引用本文： 劉文豪, 鄭開福, 王磊, 張豪, 冀晉杰, 李小飛, 趙晉波. 比格犬氣管軟化模型建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(7): 824-829. doi: 10.7507/1007-4848.201912077 復制
氣管軟化癥是由于先天或后天因素造成軟骨環缺乏應有的硬度，導致氣管軟化塌陷，進而引起通氣不足、咳嗽、反復下呼吸道感染等癥狀的一種疾病[1-2]。氣管軟化癥在嬰兒中發病率約為 1/2 500～1/1 500[1, 3]。成人氣管軟化癥多發生于中老年患者[4]，吸煙者患病率比普通人群高[5]，日本的一項針對有肺部疾病患者的研究[6]發現氣管和支氣管軟化癥發生率為 12.7%。氣管軟化癥嚴重影響患者生命及生活質量，急需對其治療方法進行進一步的研究。目前，臨床上尚未建立標準的氣管軟化癥診斷及治療方法[7-10]，故迫切需要一種能夠模擬氣管軟化癥的動物模型。本研究擬通過剝離氣管軟骨環，建立一種能夠模擬氣管軟化癥的比格犬標準實驗動物模型。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
材料及設備包括：舒泰 50 注射液（維克公司，法國）、頭孢曲松鈉注射液（上海上藥新亞藥業有限公司，中國）、硫酸阿托品（上海全宇，中國）、丙泊酚（西安力邦制藥有限公司，中國）、羅庫溴銨注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，中國）、電刀（GD350-B，上海滬通，中國）、麻醉呼吸機（YY-Ⅲ型，飛泰醫療，中國）、數字化 X 線片機（MNF-300P，杭州美諾瓦醫療科技有限公司，中國）、多功能監護儀（iMEC-8Vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，中國）、氣管鏡（XZ-3，上海精密儀器儀表有限公司，中國）、注射泵（TS-1B，保定蘭格恒流泵有限公司，中國）。
1.2 動物樣本量估算
為了在達到檢驗效能的基礎上，盡量減少實驗動物的樣本量。我們使用 Power And Sample Size 在線軟件（http://www.powerandsamplesize.com）對實驗所需最小動物樣本量進行估算。根據文獻[2]及預實驗結果，我們設檢驗水準 α=0.05；檢驗效能（1-β）為 0.9；輕度氣管軟化（mild tracheomalacia，MTM）組術后通暢度均值 25%；重度氣管軟化（severe tracheomalacia，STM）組術后通暢度均值 10%；術后通暢度標準差 5%；兩組樣本量比 1∶1。計算得到所需最小動物樣本量一共為 6 只。
1.3 實驗動物和分組
健康 12～18 月齡雄性比格犬 6 只，體重 10～15 kg，由西安迪樂普生物公司提供，生產許可證為 SCXK（陜）2014-001。為探索剝離不同范圍軟骨環對氣管軟化的影響，模擬臨床不同程度的氣管軟化狀態，隨機將比格犬分為兩組：MTM 組和 STM 組，每組 3 只。
1.4 術前準備和手術過程
比格犬術前禁食 12 h，禁水 4 h，并備頸部皮膚。術前 15 min 給予硫酸阿托品（0.1 mg/kg）減少呼吸道分泌，肌肉注射舒泰 50（7 mg/kg）誘導麻醉。待其進入淺昏迷后，于右前肢行靜脈穿刺術，置入寵物用靜脈留置針，靜脈推注丙泊酚 6 mg/kg、羅庫溴銨 0.6 mg/kg 誘導麻醉。選擇 8 號氣管插管插入犬氣道中。連接呼吸機及多功能監護儀，監測其血氧、呼吸、心率、血壓。
