肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的主要原因。由于缺乏有效的早期診斷方法，肺癌預后較差，但與晚期肺癌相比，早期肺癌生存率大大提高。因此，早期診斷肺癌至關重要。作為一種主要的表觀遺傳學修飾，DNA 甲基化在肺癌發生發展過程中發揮著重要作用。大量研究表明，抑癌基因甲基化檢測是一種理想的肺癌早期診斷方法。隨著檢測技術的不斷進步，可以實現多種基因的甲基化檢測。研究發現多基因甲基化聯合檢測在穿刺病變組織、穿刺淋巴結組織等微創操作獲取的組織樣本以及外周血、支氣管肺泡灌洗液、痰液等無創樣本中均具有較高的檢出率，并且較單一基因甲基化檢測靈敏度及特異度更高，是一種理想的肺癌早期診斷方法。
引用本文： 劉展, 張真榕, 劉德若. 抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(8): 810-814. doi: 10.7507/1007-4848.201811006 復制
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的主要原因[1]。在我國肺癌發病率及死亡率均居惡性腫瘤首位[2]。肺癌預后較差，5 年生存率僅為 16.1%[3]，而早期肺癌患者 5 年生存率可達 90%[4]。因此，肺癌早期診斷至關重要。
DNA 甲基化檢測是肺癌的一種主要早期診斷方法。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉移酶的作用下，以 S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的第 5 位碳原子上[5]，其在肺癌發生發展過程中發揮著重要作用，尤其是抑癌基因啟動子區域 CpG 島的異常甲基化可以導致抑癌基因的沉默，進而影響腫瘤的發生發展[6]。同時 DNA 較 RNA 及蛋白質性質穩定，且基于聚合酶鏈式反應（PCR）的 DNA 甲基化檢測技術可以大大提高檢測靈敏度，此外抑癌基因甲基化在穿刺病變組織、穿刺淋巴結組織等微創操作獲取的組織樣本及外周血、支氣管肺泡灌洗液、痰液等無創樣本中均有較高的檢出率，因此抑癌基因甲基化在肺癌早期診斷中具有廣闊的應用前景。
大量研究表明，SHOX2、RASSF1A、p16、CDH13 等抑癌基因甲基化與肺癌早期診斷密切相關[7-10]，但其靈敏度及特異度相對較低。而肺癌的發生發展是由多種基因共同參與的多步驟的復雜過程，多種抑癌基因在細胞信號轉導、周期調控、增殖分化、粘附、凋亡、DNA 修復等方面發揮著重要的作用。研究表明，抑癌基因甲基化發生于肺癌的不同時期[11]，因此單一基因甲基化檢測不足以診斷肺癌。并且隨著高通量檢測技術的不斷發展，可以實現多種基因的甲基化檢測。眾多研究表明，多基因甲基化聯合檢測在穿刺病變組織、淋巴結組織等微創操作獲取的組織樣本及外周血、支氣管肺泡灌洗液及痰液等無創樣本中均有較好的檢出率，并且與單一基因甲基化檢測相比，檢測肺癌的靈敏度及特異度更高。因此，本文就抑癌基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中的應用做一綜述。
1 組織中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
1.1 手術切除組織
大量研究表明，組織中抑癌基因甲基化與肺癌密切相關，并且多基因甲基化聯合檢測可以顯著區分組織良惡性。多項研究表明，手術切除組織中多基因甲基化聯合檢測肺癌的靈敏度為 65.38%～92%，特異度為 84.62%～100.0%[12-15]。
Nawaz 等[12]從 38 種抑癌基因中篩選出 HOXA9、TBX5、PITX2、CALCA、RASSF1A、和 DLEC1 等 6 種靈敏度及特異度較高的抑癌基因組成甲基化檢測模板。利用多重甲基化特異性 PCR（MMSP）技術對 70 例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織及相應正常肺組織中的 6 種基因進行甲基化檢測，發現單一基因甲基化檢測非小細胞肺癌的靈敏度為 37%～87%，特異度為 86%～99%，而至少 2 種抑癌基因發生甲基化可以顯著區分肺癌組織及正常肺組織，其檢測肺癌的靈敏度為 87%，特異度為 94%，顯著優于單一基因甲基化檢測。并且在早期肺癌中也具有良好的檢出率，靈敏度為 86%，特異度為 100%。Zhang 等[13]利用甲基化特異性 PCR（MSP）對 78 例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織及瘤旁正常組織中的 20 種基因進行甲基化分析，且定義 CPG 島甲基化表型（CIMP）為至少 4 種基因甲基化。發現 CIMP 可以顯著區分組織良惡性，腫瘤組織中 CIMP 陽性率為 65.38%，而瘤旁正常組織中 CIMP 陽性率僅為 1.28%。可見，手術切除組織中多基因甲基化聯合檢測可以顯著區分腫瘤組織及正常肺組織，這為多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中的應用提供了理論基礎。
