引用本文： 俞松良, 劉超男, 凌莉琴, 陳思, 李勤, 米健, 周靜. 氨甲環酸抑制體外循環誘導的大鼠肺部炎性反應. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(8): 933-939. doi: 10.7507/1007-4848.201912089 復制
體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）經過 60 余年的飛速發展已成為心臟直視手術、生命支持領域不可或缺的臨床技術。盡管大多數患者可順利恢復，仍有部分患者出現術后并發癥，其中 CPB 引起的呼吸功能障礙最常見[1-2]。術后并發癥的發生與 CPB 過程中血液成分與人工管道接觸、肝素-魚精蛋白復合物形成、缺血-再灌注損傷以及手術創傷應激等引發的全身性炎性反應相關[3]。患者臨床表現不一，嚴重者可出現多器官功能衰竭，甚至死亡[4]，急性肺損傷或呼吸窘迫綜合征是目前 CPB 后患者死亡的主要原因之一[5]。已有研究[6]發現 CPB 后 6 h 內全身炎癥相關因子［如白細胞介素（IL）-1、IL-8、C-反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 等］濃度呈持續升高狀態，但目前仍然缺乏針對 CPB 術后肺部炎性反應更深入的研究。
氨甲環酸是一種人工合成的低分子量賴氨酸類似物，半衰期為 80～120 min。氨甲環酸可以競爭性地與纖溶酶原/纖溶酶的賴氨酸結合位點結合，從而阻礙活化的纖溶酶與纖維蛋白的結合，抑制纖溶酶對纖維蛋白的降解[7]。氨甲環酸能有效抑制術中出血并降低術后血制品的輸注[8-9]，且較抑肽酶等其它抗纖溶藥物安全性更高[10]。此外，氨甲環酸還具有一定抗炎作用[11-14]。氨甲環酸在臨床獲得了廣泛的應用，目前關于氨甲環酸的使用時機與劑量使用方式的探索大多以減少患者術中出血量、降低術后風險為目的，但氨甲環酸使用方式的不同對患者機體炎性反應是否存在不同影響卻鮮有報道。
本研究通過在 CPB 不同時期給予大鼠不同劑量的氨甲環酸，檢測大鼠術后血液和肺泡灌洗液中炎性因子的濃度差異并觀測肺部炎性細胞滲出浸潤情況的區別，以討論 CPB 術中不同的氨甲環酸給藥方式與劑量是否對 CPB 誘導的小鼠肺部炎性反應產生影響。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
64 只雄性 SD 大鼠（體重 350～400 g）購于四川達碩有限公司。所有實驗動物飼養于四川大學華西醫學院動物飼養中心。大鼠被飼養于光線和溫度均受控的房間中，并允許自由飲食。所有動物的飼養和實驗程序都嚴格按照首都醫科大學動物醫學部動物護理與使用委員會（IACUC）的政策進行。
1.1.2 試劑
試劑包括 IL-6、IL-1β、TNF-α 酶聯免疫吸附法（ELISA 法）試劑盒（R&D Systems，美國）。
1.2 方法
1.2.1 分組
將 64 只 SD 大鼠隨機分配至 8 組中，每組 8 只，分別為空白組（N，大鼠僅接受了麻醉后氣管插管、動靜脈分離插管等操作）、CPB 組（C，對大鼠進行全套 CPB 手術操作并開機循環 1 h，并給予相同劑量肝素、魚精蛋白和膠體溶液以保證手術過程中輸液總量一致）、循環前給藥低劑量組（B25，25 mg/kg）、循環前給藥中劑量組（B50，50 mg/kg）、循環前給藥高劑量組（B100，100 mg/kg）、循環后給藥低劑量組（P25，25 mg/kg）、循環后給藥中劑量組（P50，50 mg/kg）、循環后給藥高劑量組（P100，100 mg/kg）。之后所有手術操作均在戊巴比妥麻醉下進行，以盡可能減少實驗動物在實驗過程中所受痛苦。
1.2.2 CPB 模型建立