手術開始前，于切口周圍注射 1% 利多卡因浸潤麻醉。術中持續泵注丙泊酚 15 mg/（kg·h），羅庫溴銨 7 μg/（kg·min）維持麻醉。犬取仰臥位固定，切開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉筋膜，暴露頸部氣管。為建立標準，所有動物均選擇從甲狀軟骨下第 5 個軟骨環開始，連續剝離 6 個軟骨環，長度約 3～4 cm。剝離方法（圖 1 ）：首先，自軟骨中部切開軟骨，將其提起，注意勿損傷深部組織，采用手術刀小心將軟骨環分別向兩側剝離，直到氣管膜部。MTM 組：剝除氣管軟骨環時，到達膜部后，不全部剝除軟骨，而是保留約 5 mm 軟骨部分剩余；STM 組：剝除氣管軟骨時，盡量向膜部剝除，直到肉眼無法分辨為止，盡量剝除整個軟骨環。剝離完成后于術野采用生理鹽水沖洗，同時通氣，檢查黏膜是否存在破損。若存在破損，則使用 4-0 Prolene 線縫合破口。術畢，留置橡膠管引流，外接負壓引流器。逐層縫合傷口，完成手術。
圖1
手術步驟
a：游離氣管；b：從中間部分離斷軟骨環；c：小心將軟骨環向兩側剝離；d：連續剝除 6 個氣管軟骨環
1.5 術后護理及觀察指標
將犬置于獨立干凈的犬舍中，術后 2 h 提供飲水，12 h 后供正常飲食。術后 3 d 每日肌注頭孢曲松鈉（100 mg/kg）。24 h 引流量<20 mL 拔除引流管。采用 Westley 喉炎評分評估犬氣道通暢程度（表 1）[11]。記錄指標包括犬的生存時間及犬 Westley 喉炎評分。
表1
Westley 喉炎評分表
1.6 術后檢查
1.6.1 側位 X 線片檢查
所有實驗犬術后即刻進行 X 線片檢查。實驗犬側臥于 X 線片檢查臺上行 X 線片檢查。使用 ImageJ 1.8.0 對 X 線片測量，選擇與犬頸椎第 2 椎間隙平齊面為參考面，氣道參考橫截圓面積為 πR
（圖 2a）。定義氣道通暢度為氣道橫截圓面積/參考橫截圓面積。考慮到比格犬可能無法耐受連續多次麻醉，故未行術前側位 X 線片檢查。為評估比格犬術前氣道通暢度，我們以軟化段氣管上口半徑（
）與下口半徑（
）的平均值（
+
）/2 估算為犬術前氣道橫截圓半徑，術前氣道橫截圓面積為 π（
+
）2/4，即術前氣道通暢度為（
+
）2/4R
。最狹窄處橫截圓面積 πR
與參考橫截圓面積比值 R
/R
為術后通暢度。每張 X 線片由 2 位研究者別獨立測量計算，兩者平均值為最終結果，由其中 1 位間隔 1 周重復測量。
圖2
氣管通暢度比較
a：犬氣道通暢度測量方法；b：MTM、STM 組術后氣道通暢度比較，兩組差異有統計學意義；c：MTM 組手術前后氣道通暢度比較，術后氣道通暢度明顯下降；d：STM 組手術前后氣道通暢度比較，術后氣道通暢度明顯下降
1.6.2 氣管鏡檢查
術中完成軟骨剝離后，將氣管插管稍向外退出，快速斷開氣管插管與呼吸機連接，將纖維支氣管鏡通過氣道插入氣管，仔細觀察剝除段氣管通暢情況：包括施加外力作用下氣管維持通暢情況；犬自主呼吸恢復情況下剝除段氣管隨呼吸運動塌陷和軟化情況。
1.6.3 組織病理檢查
