分析中，雙側P≤0.05 為差異有統計學意義。采用 SPSS 25.0 軟件、Med-Calc 19.1 軟件、GraphPad Prism 8 軟件和 R 3.6.1 軟件及 RMS 包執行所有分析。
1.5 倫理審查
本研究已通過青島大學附屬醫院倫理委員會批準，批準號為：QYFYWZLL 26169。
2 結果
2.1 研究人群的臨床特征及 FR+CTC 分布
共 925 例經病理證實的 NSCLC 患者和 113 例良性結節患者納入試驗組。其中，907 例 NSCLC 患者病理證實為腺癌，良性結節包括 50 例錯構瘤、27 例炎性假瘤、25 例結核、11 例硬化性肺泡細胞瘤。試驗組患者的平均年齡為 59.15 歲，其中 NSCLC 患者的平均年齡為 60.00 歲，良性結節患者的平均年齡為 57.00 歲；驗證組 NSCLC 患者 219 例，良性結節患者 20 例，患者的平均年齡為 59.29 歲，其中 NSCLC 患者的平均年齡為 59.71 歲，良性結節患者的平均年齡為 54.35 歲。
試驗組中，NSCLC 的女性患者比例明顯高于男性（62.1% vs. 37.9%），沒有吸煙史的患者占大多數（77.2%），有癥狀患者多于沒有癥狀（多為查體發現）患者（63.9% vs. 36.1%）；見表 1；外周血中 FR+CTC 陽性（>8.7 FU/3 mL）的 NSCLC 患者顯著多于 FR+CTC 陰性患者（78.8% vs. 21.2%，P<0.001）；同時，在肺良性結節的患者中，FR+CTC 陰性患者比例則明顯高于 FR+CTC 陽性患者（76.1% vs. 23.9%）。影像學特征方面，惡性結節位于右肺的比例明顯高于左肺（60.4% vs. 39.6%）。肺惡性結節直徑的中位值為 17 mm，良性結節直徑的中位值為 13 mm，良惡性結節直徑大小多為 10～<20 mm（45.2% vs. 54.9%），惡性結節其次為 20～<30 mm（25.9%），而良性結節其次為 <10 mm（27.4%）。胸部 CT 中惡性結節胸膜牽拉征和毛刺征出現的頻率顯著高于良性結節，分別為 40.2% vs. 19.5%，62.9% vs. 23.9%。根據結節的 CTR 值，將結節分為實性結節、亞實性結節和純磨玻璃樣結節（pure-ground glass opacity，pGGO），良性結節多數為實性結節（78.8%），而超過一半的惡性結節含有磨玻璃結節成分（53.2%）。CEA 在肺惡性結節的陽性率高于良性結節（23.1% vs. 14.2%），其余的腫瘤標志物如 SCC、CA 199、NSE 則沒有太大差異。以上結果在驗證組也得到了近似的分布趨勢。
表1
兩組患者臨床資料比較［例（%）］
另外，我們也對全組患者的 FR+CTC 值進行了分析；見表 2。NSCLC 患者組的 FR+CTC 值中位數為 11.50 個單位，而肺良性結節患者組的 FR+CTC 值中位數為 7.60 個單位，Mann-Whitney U檢驗結果顯示，差異有統計學意義（P<0.001）；見圖 1；而 FR+CTC 值在年齡、性別、吸煙史的分布上，差異均無統計學意義。值得注意的是，雖然結節直徑沒有檢驗出差異，但是可以看出，隨著結節直徑逐漸增大，FR+CTC 值表現出來逐漸增多的趨勢。
表2
良惡性肺結節患者外周血 FR+CTC 值［M（P25，P75）］
圖1
非小細胞肺癌和良性結節患者外周血中 FR+CTC 值比較
2.2 試驗組的單因素和多因素分析
將試驗組上述因素進行 logistic 單因素分析，結果顯示，試驗組患者中，NSCLC 患者和肺良性結節患者在年齡（P<0.001）、性別（P<0.001）、結節直徑（P<0.001）、臨床癥狀（P=0.030）、FR+CTC 值（P<0.001）、胸膜牽拉征（P<0.001）、毛刺征（P<0.001）、CTR（P<0.001）及 CEA（P=0.032）方面差異均有統計學意義；見表 3。