采用 2% 戊巴比妥（50 mg/kg）行腹膜腔注射麻醉，待大鼠眼角反射消失后將大鼠軀干與頭部固定在專用大鼠固定板上，連接監護儀行心電監護。經口置入嬰兒喉鏡以暴露聲門，使用 14G 留置針針套穿過大鼠聲門后連接外部呼吸機并固定導管。麻醉及氣管插管過程中全程注意大鼠呼吸活動、心率（HR），若出現缺氧癥狀則及時停止操作，待大鼠生命體征平穩后繼續。呼吸機連接完畢且大鼠生命體征穩定后，于左側腹股溝行縱向切口，暴露、分離左股動脈和股靜脈，經股動脈置入 22G 套管針，使用 1 mg 肝素（500 IU/kg）封管，連接動脈監測儀持續監測大鼠動脈血壓（BP）。于頸正中線旁開行縱向切口，分離頸靜脈置入 16G 套管針作為靜脈通路、靜脈引流通路。循環前給藥組在頸靜脈插管成功后經過插管緩慢連續泵入預定濃度氨甲環酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）1 h，期間持續記錄大鼠生命體征數據（HR、BP 等）以確定 CPB 各個通路連接通暢、大鼠生命體征正常。緩慢啟動 CPB 泵（1～2 R/min），觀察靜脈血液在儲血槽中引流狀態，根據大鼠生命體征與 CPB 情況緩慢提升轉速至最終循環流量為 50 mL/（kg·min），氧合器氧氣流量為 0.5～0.8 L/min。采用加溫器在輸液管處加溫循環體液以維持大鼠體溫于 35.5℃～36.0℃。CPB 持續 1 h 后回輸 1/3 的泵管內血至大鼠體內，CPB 泵停機，將魚精蛋白（5 mg/mL）按肝素的 1.2 倍體積注入以中和肝素，另注入膠體溶液以保證各實驗鼠在手術過程中輸液總量一致。給藥組大鼠在魚精蛋白中和肝素后接受預定濃度的氨甲環酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的緩慢連續泵入 1 h，繼續觀察大鼠生命體征 1 h 后進行取材。
1.2.3 全血樣本收集
CPB 手術結束后，棄去股動脈插管處導管前端 2～3 mL 血液，分別收集全血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管 2 管（2 mL/管）、枸櫞酸鈉抗凝管 1 管（2 mL/管）。將 EDTA 抗凝血與枸櫞酸鈉抗凝血各 1 管送至四川大學華西醫學院實驗醫學科進行血細胞及凝血功能檢驗，剩余 EDTA 抗凝全血離心（1 700 g，4℃，15 min）后收集血漿于–80℃ 冰箱保存以待后續 ELISA 檢測。
1.2.4 肺泡灌洗液收集
血液樣本收集完成后，經大鼠氣管插管緩慢灌注生理鹽水 4 mL 于氣管內，輕拍胸部保證生理鹽水灌注充分，靜置 5 min 后反復抽吸、推注生理鹽水，最終盡可能多地收集肺泡灌洗液于離心管中（約 3 mL），–80℃ 冰箱保存以待后續檢測。
1.2.5 肺組織樣本收集與蘇木精-伊紅（HE）染色
肺泡灌洗液收集完成后分離大鼠左肺進行石蠟包埋，以 5 μm 厚度進行切片。二甲苯浸泡切片 10 min 脫蠟，無水乙醇 5 min 水化，然后分別在蘇木精溶液中浸泡 2 min、PBS 弱堿液中浸泡 20 s 反藍，自來水沖洗干凈晾干后伊紅溶液中浸泡 20 s，沖洗、脫水封片后用顯微鏡觀察切片。
1.2.6 血細胞分類計數及凝血功能檢測
使用全血細胞分析儀（XN-20 AIXM9000，希森美康，日本）檢測血常規［紅細胞計數（RBC）、血小板計數（PLT）、紅細胞比容（HCT）、白細胞計數（WBC）、中性粒細胞比例（NEUT%）等］，使用全自動凝血分析儀（CS5100，希森美康，日本）檢測凝血酶原時間（PT，凝固法）、活化部分凝血活酶時間（APTT，凝固法）、凝血酶時間（TT，凝固法）、纖維蛋白原（Thrombin，凝固法，547576，希森美康，日本）、纖維蛋白降解產物（FDP，免疫比濁法）和 D-D 二聚體（D-D，免疫比濁法）。