MTM 組犬術后 2 周時收集病理標本，麻醉方法同前，犬仰臥位固定，取頸正中切口，鈍性分離頸部肌肉筋膜，暴露頸部軟化段氣管。迅速將軟化段氣管取出，并浸泡于 10% 福爾馬林固定，使用石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（HE）染色。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 20.0 及 GraphPad Prism 8.0.2 統計軟件對實驗數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，兩組數據比較時若方差齊，使用 t 檢驗，方差不齊時用 t′檢驗；若兩組數據為配對數據時，采用配對 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。使用組內相關系數（ ICC）評估氣道通暢度的觀察者組內及不同觀察者組間一致性。
1.8 倫理審查
本實驗經唐都醫院倫理委員會批準，倫理批準號：TDLL-2016196-450。
2 結果
2.1 術后臨床癥狀、生存時間及呼吸評分結果
MTM 組（n=3）術后均出現喘鳴、咳嗽、吸氣受限等明顯氣道阻塞癥狀（表 2 ）。Westley 喉炎評分在術后 3 d 內升高，后逐漸下降，到 1 周時趨于穩定，但氣道阻塞癥狀仍存在（圖 3）。2 周后安樂處死 MTM 組犬并收集標本進行進一步后續檢查。STM 組（n=3）術后均發生嚴重的氣管狹窄，在拔管后 1 h 內死亡。
表2
犬術后癥狀及生存情況
圖3
MTM 組實驗動物術后 Westley 評分變化情況
2.2 犬術中氣管鏡及術后側位 X 線片結果
MTM 組犬術中見氣管軟骨殘端（圖 4a），氣管鏡顯示氣管軟骨剝除段塌陷（圖 4b），狹窄明顯，尤其是吸氣時，氣管壁軟化塌陷嚴重；術后 X 線片顯示氣管軟骨剝除段橫截面積明顯減小（圖 4c），通暢度降低。STM 組未見明顯氣管軟骨殘端（圖 4d），氣管鏡顯示氣管軟骨剝除段無論是否存在呼吸運動，均完全塌陷（圖 4e），側位 X 線片顯示氣管軟骨剝離段幾乎完全阻塞（圖 4f）。對 X 線片影像測量動物模型術后氣道通暢度的重復性進行評估，氣道通暢度觀察者組內重復測量信度 ICC=0.973（P<0.001），組間測量信度 ICC=0.988（P<0.001），該方法有著良好的可重復性。MTM 組犬術后平均通暢度 26.50%±4.95%，STM 組術后平均通暢度 6.80%±5.34%。兩組間術后氣管通暢度差異有統計學意義（圖 2b）。MTM、STM 兩組術前術后通暢度比較，兩組氣道術后氣道通暢度均低于術前通暢度，通暢度變化差異有統計學意義（圖 2c，圖 2d）。
圖4
犬術中情況和氣管鏡、X 線片結果
a：MTM 組術中情況；b：MTM 組術中氣管鏡結果；c：MTM 組術后側位 X 線片結果；d：STM 組術中情況；e：STM 組術中氣管鏡結果；f：STM 組術后側位 X 線片結果
2.3 病理檢查結果
MTM、STM 組氣管病理切片 HE 染色結果顯示：MTM 組氣道纖毛柱狀上皮完好，氣管軟骨組織部分剝除（圖 5a），STM 組犬氣管組織 HE 染色顯示氣管內壁黏膜層及黏膜下層完好，軟骨幾乎完全剝除，僅兩側壁少量軟骨組織剩余（圖 5b）。
圖5
氣管病理切片結果