表3
試驗組的單因素及多因素分析
將年齡、性別、結節直徑、臨床癥狀、FR+CTC 值、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR 及 CEA 共 9 項因素納入 logistic 多因素分析，結果顯示，年齡≥60 歲（OR=1.700，95%CI 1.002～2.884，P=0.049）、女性（OR=2.617，95%CI 1.541～4.442，P<0.001）、FR+CTC 值>8.7 FU/3 mL（OR=16.992，95%CI 9.728～29.682，P<0.001）、胸膜牽拉征陽性（OR=2.199，95%CI 1.195～4.405，P=0.011）、結節直徑（OR=1.728，95%CI 1.244～2.402，P=0.001）、毛刺征陽性（OR=6.322，95%CI 3.561～11.225，P<0.001）、CTR<1（OR=3.172，95%CI 2.264～4.446，P<0.001）是病灶直徑≤4 cm 肺部腫物良惡性病變的獨立危險因素；見表 3。
2.3 建立 Nomogram 預測模型
將 logistic 回歸分析的結果納入 Nomogram 預測模型，即與病灶直徑≤4 cm 肺部腫物良惡性病變的獨立危險因素年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值納入預測模型，繪出 Nomogram；見圖 2。
圖2
臨床Ⅰ期非小細胞肺癌診斷預測模型的列線圖
2.4 Nomogram 預測模型的內部驗證和外部驗證
首先，對建立的 Nomogram 預測模型進行內部驗證，ROC 曲線用于驗證模型的區分度，試驗組 AUC 值為 0.918（95%CI 0.900～0.934）。當截斷點 T=0.6955 時，約登指數最大，此時模型敏感性為 86.36%，特異性為 83.19%；見圖 3a。校準曲線用于驗證 Nomogram 模型的預測一致性，顯示了肺結節良惡性的預測精度；見圖 3b。預測概率的校準曲線圖表明，Nomogram 預測模型估計的預測值與實際觀測結果有很大的一致性。
圖3
臨床Ⅰ期非小細胞肺癌診斷預測模型的內部及外部驗證
a：試驗組 ROC 曲線評價 Nomogram 模型的診斷價值；b：內部驗證 Nomogram 模型的校準曲線；c：驗證組 ROC 曲線評價 Nomogram 模型的診斷價值；d：外部驗證 Nomogram 模型的校準曲線
同時，我們在驗證隊列評估了包括年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值在內的 Nomogram 預測模型的預測價值，即 Nomogram 預測模型的外部驗證。在驗證隊列中，同樣通過 ROC 曲線驗證模型的區分度，驗證組 AUC 值為 0.903（95%CI 0.859～0.938），模型敏感性為 79.45%，特異性為 90.00%；見圖 3c。校準曲線驗證 Nomogram 預測模型的預測一致性，預測肺結節良惡性的校準曲線表明 Nomogram 預測模型一致性良好；見圖 3d。
3 討論
我國肺惡性腫瘤發病率和死亡率高居全國首位，其中 NSCLC 約占 85%。與之前相比，肺腺癌發病率顯著升高，女性發病率和死亡率上升，青年發病率顯著上升[13]。NSCLC 患者的預后主要取決于病理分期，Ⅰ/Ⅱ期患者的 5 年生存率為 68%～92%，而晚期患者的 5 年生存率只有 1%～13%。然而，由于缺乏有效的方法，只有 16% 的肺癌患者在早期被診斷出來[8]。目前一般應用 LDCT 進行早期肺癌的篩查，但是存在診斷小結節的假陽性率較高等缺陷，對 LDCT 在肺癌篩查及指導治療中的有效性存在一些爭議[14]。目前世界上常用對肺結節進行良惡性預測的模型，包括 Mayo 模型[15]、VA 模型[16]和 Brock 模型[17]等，都包括一定時效性、地域性、人群分布等局限，且大多只納入了可疑肺結節的影像學特征，并未將腫瘤標記物等資料納入聯合診斷模型。隨著近年來高分辨率 CT 的發展，越來越多的肺結節，特別是磨玻璃結節被發現，毛刺征、胸膜牽拉征等影像學特征也較 LDCT 更為清晰。因此，迫切需要尋找新的聯合診斷因素，結合新的技術，建立 NSCLC 的早期診斷預測模型，以提高總體生存率。