1.2 穿刺病變組織
CT 引導下肺部結節穿刺活檢是目前胸部 CT 上發現可疑結節患者的主要早期診斷方法，其可以直接獲取組織，但受結節大小、位置、穿刺人員技術等原因的限制。Gao 等[16]利用定量甲基化特異性 PCR（QMSP）技術對 39 例肺癌患者的穿刺組織中的 APC 及 RASSF1A 基因進行甲基化分析，發現肺癌組織中 APC 基因甲基化檢出率為 59%，RASSF1A 基因甲基化檢出率為 66.7%，而兩種基因聯合檢測可以檢出 69.2% 的肺癌患者。雖然檢出率相對較低，但是基因甲基化聯合檢測可以用于穿刺組織的輔助病理診斷。目前穿刺組織中甲基化檢測研究較少，需要進一步研究來證實其在肺癌早期診斷中的價值。
1.3 癌前病變組織
肺癌癌前病變中多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中也具有重要意義。Licchesi 等[17]利用多重巢式甲基化特異性 PCR 對 16 例多發非典型腺瘤樣增生（AAH）患者的 AAH 病灶、鄰近正常肺組織和同時存在的肺腺癌組織中的 7 種基因（p16、TIMP3、DAPK、MGMT、RARβ、RASSF1A 和 hTERT）進行聯合甲基化分析。發現鄰近正常肺組織中基因甲基化平均數目為 0.67，低級別 AAH 中基因甲基化平均數目為1.30，高級別 AAH 中基因甲基化平均數目為 2.67，腺癌組織中基因甲基化平均數目為 3.72。基因甲基化的平均數目隨著疾病的發展而逐漸增加，這提示甲基化數目可以輔助組織學診斷。并且單一基因甲基化的絕對危險度（OR）值為 5.39～11.38，而至少 4 種基因發生甲基化的患者發生肺腺癌的風險是少于 4 種基因甲基化患者的 18.66 倍。因此，基因甲基化聯合檢測可以識別肺腺癌的高危人群，從而早期發現肺腺癌患者。
1.4 淋巴結組織
超聲內鏡引導下支氣管針吸活檢術（EBUS-TBNA）可以對可疑淋巴結進行穿刺活檢，是肺癌的一種主要診斷方法。對穿刺淋巴結組織中基因甲基化進行聯合檢測，可以輔助病理診斷，從而早期診斷肺癌。Millares 等[18]利用甲基化敏感性高分辨率熔解（MS-HRM）技術對通過 EBUS-TBNA 獲取的 90 個淋巴結進行 DAPK、p16、RASSF1、APC 和 CDH13 等 5 種基因的甲基化分析，發現 67% 的轉移淋巴結中可以檢出至少一種基因的甲基化。并且在 53 例非小細胞肺癌患者中，APC 基因甲基化檢出率為 30.2%，P16 基因甲基化檢出率為 17%，而 2 種基因甲基化聯合檢測可以檢出 39.6% 的非小細胞肺癌患者，優于單一基因甲基化檢測。但是其檢測靈敏度相對較低，且目前淋巴結組織中基因甲基化研究相對較少，其在肺癌早期診斷中的應用價值需要進一步研究驗證。
2 外周血中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞可以釋放 DNA 進入血液循環，因此可以在外周血中檢測到 DNA 的甲基化[19]。并且有研究表明，腫瘤組織及外周血樣本中基因甲基化的檢出水平具有良好的一致性，兩種樣本中 9 種抑癌基因甲基化水平的 Kappa 值為 0.758～0.906[13]。這提示外周血樣本中甲基化聯合檢測可以用于肺癌早期診斷。
Weiss 等[20-21]利用實時 PCR（RT-PCR）技術對三項獨立病例-對照研究中的 330 例患者血漿樣本進行 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化檢測，發現 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化組成的模板可以顯著區分肺癌患者及非惡性腫瘤患者，并在包含 172 例患者血漿樣本的驗證試驗中得到了證實。其曲線下面積（AUC）為 0.88。靈敏度為 90% 時，特異度為 73%，特異度為 90% 時，靈敏度為 67%，顯著優于由 CEA、CYFRA21-1、CA-125、CA-19-9 等傳統血漿蛋白標志物組成的模板（AUC 為 0.79）。Hulbert 等[22]的研究也得到相似的結論，他們對肺 CT 上可見結節的 150 例Ⅰ～ⅡA 期肺癌患者及 60 例非腫瘤患者血漿樣本中的 SOX17、TAC1、HOXA7、CDO1、HOXA9 和 ZFP42 等 6 種基因進行甲基化分析。篩選出靈敏度及特異度較高的 CDO1、TAC1 和 SOX17 等 3 種基因，其靈敏度分別為 65%、76% 和 73%，特異度分別為 74%、78% 和 84%。而 3 種基因聯合檢測檢出肺癌的靈敏度為 86%，特異度為 78%，優于單一基因甲基化檢測。