a：MTM 組（保留部分軟骨），氣道纖毛柱狀上皮完好，氣管軟骨組織部分剝除；b：STM 組（氣管軟骨盡量完全剝除），氣管內壁黏膜層及黏膜下層完好，軟骨幾乎完全剝除，僅兩側壁少量軟骨組織剩余
3 討論
目前，國內尚無成功建立比格犬氣管軟化模型的報道。在本研究中，比格犬在接受氣管軟骨剝離術后，出現明顯的呼吸道阻塞癥狀，且氣管鏡、側位 X 線片均顯示犬術后軟骨剝離段出現氣道塌陷，氣管狹窄明顯。拔除氣管插管后，MTM 組動物存活，但存在氣道狹窄的癥狀，STM 組動物無法存活。MTM、STM 組動物的氣道通暢度均比術前有了明顯降低。上述結果說明建模成功，該模型能夠模擬臨床氣管軟化情況。
是否能夠模擬臨床不同嚴重程度的氣管軟化情況是動物建模的一個難點[12-14]。在本研究中，我們通過控制氣管軟骨剝離程度能夠建立 MTM、STM 兩組不同氣管軟化程度的動物模型。MTM 組術中能看到明顯氣管軟骨剩余，剩余氣管軟骨仍起到支撐作用，氣道未完全塌陷，犬有氣道狹窄癥狀但仍能生存。STM 組犬氣管軟骨幾乎完全被剝離，氣道完全塌陷，犬無法正常通氣而死亡。除存活情況之外，犬術后氣道通暢度結果亦證明兩組動物之間氣管軟化程度不同。MTM 組犬 Westley 喉炎評分術后第 3 d 內逐步上升，應為術后氣管周圍水腫組織及滲出液壓迫，導致狹窄程度進一步加重。1 周后滲出液及水腫逐步吸收，評分趨于平穩，但仍存在氣道阻塞現象。2010 年 Tsukada 等[14]利用羊為實驗模型，通過剝除 10 個連續氣管軟骨環的方法，建立氣管軟化模型，建模后即刻植入硅酮內支架以防止氣道的過度坍塌。Zopf 等[2]通過剝除 5 個連續氣管軟骨環構建豬氣管軟化模型，對照組模型動物術后 24 h 內死亡，實驗組模型動物接受 3D 打印外支架的植入均成功存活。上述研究均只是建立了單一的重度氣管軟化模型，并未對如何建立輕度氣管軟化模型進行探索。在本研究中，我們不僅成功建立重度氣管軟化模型，更進一步通過調整軟骨環剝離的程度，建立一種術后可長期存活、不需內支架支撐、并且氣管軟化狹窄癥狀穩定存在的輕度氣管軟化動物模型。這兩種嚴重程度不同的氣管軟化模型為該疾病診斷治療提供了良好的研究平臺。此外，同豬、羊等實驗動物相比，使用比格犬為實驗模型還存在動物體重輕、易于操作、抗病能力強等優點。
在本模型建立過程中，需要注意幾點：（1）對氣管軟骨進行剝離時，應將插管套囊置于軟骨剝離部分上端或者下端，防止其對操作產生干擾；（2）術中需多次斷開呼吸機，利用氣管鏡對氣道進行觀察，若采用吸入麻醉維持，此操作會影響麻醉效果，應采取靜脈維持麻醉；（3）術中應盡量避免破壞氣管內壁，防止呼吸道感染。若氣管內壁破損，需用 4-0 Prolene 線縫合破口。
本模型也存在一定的局限性。首先，本研究選取成年比格犬為模型動物，與嬰幼兒的氣管軟化情況存在差異。其次，臨床上存在先天性與獲得性氣管軟化[15]，該模型是通過軟骨環剝離實現氣管軟化，并非先天形成，因此該模型較適合于模擬獲得性氣管軟化患者。但是，在缺少大動物氣管軟化癥模型的情況下，我們建立的模型具有可重復性好、手術簡單、軟化癥狀模擬效果好等優點，可為氣管軟化癥治療研究提供一種標準的動物模型。
綜上，本研究通過剝離氣管軟骨成功建立比格犬氣管軟化模型。該模型能夠模擬不同程度的氣管軟化癥的臨床癥狀及病理生理表現，并且具有手術操作簡單、可重復性好等優點，可廣泛應用于氣管軟化癥的標準化診斷治療等研究中。
利益沖突：無。
