引用本文： 吳中杰, 張雁飛, 呂望, 盛宏旭, 朱林海, 胡奕, 胡堅. BIX-01294 通過誘導 DNA 損傷和激活線粒體凋亡途徑抑制食管鱗癌細胞增殖. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(5): 571-577. doi: 10.7507/1007-4848.202009031 復制
食管癌居我國惡性腫瘤死亡率的第 4 位，鱗狀細胞癌（鱗癌）是我國食管癌的主要病理類型[1]。食管鱗癌惡性程度高，Ⅳ期患者 3 年生存率僅為 10.6%[2]。深入研究食管鱗癌的發病機理，將為食管鱗癌生物學機制的研究和治療新靶點的發現奠定基礎。
組蛋白甲基化修飾是調節染色質結構和基因轉錄的機制之一，在腫瘤的惡性發展過程中具有重要作用[3]。組蛋白甲基化由特異的組蛋白甲基化酶（histone methyltransferases，HMTs）和去甲基酶（histone demethylases，HDMs）協調完成，是一個可逆的動態修飾過程[4]。組蛋白甲基化酶 G9a 屬于 SET 域家族，定位于染色體 6p21.33，是常染色質主要的組蛋白 H3K9 甲基轉移酶，催化 H3K9 的單甲基化和二甲基化[5]。G9a 表達的失調或功能紊亂與黑色素瘤、結腸癌、乳腺癌等腫瘤的發生相關，抑制 G9a 的表達或甲基轉移酶活性可以誘導細胞發生衰老、周期阻滯、凋亡等，顯示出強大的抗腫瘤活性，提示 G9a 是腫瘤潛在的治療靶點[5-7]。
本文以體外培養的人食管鱗癌細胞為研究對象，觀察組蛋白甲基化酶 G9a 抑制劑 BIX-01294 對細胞生長、增殖的影響；分析細胞的凋亡情況以及 G9a 催化產物 H3K9me2、DNA 雙鏈斷裂標記和細胞凋亡相關蛋白表達的變化情況；探討 G9a 抑制劑誘導食管鱗癌細胞凋亡的作用效應和分子機制。
1 材料與方法
1.1 藥物和細胞株
BIX-01294 購自 MedChemExpress 公司（純度≥98%）；DMSO 配成 50mM 的母液，?80℃ 保存。食管鱗癌細胞 EC109 和 KYSE150 購自中國科學院細胞庫。
1.2 試劑
胎牛血清、RPMI 1640 培養液、0.25% 胰酶-0.02% EDTA 購自 Thermo 公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自 BD Pharmingen 公司；兔抗人 Histone H3K9me2、Histone H3、γH2AX、H2AX、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、GAPDH 多克隆抗體和 HRP 標記的羊抗兔 IgG 抗體均購自 Cell Signaling Technology 公司；ECL 化學發光試劑購自 Millipore 公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 MTT 實驗分析 BIX-01294 的細胞毒性作用
EC109 和 KYSE150 細胞按每孔 3×103/L個接種于 96 孔培養板，貼壁后棄去上清，加入 100 μL 含 1、2.5、5、7.5 和 10 μM BIX-01294 的培養液，每組設 5 個復孔，對照組加入等體積的完全培養液。藥物作用 24 h，MTT 法分析 BIX-01294 對細胞生長的影響，酶標儀測定各孔 490 nm 處吸光度值（A），計算細胞存活率（%）和半數抑制濃度（IC50），實驗重復 3 次。
1.3.2 集落形成實驗分析細胞的增殖能力
EC109 和 KYSE150 細胞以每孔 2×103/L 個細胞接種于 6 孔板。細胞貼壁后，實驗組加入 IC50 濃度的含藥培養液，對照組加入等體積的完全培養液，繼續培養 7 d；4% 多聚甲醛溶液固定 15 min，0.5% 結晶紫溶液染色 10 min，觀察各組細胞集落形成的情況。
1.3.3 流式細胞術檢測凋亡率
EC109 和 KYSE150 細胞以每孔 3×105/L個細胞接種于 6 孔板。細胞貼壁后，實驗組加入 IC50 濃度的含藥培養液，空白對照組加入等體積的完全培養液；BIX-01294 作用 24 h，收集各組細胞，加入 Annexin V-FITC 標記液（5 μL）和 PI（10 μL）混勻，室溫避光孵育 15 min，加入 400 μL 1×結合緩沖液，上機檢測細胞凋亡率。
1.3.4 免疫印跡實驗檢測蛋白的表達水平
細胞培養及藥物處理同 1.3.3。提取 BIX-01294 作用 24 h 的各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度。取各實驗組 30 μg 蛋白樣品行 PAGE-SDS 電泳，300 mA 恒流電轉移至 PVDF 膜。3% BSA 溶液封閉 1 h，一抗抗體室溫孵育 2 h，TBST 緩沖液洗膜 3 次，二抗抗體室溫孵育 1 h，TBST 緩沖液洗膜 3 次。滴加 ECL 試劑于凝膠成像系統內曝光，分析目的蛋白的表達，以 GAPDH 為實驗內參。