1.2.7 炎性因子檢測
采用 ELISA 法測定血漿及肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6 與 TNF-α 含量，實驗操作遵循試劑盒（R&D Systems，美國）說明書建議。同時測量所有收集的血漿與肺泡灌洗液樣本，以最大限度減少操作間的差異性。
1.3 統計學分析
使用 SPSS 19.0 進行數據分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，并使用單因素方差分析檢測各組間差異；非正態分布的計量資料采用中位數與上下四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
該研究已通過四川大學華西醫院動物倫理委員會審批，審批號：2015061A。
2 結果
2.1 CPB 導致炎性反應增強
CPB 術后由于大量液體輸入導致大鼠血液被稀釋，但 CPB 組和各實驗組樣本 WBC 與空白組差異無統計學意義（P>0.05）；見圖 1、表 1。中性粒細胞、IL-6 和 TNF-α 以及肺泡灌洗液中 IL-1β 和 TNF-α 在 CPB 后有明顯升高（P<0.05）；見圖 2、表 2。肺泡灌洗液中炎性因子水平較血液中升高更明顯（P<0.05）；見圖 2、表 2。肺組織切片樣本中，CPB 后終末細支氣管與血管周圍可見大量炎性細胞滲出浸潤；見圖 3。這提示 CPB 可增強炎性反應。
圖1
CPB 導致炎性反應
RBC（a）、HGB（b）、（c）、PLT（d）、WBC（e）和 NEUT%（f）（黑色圓點表示均值，黑色短線代表±標準差）；由于血液稀釋，CPB 組（C）、循環前給藥低劑量組（B25，25 mg/kg）、循環前給藥中劑量組（B50，50 mg/kg）、循環前給藥高劑量組（B100，100 mg/kg）、循環后給藥低劑量組（P25，25 mg/kg）、循環后給藥中劑量組（P50，50 mg/kg）、循環后給藥高劑量組（P100，100 mg/kg）RBC、HGB、HCT 和 PLT 較空白組低（
表1
各組全血細胞計數及凝血指標（
）
圖2
炎性因子濃度比較
a～c：分別為血漿中 IL-1β 、IL-6 與 TNF-α 濃度；d～f：分別為肺泡灌洗液中 IL-1β 、IL-6 與 TNF-α 的濃度（黑色圓點表示中位數，黑色短線代表四分位數間距）；a～c：血中 IL-1β 濃度均低于試劑盒檢測下限；CPB 組（C）血中 IL-6 濃度較空白組（N）升高（
表2
各組血液和肺泡灌洗液中炎性因子［M（P25，P75）］
圖3
大鼠肺部炎性細胞滲出
a～b：為空白組（N），可見支氣管為單層纖毛柱狀上皮結構，肺泡腔呈空泡狀薄壁結構，支氣管纖毛柱狀上皮結構清晰可見，肺泡腔結構完整；c～d：為 CPB 組（C），支氣管上皮杯狀細胞化生，支氣管腔狹窄，周圍可見大量炎性細胞浸潤；e～f：為循環前給藥組（B）；g～h：為循環后給藥組（P），支氣管周圍仍然可見炎性細胞浸潤但較 CPB 組明顯減少，可見正常支氣管結構
2.2 氨甲環酸可抑制炎性反應
不同給藥方式對炎性強度無明顯影響，氨甲環酸的使用能減少炎性因子的釋放，其中以 TNF-α 的下降最為明顯（P<0.05），但各用藥組組間無明顯差異（P>0.05）；見圖 2、表 2。通過 HE 染色觀察大鼠肺組織切片發現：大鼠肺終末細支氣管與血管周圍炎性細胞滲出情況較未使用氨甲環酸的 CPB 組減少；見圖 3。
3 討論