作者貢獻：趙晉波、李小飛負責課題構思與設計；冀晉杰負責動物麻醉、文章修改；趙晉波、劉文豪、鄭開福、王磊、張豪負責動物手術、文章修改；劉文豪、鄭開福負責資料收集、數據統計及文章撰寫。
氣管軟化癥是由于先天或后天因素造成軟骨環缺乏應有的硬度，導致氣管軟化塌陷，進而引起通氣不足、咳嗽、反復下呼吸道感染等癥狀的一種疾病[1-2]。氣管軟化癥在嬰兒中發病率約為 1/2 500～1/1 500[1, 3]。成人氣管軟化癥多發生于中老年患者[4]，吸煙者患病率比普通人群高[5]，日本的一項針對有肺部疾病患者的研究[6]發現氣管和支氣管軟化癥發生率為 12.7%。氣管軟化癥嚴重影響患者生命及生活質量，急需對其治療方法進行進一步的研究。目前，臨床上尚未建立標準的氣管軟化癥診斷及治療方法[7-10]，故迫切需要一種能夠模擬氣管軟化癥的動物模型。本研究擬通過剝離氣管軟骨環，建立一種能夠模擬氣管軟化癥的比格犬標準實驗動物模型。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
材料及設備包括：舒泰 50 注射液（維克公司，法國）、頭孢曲松鈉注射液（上海上藥新亞藥業有限公司，中國）、硫酸阿托品（上海全宇，中國）、丙泊酚（西安力邦制藥有限公司，中國）、羅庫溴銨注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，中國）、電刀（GD350-B，上海滬通，中國）、麻醉呼吸機（YY-Ⅲ型，飛泰醫療，中國）、數字化 X 線片機（MNF-300P，杭州美諾瓦醫療科技有限公司，中國）、多功能監護儀（iMEC-8Vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，中國）、氣管鏡（XZ-3，上海精密儀器儀表有限公司，中國）、注射泵（TS-1B，保定蘭格恒流泵有限公司，中國）。
1.2 動物樣本量估算
為了在達到檢驗效能的基礎上，盡量減少實驗動物的樣本量。我們使用 Power And Sample Size 在線軟件（http://www.powerandsamplesize.com）對實驗所需最小動物樣本量進行估算。根據文獻[2]及預實驗結果，我們設檢驗水準 α=0.05；檢驗效能（1-β）為 0.9；輕度氣管軟化（mild tracheomalacia，MTM）組術后通暢度均值 25%；重度氣管軟化（severe tracheomalacia，STM）組術后通暢度均值 10%；術后通暢度標準差 5%；兩組樣本量比 1∶1。計算得到所需最小動物樣本量一共為 6 只。
1.3 實驗動物和分組
健康 12～18 月齡雄性比格犬 6 只，體重 10～15 kg，由西安迪樂普生物公司提供，生產許可證為 SCXK（陜）2014-001。為探索剝離不同范圍軟骨環對氣管軟化的影響，模擬臨床不同程度的氣管軟化狀態，隨機將比格犬分為兩組：MTM 組和 STM 組，每組 3 只。
1.4 術前準備和手術過程
比格犬術前禁食 12 h，禁水 4 h，并備頸部皮膚。術前 15 min 給予硫酸阿托品（0.1 mg/kg）減少呼吸道分泌，肌肉注射舒泰 50（7 mg/kg）誘導麻醉。待其進入淺昏迷后，于右前肢行靜脈穿刺術，置入寵物用靜脈留置針，靜脈推注丙泊酚 6 mg/kg、羅庫溴銨 0.6 mg/kg 誘導麻醉。選擇 8 號氣管插管插入犬氣道中。連接呼吸機及多功能監護儀，監測其血氧、呼吸、心率、血壓。