1.4 統計學分析
采用 SPSS 21.0 統計軟件包分析實驗數據，各組數據采用均數±標準差（
±s）表示，采用 t 檢驗對數據進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BIX-01294 抑制食管鱗癌細胞的生長
不同濃度的 BIX-01294 作用于 EC109 和 KYSE150 細胞 24 h，顯著抑制食管鱗癌細胞的生長，呈劑量依賴關系；見圖 1。BIX-01294 作用 EC109 細胞和 KYSE150 細胞 24 h 的半數抑制濃度（IC50）分別為 4.85 μM 和 5.91 μM。
圖1
不同濃度 BIX-01294 對食管鱗癌細胞增殖的影響
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；*：
2.2 BIX-01294 抑制食管鱗癌細胞集落的形成
BIX-01294（IC50）作用 7 d，顯著抑制 EC109 和 KYSE150 細胞集落的形成；見圖 2。
圖2
BIX-01294（IC50 濃度）對食管鱗癌細胞集落形成的影響
a：BIX-01294（IC50 ）作用于EC109細胞；b：BIX-01294（IC50 ）作用于KYSE150細胞；***：
2.3 BIX-01294 誘導食管鱗癌細胞凋亡
BIX-01294（IC50）作用 24 h，EC109 細胞凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）為 42.5%±5.4%，與對照組（11.5%±2.1%）相比顯著上升（P<0.05）；KYSE150 細胞凋亡率為 49.2%±5.2%，與對照組（7.5%±0.9%）相比顯著上升（P<0.05）；見圖 3。
圖3
BIX-01294 誘導食管鱗癌細胞凋亡
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；***：
2.4 BIX-01294 抑制 G9a 催化產物的表達
免疫印跡實驗發現，BIX-01294 作用 24 h，抑制 EC109 和 KYSE150 細胞表達 G9a 的催化產物 H3K9me2；見圖 4。
圖4
BIX-01294 抑制 G9a 催化產物的表達
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.5 BIX-01294 促進 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白的表達
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白 γH2AX 的表達水平顯著上調；見圖 5。
圖5
BIX-01294 促進 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白的表達
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.6 BIX-01294 促進食管鱗癌細胞表達凋亡相關蛋白
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 caspase3 和 PARP 的剪切片段 cleaved caspase3 和 cleaved PARP 的表達顯著增加；見圖6。
圖6
BIX-01294 促進食管鱗癌細胞表達凋亡相關蛋白
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.7 BIX-01294 激活線粒體凋亡途徑
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 Bax 的表達顯著增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達顯著下降，cleaved caspase9 表達上升；見圖 7。
圖7
BIX-01294 激活線粒體凋亡途徑
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
3 討論
研究證實，G9a 參與腫瘤細胞增殖[8]、侵襲轉移[9]、干性維持[10]等生命活動的調控。我們發現，小分子化合物 BIX-01294 靶向抑制 G9a 具有誘導食管鱗癌細胞凋亡的作用。Zhang 等[11]的研究結果顯示，合成的 G9a 抑制劑 GA001 通過激活 p21/Bim 級聯反應誘導乳腺癌細胞凋亡。BIX-01294 誘導急性 T 淋巴細胞白血病細胞[12]、肝癌細胞[13]的凋亡。86% 的膠質瘤組織中 G9a 表達陽性；BIX-01294 通過下調 Bcl-2 的表達，促進 Bax、caspase3 和 caspase9 的表達誘導 U251 細胞凋亡[14]。提示靶向抑制 G9a 誘導細胞凋亡是殺傷腫瘤的有效途徑之一。