1869 年，澳大利亞醫生 Thomas Ashworth 解剖了 1 例晚期癌癥患者，意外地在他的外周血液中發現了與原發腫瘤大小和形狀相似的細胞，隨后提出了 CTC 的概念[18]。基于 Ashworth 的發現，英國病理學家 Stephen Paget 于 1889 年提出了著名的種子和土壤假說，成功地解釋了腫瘤復發和轉移的機制[19]。2010 年，CTC 分析被寫入美國癌癥聯合委員會（AJCC）癌癥分期手冊，作為補充病理分期的新指標，作為 cM0（i+）出現在 M0 和 M1 之間[20]，CTC 和循環腫瘤 DNA（CtDNA）是主要的候選標志物[9]。在先前的研究[21]中，CTC 和血清標志物被用作早期 NSCLC 的預后和預測生物標志物。CTC 在肺癌進展和預后中的作用，以及評估療效、開發靶向藥物和個體化治療也是一個普遍的研究方向[22-24]。FR 是一種跨膜單鏈糖蛋白，含有 α、β 和 γ 三種亞型，在人體大部分的腫瘤細胞中都有特異性的高表達，如卵巢癌、肺癌和泌尿系統癌，而在正常器官中很少表達。研究[25]發現 72%～83%的肺腫瘤細胞表面高表達 FR，因此 FR 被選為一種理想的肺腫瘤細胞篩選靶標。FR 還可用于識別活的 CTC，其豐度不受上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響[25-26]，因此被選為 CTC 特異性標記物。一項“葉酸受體細胞檢測試劑盒”多中心、隨機、單盲上市前臨床驗證試驗結果證明試劑盒檢測的 FR+CTC 作為肺癌的輔助診斷手段具有高敏感性（79.6%）和特異性（88.2%），對肺癌的診斷效能優于目前臨床常用的其它血液標志物[12, 27-28]。綜上所述，我們選擇納入 FR+CTC 值，探討結合臨床資料和影像學特征，構建臨床Ⅰ期 NSCLC 的診斷預測模型的可能性。
本研究結果顯示，年齡（≥60 歲）、性別（女）、FR+CTC 值（>8.7 FU/3 mL）、胸膜牽拉征（陽性）、病灶直徑（越大）、毛刺征（陽性）、CTR（<1）是判斷≤4 cm 肺病灶良惡性的獨立危險因素。與之前的研究[12, 29]結果一致，我們發現早期 NSCLC 患者的外周血中 CTC 數量明顯高于肺部良性疾病患者。其原因可能是盡管高分辨率 CT 未見明顯異常，但早期肺癌可能存在腫瘤細胞從病灶中脫落并進入血液循環。在逃避免疫清除的情況下，腫瘤細胞通常通過外周血聚集并定植于其它器官，形成轉移灶（12～15 個）。研究[30]表明，即使是從原發灶脫落的少量 CTC 在沒有被免疫系統識別和清除的情況下存活下來，也可能在某個時間或其它時候發生遠處轉移。此外，FR+CTC 在年齡較高的人群中也稍高，這可能是因為老年人長期葉酸缺乏導致腫瘤組織中 FR 的過度表達，從而促使 FR+CTC 水平升高[31]。結節直徑的大小與 CTC 值關系密切，這與之前 Ding 等[32]的研究結果一致，需要我們進一步挖掘 CTC 與肺癌診斷、預后的關系[33]。考慮到亞洲地區空氣污染狀況、亞洲非吸煙女性腺癌的高患病率[34]，與基于歐美人群為樣本研究建立 Mayo 模型、VA 模型和 Brock 模型等相比，我們的預測模型更適用于我國患者可疑肺部腫物良惡性的診斷。