手術開始前，于切口周圍注射 1% 利多卡因浸潤麻醉。術中持續泵注丙泊酚 15 mg/（kg·h），羅庫溴銨 7 μg/（kg·min）維持麻醉。犬取仰臥位固定，切開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉筋膜，暴露頸部氣管。為建立標準，所有動物均選擇從甲狀軟骨下第 5 個軟骨環開始，連續剝離 6 個軟骨環，長度約 3～4 cm。剝離方法（圖 1 ）：首先，自軟骨中部切開軟骨，將其提起，注意勿損傷深部組織，采用手術刀小心將軟骨環分別向兩側剝離，直到氣管膜部。MTM 組：剝除氣管軟骨環時，到達膜部后，不全部剝除軟骨，而是保留約 5 mm 軟骨部分剩余；STM 組：剝除氣管軟骨時，盡量向膜部剝除，直到肉眼無法分辨為止，盡量剝除整個軟骨環。剝離完成后于術野采用生理鹽水沖洗，同時通氣，檢查黏膜是否存在破損。若存在破損，則使用 4-0 Prolene 線縫合破口。術畢，留置橡膠管引流，外接負壓引流器。逐層縫合傷口，完成手術。
圖1
手術步驟
a：游離氣管；b：從中間部分離斷軟骨環；c：小心將軟骨環向兩側剝離；d：連續剝除 6 個氣管軟骨環
1.5 術后護理及觀察指標
將犬置于獨立干凈的犬舍中，術后 2 h 提供飲水，12 h 后供正常飲食。術后 3 d 每日肌注頭孢曲松鈉（100 mg/kg）。24 h 引流量<20 mL 拔除引流管。采用 Westley 喉炎評分評估犬氣道通暢程度（表 1）[11]。記錄指標包括犬的生存時間及犬 Westley 喉炎評分。
表1
Westley 喉炎評分表
1.6 術后檢查
1.6.1 側位 X 線片檢查
所有實驗犬術后即刻進行 X 線片檢查。實驗犬側臥于 X 線片檢查臺上行 X 線片檢查。使用 ImageJ 1.8.0 對 X 線片測量，選擇與犬頸椎第 2 椎間隙平齊面為參考面，氣道參考橫截圓面積為 πR（圖 2a）。定義氣道通暢度為氣道橫截圓面積/參考橫截圓面積。考慮到比格犬可能無法耐受連續多次麻醉，故未行術前側位 X 線片檢查。為評估比格犬術前氣道通暢度，我們以軟化段氣管上口半徑（）與下口半徑（）的平均值（+）/2 估算為犬術前氣道橫截圓半徑，術前氣道橫截圓面積為 π（+）2/4，即術前氣道通暢度為（+）2/4R。最狹窄處橫截圓面積 πR與參考橫截圓面積比值 R/R為術后通暢度。每張 X 線片由 2 位研究者別獨立測量計算，兩者平均值為最終結果，由其中 1 位間隔 1 周重復測量。
圖2
氣管通暢度比較
a：犬氣道通暢度測量方法；b：MTM、STM 組術后氣道通暢度比較，兩組差異有統計學意義；c：MTM 組手術前后氣道通暢度比較，術后氣道通暢度明顯下降；d：STM 組手術前后氣道通暢度比較，術后氣道通暢度明顯下降
1.6.2 氣管鏡檢查
術中完成軟骨剝離后，將氣管插管稍向外退出，快速斷開氣管插管與呼吸機連接，將纖維支氣管鏡通過氣道插入氣管，仔細觀察剝除段氣管通暢情況：包括施加外力作用下氣管維持通暢情況；犬自主呼吸恢復情況下剝除段氣管隨呼吸運動塌陷和軟化情況。
1.6.3 組織病理檢查