我們發現，DNA 雙鏈斷裂標記蛋白 γH2AX 的表達在 BIX-01294 組細胞中顯著上調。磷酸化組蛋白 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是 DNA 發生雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）時組蛋白 H2AX 的 C 末端第 139 位絲氨酸發生磷酸化的形式，γH2AX 聚集于 DSBs 位點，繼而募集 DNA 損傷修復蛋白（53BP1、BRCA1 等）修復損傷維持基因組穩定性[15]。DSBs 是最致命的 DNA 損傷，不能修復的 DSBs 是誘發調亡的主要因素。在皮膚黑色素瘤組織中，γH2AX 的表達水平與 G9a 呈負相關[16]，提示 BIX-01294 誘導 DSBs 是其促進食管鱗癌細胞凋亡的機制之一。
線粒體凋亡途徑的激活是啟動細胞凋亡的誘因之一[17]。BIX-01294 抑制 G9a 的甲基轉移酶活性可促進食管鱗癌細胞表達 Bax，并且抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達下降，cleaved caspase9 蛋白表達上升，表明線粒體凋亡途徑參與 BIX-01294 誘導的食管鱗癌細胞凋亡。當 Bax 與 Bcl-2 比例上升或者 Bax 發生寡聚化將導致 Bax 在線粒體外膜上形成連通細胞質的孔道導致促凋亡內容物的外漏促進 caspase9 由酶原形式轉變成活性形式，進而激活下游細胞凋亡信號通路[17]。caspase 級聯反應中的效應蛋白 caspase3 在 BIX-01294 組細胞中被剪切激活；PARP 被 cleaved caspase3 水解成 89 和 24kD 的片段，失去修復 DNA 損傷的功能，受 PARP 負調控的核酸內切酶活性增高誘導細胞凋亡[18]。
本研究提示 G9a 可能是食管鱗癌潛在的治療靶點。有研究[19]發現，抑制 G9a 的表達具有上調雙特異性磷酸酶 4（DUSP4）的表達進而抑制 ERK1/2 通路誘導腫瘤細胞自噬性死亡的作用。G9a 通過抑制 CASP1 的表達抑制非小細胞肺癌細胞的侵襲轉移[9]。G9a 通過轉錄激活絲氨酸-甘氨酸生物合成通路促進腫瘤細胞的增殖[20]。BIX-01294 抑制 G9a 是否具有調控食管鱗癌細胞自噬和侵襲轉移的作用及機制有待進一步的研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：吳中杰負責設計研究、初稿撰寫；張雁飛、呂望、盛宏旭、朱林海負責查閱資料、數據整理和分析；胡奕負責論文審閱；胡堅指導和設計研究、負責論文審閱和修改。
食管癌居我國惡性腫瘤死亡率的第 4 位，鱗狀細胞癌（鱗癌）是我國食管癌的主要病理類型[1]。食管鱗癌惡性程度高，Ⅳ期患者 3 年生存率僅為 10.6%[2]。深入研究食管鱗癌的發病機理，將為食管鱗癌生物學機制的研究和治療新靶點的發現奠定基礎。
組蛋白甲基化修飾是調節染色質結構和基因轉錄的機制之一，在腫瘤的惡性發展過程中具有重要作用[3]。組蛋白甲基化由特異的組蛋白甲基化酶（histone methyltransferases，HMTs）和去甲基酶（histone demethylases，HDMs）協調完成，是一個可逆的動態修飾過程[4]。組蛋白甲基化酶 G9a 屬于 SET 域家族，定位于染色體 6p21.33，是常染色質主要的組蛋白 H3K9 甲基轉移酶，催化 H3K9 的單甲基化和二甲基化[5]。G9a 表達的失調或功能紊亂與黑色素瘤、結腸癌、乳腺癌等腫瘤的發生相關，抑制 G9a 的表達或甲基轉移酶活性可以誘導細胞發生衰老、周期阻滯、凋亡等，顯示出強大的抗腫瘤活性，提示 G9a 是腫瘤潛在的治療靶點[5-7]。
本文以體外培養的人食管鱗癌細胞為研究對象，觀察組蛋白甲基化酶 G9a 抑制劑 BIX-01294 對細胞生長、增殖的影響；分析細胞的凋亡情況以及 G9a 催化產物 H3K9me2、DNA 雙鏈斷裂標記和細胞凋亡相關蛋白表達的變化情況；探討 G9a 抑制劑誘導食管鱗癌細胞凋亡的作用效應和分子機制。
1 材料與方法
1.1 藥物和細胞株
BIX-01294 購自 MedChemExpress 公司（純度≥98%）；DMSO 配成 50mM 的母液，?80℃ 保存。食管鱗癌細胞 EC109 和 KYSE150 購自中國科學院細胞庫。
1.2 試劑
胎牛血清、RPMI 1640 培養液、0.25% 胰酶-0.02% EDTA 購自 Thermo 公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自 BD Pharmingen 公司；兔抗人 Histone H3K9me2、Histone H3、γH2AX、H2AX、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、GAPDH 多克隆抗體和 HRP 標記的羊抗兔 IgG 抗體均購自 Cell Signaling Technology 公司；ECL 化學發光試劑購自 Millipore 公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 MTT 實驗分析 BIX-01294 的細胞毒性作用