CPB 后機體全身炎性反應增強，肺臟也是受累臟器之一。肺臟是全身靜脈血回流的主要濾器，同時也是重要的代謝器官，血中的各類有毒物質易滯留在肺中造成損傷，另外在 CPB 中被激活的巨噬細胞、中性粒細胞及補體系統等可以通過在肺血管內聚集、粘附于內皮細胞等對肺造成直接傷害，它們釋放出的多種血管活性物質和炎性介質也會損傷、削弱肺功能。正因為肺組織具有易發生炎性損傷的特征，我們選取肺臟為主要樣本，并設計了循環開始前與循環結束后兩個氨甲環酸使用時間點，伴以 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 三種不同劑量進行實驗以進一步探索氨甲環酸對 CPB 后炎性反應的影響。
研究證實 CPB 可導致機體纖溶系統發生亢進：纖溶酶激活后纖維蛋白降解產物 D-D 二聚體生成增多，激活的纖溶酶與 D-D 二聚體可通過結合巨噬細胞表面膜連蛋白 A2 異四聚體使巨噬細胞 TNF-α 和 IL-6 分泌增加，進而激活全身炎性反應[15-17]。氨甲環酸能與纖溶酶原及纖溶酶表面賴氨酸位點競爭性結合，一方面可阻止纖維蛋白被纖溶酶降解，抑制纖溶亢進的發生；另一方面也抑制了纖溶酶和纖維蛋白裂解產物 D-D 二聚體對巨噬細胞系統的激活，從而起到抑制炎癥的作用。臨床數據證實，氨甲環酸的應用能有效降低患者術中出血風險以及減少術后血制品輸注量，且安全性較高，但使用小劑量和大劑量氨甲環酸在減少出血和輸血量方面的效果相似[8, 18-19]。目前氨甲環酸的給藥方式尚無統一的共識，各文獻報道差異較大，給藥方式包括：單次給藥、分次給藥、持續泵入、負荷量+維持量、負荷量+CPB 預充量+維持量，以及心包局部用藥等[15-16]。同時存在多種用藥劑量方案，包括：小劑量使用氨甲環酸（負荷量 10 mg/kg，維持量 2 mg/kg）[17]和大劑量使用氨甲環酸（負荷量 30 mg/kg，維持量 16 mg/kg，選擇性加入 2 mg/kg 的 CPB 預充量）[8]，巨大的差異性給臨床應用帶來了不便，且關于氨甲環酸使用方法對 CPB 術后患者機體炎性反應是否存在影響的研究較少。
藥代動力學顯示氨甲環酸抑制纖溶的有效血漿濃度為 10 μg/mL[20]，目前推薦的小劑量給藥方案（負荷量 10 mg/kg，維持量 2 mg/kg）可使血藥濃度達到 20 μg/mL，同時大劑量給藥方案（負荷量 30 mg/kg，維持量 16 mg/kg，選擇性加入 2 mg/kg 的 CPB 預充量）可使血藥濃度達到 90～180 μg/mL。結合藥代動力學結果，本次實驗中氨甲環酸低劑量組（循環前、后給藥 25 mg/kg）可使氨甲環酸血藥濃度超過 10 μg/mL，所以本實驗中設計使用的低、中、高劑量氨甲環酸均可保證氨甲環酸的抗纖溶作用，凝血功能相關檢測的結果也證實了所有使用了氨甲環酸的大鼠均未發生纖溶亢進。但是動物實驗顯示，給藥時機的改變或藥物用量的提升對于炎性反應嚴重程度無明顯影響。
在實驗中我們發現使用氨甲環酸可抑制巨噬細胞介導的 TNF-α 分泌，但并不能改變白細胞和中性粒細胞濃度在全血中的升高，這可能是由于氨甲環酸雖然阻斷了纖溶產物對炎性細胞的激活作用，但機體纖溶系統的激活并不是 CPB 介導的肺部炎癥發生的唯一因素，也與中性粒細胞在肺內的聚集、補體系統的激活、肺組織的缺血-再灌注損傷等相關。僅阻斷纖溶-單核巨噬細胞的促炎途徑，不足以抑制機體炎性反應的進一步發展，而氨甲環酸本身也未發現具備抑制補體激活或是降低內皮細胞通透性的作用，因此氨甲環酸無法抑制中性粒細胞絕對濃度的提升。
綜上所述，在大鼠 CPB 模型中，氨甲環酸的使用可有效減少巨噬細胞介導的炎性因子的釋放、減輕大鼠的肺炎性反應，但是單純增加給藥劑量或改變給藥時間點，并不能有效地降低炎性反應強度。鑒于目前關于在氨甲環酸高劑量用藥安全、藥物不良反應以及抗炎作用的發揮等方面仍有待進一步研究，本研究可為臨床應用提供參考。此外本研究通過動物實驗也提示，當存在出血風險或預估手術時間較長的情況下，建議在 CPB 開始前使用氨甲環酸。
利益沖突：無。