MTM 組犬術后 2 周時收集病理標本，麻醉方法同前，犬仰臥位固定，取頸正中切口，鈍性分離頸部肌肉筋膜，暴露頸部軟化段氣管。迅速將軟化段氣管取出，并浸泡于 10% 福爾馬林固定，使用石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（HE）染色。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 20.0 及 GraphPad Prism 8.0.2 統計軟件對實驗數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組數據比較時若方差齊，使用 t 檢驗，方差不齊時用 t′檢驗；若兩組數據為配對數據時，采用配對 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。使用組內相關系數（ ICC）評估氣道通暢度的觀察者組內及不同觀察者組間一致性。
1.8 倫理審查
本實驗經唐都醫院倫理委員會批準，倫理批準號：TDLL-2016196-450。
2 結果
2.1 術后臨床癥狀、生存時間及呼吸評分結果
MTM 組（n=3）術后均出現喘鳴、咳嗽、吸氣受限等明顯氣道阻塞癥狀（表 2 ）。Westley 喉炎評分在術后 3 d 內升高，后逐漸下降，到 1 周時趨于穩定，但氣道阻塞癥狀仍存在（圖 3）。2 周后安樂處死 MTM 組犬并收集標本進行進一步后續檢查。STM 組（n=3）術后均發生嚴重的氣管狹窄，在拔管后 1 h 內死亡。
表2
犬術后癥狀及生存情況
圖3
MTM 組實驗動物術后 Westley 評分變化情況
2.2 犬術中氣管鏡及術后側位 X 線片結果
MTM 組犬術中見氣管軟骨殘端（圖 4a），氣管鏡顯示氣管軟骨剝除段塌陷（圖 4b），狹窄明顯，尤其是吸氣時，氣管壁軟化塌陷嚴重；術后 X 線片顯示氣管軟骨剝除段橫截面積明顯減小（圖 4c），通暢度降低。STM 組未見明顯氣管軟骨殘端（圖 4d），氣管鏡顯示氣管軟骨剝除段無論是否存在呼吸運動，均完全塌陷（圖 4e），側位 X 線片顯示氣管軟骨剝離段幾乎完全阻塞（圖 4f）。對 X 線片影像測量動物模型術后氣道通暢度的重復性進行評估，氣道通暢度觀察者組內重復測量信度 ICC=0.973（P<0.001），組間測量信度 ICC=0.988（P<0.001），該方法有著良好的可重復性。MTM 組犬術后平均通暢度 26.50%±4.95%，STM 組術后平均通暢度 6.80%±5.34%。兩組間術后氣管通暢度差異有統計學意義（圖 2b）。MTM、STM 兩組術前術后通暢度比較，兩組氣道術后氣道通暢度均低于術前通暢度，通暢度變化差異有統計學意義（圖 2c，圖 2d）。
圖4
犬術中情況和氣管鏡、X 線片結果
a：MTM 組術中情況；b：MTM 組術中氣管鏡結果；c：MTM 組術后側位 X 線片結果；d：STM 組術中情況；e：STM 組術中氣管鏡結果；f：STM 組術后側位 X 線片結果
2.3 病理檢查結果
MTM、STM 組氣管病理切片 HE 染色結果顯示：MTM 組氣道纖毛柱狀上皮完好，氣管軟骨組織部分剝除（圖 5a），STM 組犬氣管組織 HE 染色顯示氣管內壁黏膜層及黏膜下層完好，軟骨幾乎完全剝除，僅兩側壁少量軟骨組織剩余（圖 5b）。
圖5
氣管病理切片結果
a：MTM 組（保留部分軟骨），氣道纖毛柱狀上皮完好，氣管軟骨組織部分剝除；b：STM 組（氣管軟骨盡量完全剝除），氣管內壁黏膜層及黏膜下層完好，軟骨幾乎完全剝除，僅兩側壁少量軟骨組織剩余
3 討論