EC109 和 KYSE150 細胞按每孔 3×103/L個接種于 96 孔培養板，貼壁后棄去上清，加入 100 μL 含 1、2.5、5、7.5 和 10 μM BIX-01294 的培養液，每組設 5 個復孔，對照組加入等體積的完全培養液。藥物作用 24 h，MTT 法分析 BIX-01294 對細胞生長的影響，酶標儀測定各孔 490 nm 處吸光度值（A），計算細胞存活率（%）和半數抑制濃度（IC50），實驗重復 3 次。
1.3.2 集落形成實驗分析細胞的增殖能力
EC109 和 KYSE150 細胞以每孔 2×103/L 個細胞接種于 6 孔板。細胞貼壁后，實驗組加入 IC50 濃度的含藥培養液，對照組加入等體積的完全培養液，繼續培養 7 d；4% 多聚甲醛溶液固定 15 min，0.5% 結晶紫溶液染色 10 min，觀察各組細胞集落形成的情況。
1.3.3 流式細胞術檢測凋亡率
EC109 和 KYSE150 細胞以每孔 3×105/L個細胞接種于 6 孔板。細胞貼壁后，實驗組加入 IC50 濃度的含藥培養液，空白對照組加入等體積的完全培養液；BIX-01294 作用 24 h，收集各組細胞，加入 Annexin V-FITC 標記液（5 μL）和 PI（10 μL）混勻，室溫避光孵育 15 min，加入 400 μL 1×結合緩沖液，上機檢測細胞凋亡率。
1.3.4 免疫印跡實驗檢測蛋白的表達水平
細胞培養及藥物處理同 1.3.3。提取 BIX-01294 作用 24 h 的各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度。取各實驗組 30 μg 蛋白樣品行 PAGE-SDS 電泳，300 mA 恒流電轉移至 PVDF 膜。3% BSA 溶液封閉 1 h，一抗抗體室溫孵育 2 h，TBST 緩沖液洗膜 3 次，二抗抗體室溫孵育 1 h，TBST 緩沖液洗膜 3 次。滴加 ECL 試劑于凝膠成像系統內曝光，分析目的蛋白的表達，以 GAPDH 為實驗內參。
1.4 統計學分析
采用 SPSS 21.0 統計軟件包分析實驗數據，各組數據采用均數±標準差（±s）表示，采用 t 檢驗對數據進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BIX-01294 抑制食管鱗癌細胞的生長
不同濃度的 BIX-01294 作用于 EC109 和 KYSE150 細胞 24 h，顯著抑制食管鱗癌細胞的生長，呈劑量依賴關系；見圖 1。BIX-01294 作用 EC109 細胞和 KYSE150 細胞 24 h 的半數抑制濃度（IC50）分別為 4.85 μM 和 5.91 μM。
圖1
不同濃度 BIX-01294 對食管鱗癌細胞增殖的影響
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；*：
2.2 BIX-01294 抑制食管鱗癌細胞集落的形成
BIX-01294（IC50）作用 7 d，顯著抑制 EC109 和 KYSE150 細胞集落的形成；見圖 2。
圖2
BIX-01294（IC50 濃度）對食管鱗癌細胞集落形成的影響
a：BIX-01294（IC50 ）作用于EC109細胞；b：BIX-01294（IC50 ）作用于KYSE150細胞；***：
2.3 BIX-01294 誘導食管鱗癌細胞凋亡
BIX-01294（IC50）作用 24 h，EC109 細胞凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）為 42.5%±5.4%，與對照組（11.5%±2.1%）相比顯著上升（P<0.05）；KYSE150 細胞凋亡率為 49.2%±5.2%，與對照組（7.5%±0.9%）相比顯著上升（P<0.05）；見圖 3。
圖3
BIX-01294 誘導食管鱗癌細胞凋亡
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；***：
2.4 BIX-01294 抑制 G9a 催化產物的表達
免疫印跡實驗發現，BIX-01294 作用 24 h，抑制 EC109 和 KYSE150 細胞表達 G9a 的催化產物 H3K9me2；見圖 4。
圖4
BIX-01294 抑制 G9a 催化產物的表達
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.5 BIX-01294 促進 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白的表達