作者貢獻：俞松良負責論文設計、論文初稿撰寫；俞松良、劉超男、凌莉琴、陳思、李勤負責實施研究；俞松良、劉超男、陳思負責數據整理與分析；劉超男、米健、周靜負責論文審閱與修改。
體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）經過 60 余年的飛速發展已成為心臟直視手術、生命支持領域不可或缺的臨床技術。盡管大多數患者可順利恢復，仍有部分患者出現術后并發癥，其中 CPB 引起的呼吸功能障礙最常見[1-2]。術后并發癥的發生與 CPB 過程中血液成分與人工管道接觸、肝素-魚精蛋白復合物形成、缺血-再灌注損傷以及手術創傷應激等引發的全身性炎性反應相關[3]。患者臨床表現不一，嚴重者可出現多器官功能衰竭，甚至死亡[4]，急性肺損傷或呼吸窘迫綜合征是目前 CPB 后患者死亡的主要原因之一[5]。已有研究[6]發現 CPB 后 6 h 內全身炎癥相關因子［如白細胞介素（IL）-1、IL-8、C-反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 等］濃度呈持續升高狀態，但目前仍然缺乏針對 CPB 術后肺部炎性反應更深入的研究。
氨甲環酸是一種人工合成的低分子量賴氨酸類似物，半衰期為 80～120 min。氨甲環酸可以競爭性地與纖溶酶原/纖溶酶的賴氨酸結合位點結合，從而阻礙活化的纖溶酶與纖維蛋白的結合，抑制纖溶酶對纖維蛋白的降解[7]。氨甲環酸能有效抑制術中出血并降低術后血制品的輸注[8-9]，且較抑肽酶等其它抗纖溶藥物安全性更高[10]。此外，氨甲環酸還具有一定抗炎作用[11-14]。氨甲環酸在臨床獲得了廣泛的應用，目前關于氨甲環酸的使用時機與劑量使用方式的探索大多以減少患者術中出血量、降低術后風險為目的，但氨甲環酸使用方式的不同對患者機體炎性反應是否存在不同影響卻鮮有報道。
本研究通過在 CPB 不同時期給予大鼠不同劑量的氨甲環酸，檢測大鼠術后血液和肺泡灌洗液中炎性因子的濃度差異并觀測肺部炎性細胞滲出浸潤情況的區別，以討論 CPB 術中不同的氨甲環酸給藥方式與劑量是否對 CPB 誘導的小鼠肺部炎性反應產生影響。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
64 只雄性 SD 大鼠（體重 350～400 g）購于四川達碩有限公司。所有實驗動物飼養于四川大學華西醫學院動物飼養中心。大鼠被飼養于光線和溫度均受控的房間中，并允許自由飲食。所有動物的飼養和實驗程序都嚴格按照首都醫科大學動物醫學部動物護理與使用委員會（IACUC）的政策進行。
1.1.2 試劑
試劑包括 IL-6、IL-1β、TNF-α 酶聯免疫吸附法（ELISA 法）試劑盒（R&D Systems，美國）。
1.2 方法
1.2.1 分組
將 64 只 SD 大鼠隨機分配至 8 組中，每組 8 只，分別為空白組（N，大鼠僅接受了麻醉后氣管插管、動靜脈分離插管等操作）、CPB 組（C，對大鼠進行全套 CPB 手術操作并開機循環 1 h，并給予相同劑量肝素、魚精蛋白和膠體溶液以保證手術過程中輸液總量一致）、循環前給藥低劑量組（B25，25 mg/kg）、循環前給藥中劑量組（B50，50 mg/kg）、循環前給藥高劑量組（B100，100 mg/kg）、循環后給藥低劑量組（P25，25 mg/kg）、循環后給藥中劑量組（P50，50 mg/kg）、循環后給藥高劑量組（P100，100 mg/kg）。之后所有手術操作均在戊巴比妥麻醉下進行，以盡可能減少實驗動物在實驗過程中所受痛苦。
1.2.2 CPB 模型建立