目前，國內尚無成功建立比格犬氣管軟化模型的報道。在本研究中，比格犬在接受氣管軟骨剝離術后，出現明顯的呼吸道阻塞癥狀，且氣管鏡、側位 X 線片均顯示犬術后軟骨剝離段出現氣道塌陷，氣管狹窄明顯。拔除氣管插管后，MTM 組動物存活，但存在氣道狹窄的癥狀，STM 組動物無法存活。MTM、STM 組動物的氣道通暢度均比術前有了明顯降低。上述結果說明建模成功，該模型能夠模擬臨床氣管軟化情況。
是否能夠模擬臨床不同嚴重程度的氣管軟化情況是動物建模的一個難點[12-14]。在本研究中，我們通過控制氣管軟骨剝離程度能夠建立 MTM、STM 兩組不同氣管軟化程度的動物模型。MTM 組術中能看到明顯氣管軟骨剩余，剩余氣管軟骨仍起到支撐作用，氣道未完全塌陷，犬有氣道狹窄癥狀但仍能生存。STM 組犬氣管軟骨幾乎完全被剝離，氣道完全塌陷，犬無法正常通氣而死亡。除存活情況之外，犬術后氣道通暢度結果亦證明兩組動物之間氣管軟化程度不同。MTM 組犬 Westley 喉炎評分術后第 3 d 內逐步上升，應為術后氣管周圍水腫組織及滲出液壓迫，導致狹窄程度進一步加重。1 周后滲出液及水腫逐步吸收，評分趨于平穩，但仍存在氣道阻塞現象。2010 年 Tsukada 等[14]利用羊為實驗模型，通過剝除 10 個連續氣管軟骨環的方法，建立氣管軟化模型，建模后即刻植入硅酮內支架以防止氣道的過度坍塌。Zopf 等[2]通過剝除 5 個連續氣管軟骨環構建豬氣管軟化模型，對照組模型動物術后 24 h 內死亡，實驗組模型動物接受 3D 打印外支架的植入均成功存活。上述研究均只是建立了單一的重度氣管軟化模型，并未對如何建立輕度氣管軟化模型進行探索。在本研究中，我們不僅成功建立重度氣管軟化模型，更進一步通過調整軟骨環剝離的程度，建立一種術后可長期存活、不需內支架支撐、并且氣管軟化狹窄癥狀穩定存在的輕度氣管軟化動物模型。這兩種嚴重程度不同的氣管軟化模型為該疾病診斷治療提供了良好的研究平臺。此外，同豬、羊等實驗動物相比，使用比格犬為實驗模型還存在動物體重輕、易于操作、抗病能力強等優點。
在本模型建立過程中，需要注意幾點：（1）對氣管軟骨進行剝離時，應將插管套囊置于軟骨剝離部分上端或者下端，防止其對操作產生干擾；（2）術中需多次斷開呼吸機，利用氣管鏡對氣道進行觀察，若采用吸入麻醉維持，此操作會影響麻醉效果，應采取靜脈維持麻醉；（3）術中應盡量避免破壞氣管內壁，防止呼吸道感染。若氣管內壁破損，需用 4-0 Prolene 線縫合破口。
本模型也存在一定的局限性。首先，本研究選取成年比格犬為模型動物，與嬰幼兒的氣管軟化情況存在差異。其次，臨床上存在先天性與獲得性氣管軟化[15]，該模型是通過軟骨環剝離實現氣管軟化，并非先天形成，因此該模型較適合于模擬獲得性氣管軟化患者。但是，在缺少大動物氣管軟化癥模型的情況下，我們建立的模型具有可重復性好、手術簡單、軟化癥狀模擬效果好等優點，可為氣管軟化癥治療研究提供一種標準的動物模型。
綜上，本研究通過剝離氣管軟骨成功建立比格犬氣管軟化模型。該模型能夠模擬不同程度的氣管軟化癥的臨床癥狀及病理生理表現，并且具有手術操作簡單、可重復性好等優點，可廣泛應用于氣管軟化癥的標準化診斷治療等研究中。
利益沖突：無。
作者貢獻：趙晉波、李小飛負責課題構思與設計；冀晉杰負責動物麻醉、文章修改；趙晉波、劉文豪、鄭開福、王磊、張豪負責動物手術、文章修改；劉文豪、鄭開福負責資料收集、數據統計及文章撰寫。