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白 γH2AX 的表達水平顯著上調；見圖 5。
圖5
BIX-01294 促進 DNA 雙鏈斷裂標記蛋白的表達
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.6 BIX-01294 促進食管鱗癌細胞表達凋亡相關蛋白
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 caspase3 和 PARP 的剪切片段 cleaved caspase3 和 cleaved PARP 的表達顯著增加；見圖6。
圖6
BIX-01294 促進食管鱗癌細胞表達凋亡相關蛋白
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
2.7 BIX-01294 激活線粒體凋亡途徑
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 細胞中 Bax 的表達顯著增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達顯著下降，cleaved caspase9 表達上升；見圖 7。
圖7
BIX-01294 激活線粒體凋亡途徑
a：BIX-01294作用于EC109細胞；b：BIX-01294作用于KYSE150細胞；**：
3 討論
研究證實，G9a 參與腫瘤細胞增殖[8]、侵襲轉移[9]、干性維持[10]等生命活動的調控。我們發現，小分子化合物 BIX-01294 靶向抑制 G9a 具有誘導食管鱗癌細胞凋亡的作用。Zhang 等[11]的研究結果顯示，合成的 G9a 抑制劑 GA001 通過激活 p21/Bim 級聯反應誘導乳腺癌細胞凋亡。BIX-01294 誘導急性 T 淋巴細胞白血病細胞[12]、肝癌細胞[13]的凋亡。86% 的膠質瘤組織中 G9a 表達陽性；BIX-01294 通過下調 Bcl-2 的表達，促進 Bax、caspase3 和 caspase9 的表達誘導 U251 細胞凋亡[14]。提示靶向抑制 G9a 誘導細胞凋亡是殺傷腫瘤的有效途徑之一。
我們發現，DNA 雙鏈斷裂標記蛋白 γH2AX 的表達在 BIX-01294 組細胞中顯著上調。磷酸化組蛋白 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是 DNA 發生雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）時組蛋白 H2AX 的 C 末端第 139 位絲氨酸發生磷酸化的形式，γH2AX 聚集于 DSBs 位點，繼而募集 DNA 損傷修復蛋白（53BP1、BRCA1 等）修復損傷維持基因組穩定性[15]。DSBs 是最致命的 DNA 損傷，不能修復的 DSBs 是誘發調亡的主要因素。在皮膚黑色素瘤組織中，γH2AX 的表達水平與 G9a 呈負相關[16]，提示 BIX-01294 誘導 DSBs 是其促進食管鱗癌細胞凋亡的機制之一。
線粒體凋亡途徑的激活是啟動細胞凋亡的誘因之一[17]。BIX-01294 抑制 G9a 的甲基轉移酶活性可促進食管鱗癌細胞表達 Bax，并且抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達下降，cleaved caspase9 蛋白表達上升，表明線粒體凋亡途徑參與 BIX-01294 誘導的食管鱗癌細胞凋亡。當 Bax 與 Bcl-2 比例上升或者 Bax 發生寡聚化將導致 Bax 在線粒體外膜上形成連通細胞質的孔道導致促凋亡內容物的外漏促進 caspase9 由酶原形式轉變成活性形式，進而激活下游細胞凋亡信號通路[17]。caspase 級聯反應中的效應蛋白 caspase3 在 BIX-01294 組細胞中被剪切激活；PARP 被 cleaved caspase3 水解成 89 和 24kD 的片段，失去修復 DNA 損傷的功能，受 PARP 負調控的核酸內切酶活性增高誘導細胞凋亡[18]。
本研究提示 G9a 可能是食管鱗癌潛在的治療靶點。有研究[19]發現，抑制 G9a 的表達具有上調雙特異性磷酸酶 4（DUSP4）的表達進而抑制 ERK1/2 通路誘導腫瘤細胞自噬性死亡的作用。G9a 通過抑制 CASP1 的表達抑制非小細胞肺癌細胞的侵襲轉移[9]。G9a 通過轉錄激活絲氨酸-甘氨酸生物合成通路促進腫瘤細胞的增殖[20]。BIX-01294 抑制 G9a 是否具有調控食管鱗癌細胞自噬和侵襲轉移的作用及機制有待進一步的研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：吳中杰負責設計研究、初稿撰寫；張雁飛、呂望、盛宏旭、朱林海負責查閱資料、數據整理和分析；胡奕負責論文審閱；胡堅指導和設計研究、負責論文審閱和修改。