采用 2% 戊巴比妥（50 mg/kg）行腹膜腔注射麻醉，待大鼠眼角反射消失后將大鼠軀干與頭部固定在專用大鼠固定板上，連接監護儀行心電監護。經口置入嬰兒喉鏡以暴露聲門，使用 14G 留置針針套穿過大鼠聲門后連接外部呼吸機并固定導管。麻醉及氣管插管過程中全程注意大鼠呼吸活動、心率（HR），若出現缺氧癥狀則及時停止操作，待大鼠生命體征平穩后繼續。呼吸機連接完畢且大鼠生命體征穩定后，于左側腹股溝行縱向切口，暴露、分離左股動脈和股靜脈，經股動脈置入 22G 套管針，使用 1 mg 肝素（500 IU/kg）封管，連接動脈監測儀持續監測大鼠動脈血壓（BP）。于頸正中線旁開行縱向切口，分離頸靜脈置入 16G 套管針作為靜脈通路、靜脈引流通路。循環前給藥組在頸靜脈插管成功后經過插管緩慢連續泵入預定濃度氨甲環酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）1 h，期間持續記錄大鼠生命體征數據（HR、BP 等）以確定 CPB 各個通路連接通暢、大鼠生命體征正常。緩慢啟動 CPB 泵（1～2 R/min），觀察靜脈血液在儲血槽中引流狀態，根據大鼠生命體征與 CPB 情況緩慢提升轉速至最終循環流量為 50 mL/（kg·min），氧合器氧氣流量為 0.5～0.8 L/min。采用加溫器在輸液管處加溫循環體液以維持大鼠體溫于 35.5℃～36.0℃。CPB 持續 1 h 后回輸 1/3 的泵管內血至大鼠體內，CPB 泵停機，將魚精蛋白（5 mg/mL）按肝素的 1.2 倍體積注入以中和肝素，另注入膠體溶液以保證各實驗鼠在手術過程中輸液總量一致。給藥組大鼠在魚精蛋白中和肝素后接受預定濃度的氨甲環酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的緩慢連續泵入 1 h，繼續觀察大鼠生命體征 1 h 后進行取材。
1.2.3 全血樣本收集
CPB 手術結束后，棄去股動脈插管處導管前端 2～3 mL 血液，分別收集全血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管 2 管（2 mL/管）、枸櫞酸鈉抗凝管 1 管（2 mL/管）。將 EDTA 抗凝血與枸櫞酸鈉抗凝血各 1 管送至四川大學華西醫學院實驗醫學科進行血細胞及凝血功能檢驗，剩余 EDTA 抗凝全血離心（1 700 g，4℃，15 min）后收集血漿于–80℃ 冰箱保存以待后續 ELISA 檢測。
1.2.4 肺泡灌洗液收集
血液樣本收集完成后，經大鼠氣管插管緩慢灌注生理鹽水 4 mL 于氣管內，輕拍胸部保證生理鹽水灌注充分，靜置 5 min 后反復抽吸、推注生理鹽水，最終盡可能多地收集肺泡灌洗液于離心管中（約 3 mL），–80℃ 冰箱保存以待后續檢測。
1.2.5 肺組織樣本收集與蘇木精-伊紅（HE）染色
肺泡灌洗液收集完成后分離大鼠左肺進行石蠟包埋，以 5 μm 厚度進行切片。二甲苯浸泡切片 10 min 脫蠟，無水乙醇 5 min 水化，然后分別在蘇木精溶液中浸泡 2 min、PBS 弱堿液中浸泡 20 s 反藍，自來水沖洗干凈晾干后伊紅溶液中浸泡 20 s，沖洗、脫水封片后用顯微鏡觀察切片。
1.2.6 血細胞分類計數及凝血功能檢測
使用全血細胞分析儀（XN-20 AIXM9000，希森美康，日本）檢測血常規［紅細胞計數（RBC）、血小板計數（PLT）、紅細胞比容（HCT）、白細胞計數（WBC）、中性粒細胞比例（NEUT%）等］，使用全自動凝血分析儀（CS5100，希森美康，日本）檢測凝血酶原時間（PT，凝固法）、活化部分凝血活酶時間（APTT，凝固法）、凝血酶時間（TT，凝固法）、纖維蛋白原（Thrombin，凝固法，547576，希森美康，日本）、纖維蛋白降解產物（FDP，免疫比濁法）和 D-D 二聚體（D-D，免疫比濁法）。
1.2.7 炎性因子檢測