至于此 Nomogram 診斷模型的應用，假如胸部 CT 上有 1 個 15 mm 可疑肺結節的 55 歲男性患者，胸部 CT 顯示結節有胸膜牽拉征，無毛刺征，CTR 為 0.5，外周血中 FR+CTC 值為陽性，則利用 Nomogram 診斷模型計算該患者的肺結節惡性概率是 95%，如圖 2 所示，Nomogram 圖中計算如下：年齡<60 歲、男性、無毛刺征，對應于 0 分；結節直徑位于 10～20 區間，對應于 22 分；存在胸膜牽拉，對應于 27 分；CTR=0.5，相當于 41 分；外周血中 FR+CTC 值為陽性，相當于 100 分；最后總分等于 190 分，對應肺結節惡性概率為 95%。模型區分度由 ROC 曲線來檢驗。在試驗隊列中，Nomogram 診斷模型的 ROC 曲線的 AUC 值為 0.918（95%CI 0.900～0.934），而驗證隊列的 AUC 值為 0.903（95%CI 0.859～0.938）。這表明，此 Nomogram 診斷模型可以從沒有事件發生的患者中分辨出有事件發生的患者，其診斷效能大約是 91.9%。因此，我們可以認為，包含年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值的診斷模型可以診斷臨床Ⅰ期 NSCLC。
我們的預測模型的敏感性為 82.91%（86.36% vs. 79.45%），特異性為 86.60%（83.19% vs. 90.00%），均高于或者近似于此前應用 CTC 診斷肺癌的模型的結果[12, 32, 35-36]。Moon 等[35]建立了一個基于 CTC 和 CtDNA 的肺癌聯合診斷模型，敏感性為 95%，特異性為 16.7%，與之相比我們納入了影像學特征及其它臨床因素，盡可能地提高了模型的穩定性，較其模型的特異性顯著提高。Chen 等[12]建立了一個基于 FR+CTC 聯合 CEA、NSE 和 Cyfra21-1 診斷肺癌的預測模型，AUC 值為 0.883（0.841～0.925），敏感性為 84.21%，特異性為 83.91%。與之相比，我們的研究對象為早期肺癌患者，且絕大多數為肺腺癌[37]，CEA 在單因素分析中被認為與 NSCLC 有關，其它腫瘤標志物在分析中沒有被驗證為獨立危險因素，有必要進一步研究 FR+CTC 與腫瘤標志物表達在肺癌聯合診斷中的作用。
本研究應用了 FR+CTC 聯合影像學特征診斷臨床Ⅰ期 NSCLC，并開發了 Nomogram 模型。目前這項研究的優勢在于，它專門調查了早期 NSCLC 患者，并驗證了結合 CTC 和影像學特征的診斷準確性。結合液體活檢的非侵入性等特點，可以更好地優化個人的預測準確性，幫助臨床醫生診斷肺結節，有助于減少低危疾病的誤診和過度治療。一些不能進行病理活檢的患者，將直接從本研究中獲益。
本研究存在一些局限性。首先，本研究為單中心、回顧性研究，樣本量較少，模型需經過前瞻性、多中心、大樣本研究進一步檢驗；其次，在本研究中，研究對象人群為可疑惡性結節且有外科手術治療傾向的患者，存在一定的選擇偏倚。同時，經本模型診斷的惡性概率低的結節同樣需要隨訪，尤其是 CEA 高的患者，要根據結節的動態變化由有經驗的胸外科醫師制定下一步診療計劃[38]。
綜上所述，我們研究了 FR+CTC 在臨床Ⅰ期 NSCLC 患者和肺良性結節患者血液中表達的差異，發現 NSCLC 患者外周血中 FR+CTC 明顯高于肺部良性疾病患者，年齡、性別、結節直徑、胸膜牽拉征、毛刺征、CTR、FR+CTC 值是臨床Ⅰ期 NSCLC 的獨立危險因素，并建立了一個由此組成的新的可疑肺部腫物診斷預測模型，并且我們證實此預測模型是有意義的，可以為臨床診斷提供依據。
利益沖突：無。
作者貢獻：孔德志完善研究設計、查閱資料、數據整理與分析及論文初稿撰寫與修改等；劉傲指導數據的統計學分析等；崔健、冷曉亮負責細化寫作思路、對文章中圖表進一步完善加工；沃楊、董燕亭負責收集數據、文章潤色；矯文捷負責論文設計、指導、審閱與修改等。