采用 ELISA 法測定血漿及肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6 與 TNF-α 含量，實驗操作遵循試劑盒（R&D Systems，美國）說明書建議。同時測量所有收集的血漿與肺泡灌洗液樣本，以最大限度減少操作間的差異性。
1.3 統計學分析
使用 SPSS 19.0 進行數據分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，并使用單因素方差分析檢測各組間差異；非正態分布的計量資料采用中位數與上下四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
該研究已通過四川大學華西醫院動物倫理委員會審批，審批號：2015061A。
2 結果
2.1 CPB 導致炎性反應增強
CPB 術后由于大量液體輸入導致大鼠血液被稀釋，但 CPB 組和各實驗組樣本 WBC 與空白組差異無統計學意義（P>0.05）；見圖 1、表 1。中性粒細胞、IL-6 和 TNF-α 以及肺泡灌洗液中 IL-1β 和 TNF-α 在 CPB 后有明顯升高（P<0.05）；見圖 2、表 2。肺泡灌洗液中炎性因子水平較血液中升高更明顯（P<0.05）；見圖 2、表 2。肺組織切片樣本中，CPB 后終末細支氣管與血管周圍可見大量炎性細胞滲出浸潤；見圖 3。這提示 CPB 可增強炎性反應。
圖1
CPB 導致炎性反應
RBC（a）、HGB（b）、（c）、PLT（d）、WBC（e）和 NEUT%（f）（黑色圓點表示均值，黑色短線代表±標準差）；由于血液稀釋，CPB 組（C）、循環前給藥低劑量組（B25，25 mg/kg）、循環前給藥中劑量組（B50，50 mg/kg）、循環前給藥高劑量組（B100，100 mg/kg）、循環后給藥低劑量組（P25，25 mg/kg）、循環后給藥中劑量組（P50，50 mg/kg）、循環后給藥高劑量組（P100，100 mg/kg）RBC、HGB、HCT 和 PLT 較空白組低（
表1
各組全血細胞計數及凝血指標（）
圖2
炎性因子濃度比較
a～c：分別為血漿中 IL-1β 、IL-6 與 TNF-α 濃度；d～f：分別為肺泡灌洗液中 IL-1β 、IL-6 與 TNF-α 的濃度（黑色圓點表示中位數，黑色短線代表四分位數間距）；a～c：血中 IL-1β 濃度均低于試劑盒檢測下限；CPB 組（C）血中 IL-6 濃度較空白組（N）升高（
表2
各組血液和肺泡灌洗液中炎性因子［M（P25，P75）］
圖3
大鼠肺部炎性細胞滲出
a～b：為空白組（N），可見支氣管為單層纖毛柱狀上皮結構，肺泡腔呈空泡狀薄壁結構，支氣管纖毛柱狀上皮結構清晰可見，肺泡腔結構完整；c～d：為 CPB 組（C），支氣管上皮杯狀細胞化生，支氣管腔狹窄，周圍可見大量炎性細胞浸潤；e～f：為循環前給藥組（B）；g～h：為循環后給藥組（P），支氣管周圍仍然可見炎性細胞浸潤但較 CPB 組明顯減少，可見正常支氣管結構
2.2 氨甲環酸可抑制炎性反應
不同給藥方式對炎性強度無明顯影響，氨甲環酸的使用能減少炎性因子的釋放，其中以 TNF-α 的下降最為明顯（P<0.05），但各用藥組組間無明顯差異（P>0.05）；見圖 2、表 2。通過 HE 染色觀察大鼠肺組織切片發現：大鼠肺終末細支氣管與血管周圍炎性細胞滲出情況較未使用氨甲環酸的 CPB 組減少；見圖 3。
3 討論
CPB 后機體全身炎性反應增強，肺臟也是受累臟器之一。肺臟是全身靜脈血回流的主要濾器，同時也是重要的代謝器官，血中的各類有毒物質易滯留在肺中造成損傷，另外在 CPB 中被激活的巨噬細胞、中性粒細胞及補體系統等可以通過在肺血管內聚集、粘附于內皮細胞等對肺造成直接傷害，它們釋放出的多種血管活性物質和炎性介質也會損傷、削弱肺功能。正因為肺組織具有易發生炎性損傷的特征，我們選取肺臟為主要樣本，并設計了循環開始前與循環結束后兩個氨甲環酸使用時間點，伴以 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 三種不同劑量進行實驗以進一步探索氨甲環酸對 CPB 后炎性反應的影響。
研究證實 CPB 可導致機體纖溶系統發生亢進：纖溶酶激活后纖維蛋白降解產物 D-D 二聚體生成增多，激活的纖溶酶與 D-D 二聚體可通過結合巨噬細胞表面膜連蛋白 A2 異四聚體使巨噬細胞 TNF-α 和 IL-6 分泌增加，進而激活全身炎性反應[15-17]。氨甲環酸能與纖溶酶原及纖溶酶表面賴氨酸位點競爭性結合，一方面可阻止纖維蛋白被纖溶酶降解，抑制纖溶亢進的發生；另一方面也抑制了纖溶酶和纖維蛋白裂解產物 D-D 二聚體對巨噬細胞系統的激活，從而起到抑制炎癥的作用。臨床數據證實，氨甲環酸的應用能有效降低患者術中出血風險以及減少術后血制品輸注量，且安全性較高，但使用小劑量和大劑量氨甲環酸在減少出血和輸血量方面的效果相似[8, 18-19]。目前氨甲環酸的給藥方式尚無統一的共識，各文獻報道差異較大，給藥方式包括：單次給藥、分次給藥、持續泵入、負荷量+維持量、負荷量+CPB 預充量+維持量，以及心包局部用藥等[15-16]。同時存在多種用藥劑量方案，包括：小劑量使用氨甲環酸（負荷量 10 mg/kg，維持量 2 mg/kg）[17]和大劑量使用氨甲環酸（負荷量 30 mg/kg，維持量 16 mg/kg，選擇性加入 2 mg/kg 的 CPB 預充量）[8]，巨大的差異性給臨床應用帶來了不便，且關于氨甲環酸使用方法對 CPB 術后患者機體炎性反應是否存在影響的研究較少。
藥代動力學顯示氨甲環酸抑制纖溶的有效血漿濃度為 10 μg/mL[20]，目前推薦的小劑量給藥方案（負荷量 10 mg/kg，維持量 2 mg/kg）可使血藥濃度達到 20 μg/mL，同時大劑量給藥方案（負荷量 30 mg/kg，維持量 16 mg/kg，選擇性加入 2 mg/kg 的 CPB 預充量）可使血藥濃度達到 90～180 μg/mL。結合藥代動力學結果，本次實驗中氨甲環酸低劑量組（循環前、后給藥 25 mg/kg）可使氨甲環酸血藥濃度超過 10 μg/mL，所以本實驗中設計使用的低、中、高劑量氨甲環酸均可保證氨甲環酸的抗纖溶作用，凝血功能相關檢測的結果也證實了所有使用了氨甲環酸的大鼠均未發生纖溶亢進。但是動物實驗顯示，給藥時機的改變或藥物用量的提升對于炎性反應嚴重程度無明顯影響。
在實驗中我們發現使用氨甲環酸可抑制巨噬細胞介導的 TNF-α 分泌，但并不能改變白細胞和中性粒細胞濃度在全血中的升高，這可能是由于氨甲環酸雖然阻斷了纖溶產物對炎性細胞的激活作用，但機體纖溶系統的激活并不是 CPB 介導的肺部炎癥發生的唯一因素，也與中性粒細胞在肺內的聚集、補體系統的激活、肺組織的缺血-再灌注損傷等相關。僅阻斷纖溶-單核巨噬細胞的促炎途徑，不足以抑制機體炎性反應的進一步發展，而氨甲環酸本身也未發現具備抑制補體激活或是降低內皮細胞通透性的作用，因此氨甲環酸無法抑制中性粒細胞絕對濃度的提升。
綜上所述，在大鼠 CPB 模型中，氨甲環酸的使用可有效減少巨噬細胞介導的炎性因子的釋放、減輕大鼠的肺炎性反應，但是單純增加給藥劑量或改變給藥時間點，并不能有效地降低炎性反應強度。鑒于目前關于在氨甲環酸高劑量用藥安全、藥物不良反應以及抗炎作用的發揮等方面仍有待進一步研究，本研究可為臨床應用提供參考。此外本研究通過動物實驗也提示，當存在出血風險或預估手術時間較長的情況下，建議在 CPB 開始前使用氨甲環酸。
利益沖突：無。
作者貢獻：俞松良負責論文設計、論文初稿撰寫；俞松良、劉超男、凌莉琴、陳思、李勤負責實施研究；俞松良、劉超男、陳思負責數據整理與分析；劉超男、米健、周靜負責論文審閱與修改。