外周血樣本獲取方便，操作簡便，并且可以重復采集，這都提示外周血可以作為肺癌早期診斷的一種理想的檢測樣本。但是血液樣本中 DNA 含量相對較少，腫瘤負荷較小，并且缺乏器官特異性。隨著檢測技術的不斷進步，DNA 擴增技術不斷成熟，外周血樣本在肺癌早期診斷中具有廣闊的臨床應用前景。
3 支氣管肺泡灌洗液中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
目前纖維支氣管鏡檢查廣泛應用于臨床，支氣管肺泡灌洗液獲取簡便，并且允許局部采樣，相對靠近腫瘤細胞，定位相對準確，特異性較強，是肺癌生物標志物的主要替代來源。并且 Ma 等[14]的研究發現，PCDHGB6，HOXA9 和 RASSF1A 組成的甲基化聯合檢測模板在腫瘤組織中可以檢出 92% 的非小細胞肺癌患者，而在支氣管肺泡灌洗液中的靈敏度可以達到 80%。可見支氣管肺泡灌洗液與腫瘤組織具有較好的一致性，是一種理想的早期診斷樣本。
Ren 等[23]應用實時甲基化特異性 PCR（RT-PCR）技術對 305 例支氣管肺泡灌洗液樣本中的 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化進行檢測，發現肺癌組 SHOX2 和 RASSF1A 甲基化陽性率分別為 64.2% 和 50.4%，明顯高于對照組（7.7% 和 3.8%）。而將兩種基因化進行聯合分析發現，肺癌組陽性檢出率由 64.2% 和 50.4% 提高到 71.5%。這提示 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化的聯合檢測有很好的鑒別肺部良惡性疾病的潛力。Zhang 等[24]的研究也得到了相似的結論，在 322 例樣本中，SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化聯合檢測的靈敏度為 81.0%，特異度為 97.4%，顯著優于單一基因甲基化檢測。
纖維支氣管鏡較少應用于可疑周圍型肺癌患者，并且具有一定的侵入性，這限制了支氣管肺泡灌洗液的臨床應用。但是對于可疑中央型肺癌患者而言，支氣管肺泡灌洗液則為理想的檢測樣本。
4 痰液中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
痰液是支氣管肺泡灌洗液的首選替代樣本，其容易通過非侵入性方法獲取，簡單方便，易被患者接受。且有研究表明痰液中基因甲基化水平與腫瘤組織的一致率達 78%[25]，這提示痰液標本中基因甲基化檢測有望成為理想的肺癌早期診斷。
Hubers 等[26]對 275 名健康受試者痰液中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因甲基化進行檢測，并對受試者進行隨訪，發現 3 種基因甲基化聯合檢測可以在臨床診斷之前 2 年檢出部分肺癌患者。肺癌組 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因高甲基化陽性率分別為 17.2%、3.4%、6.9%，而 3 種基因組成的模板可以檢測出 28% 的肺癌病例，且特異度為 90%。雖然靈敏度較低，但提示痰液基因甲基化聯合檢測具有能夠在臨床診斷之前識別無癥狀肺癌高危個體的潛力，這對肺癌早期診斷至關重要。此外 Hubers 等[27]對 72 例肺癌患者及 86 例非腫瘤患者痰液樣本中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM14 三種基因進行甲基化檢測，發現三種基因甲基化檢測肺癌的靈敏度為 42.5%～60.3%，而聯合檢測可以檢出 82.2% 的肺癌病例，顯著優于單一基因甲基化檢測。在另一項研究中，Hubers 等[28]前瞻性收集 697 例痰液標本，隨機生成 2 個子集，并對其進行 RASSF1A、APC、CYGB 等 3 種基因甲基化檢測。在集合 1 中，三種基因靈敏度為 31%～40%，特異度為 87%～96%，而聯合分析可以將靈敏度提高至 63%，特異度為 78%。在集合 2 中也得到了相似的結論，三種基因聯合檢測可以檢出 90% 的肺癌患者，并且顯著優于痰液細胞學檢測（靈敏度為 22%）。
然而痰液中細胞含量具有多變性，可能含有口腔上皮細胞，因此需要對患者進行適當培訓，正確收集痰標本[29]。此外，對于非吸煙的患者來講，痰液的收集相對困難，而誘導排痰在臨床上較難實施。痰液樣本量相對較小，所含 DNA 含量少，需要反復收集，且有研究表明，延長痰液收集時間可以顯著提高痰液中甲基化聯合檢測的靈敏度[30]。因此就痰液收集過程中的相關難點需要進一步研究來提高痰標本在臨床中的應用。
5 結語與展望
表觀遺傳學研究近年來蓬勃發展，尤其在腫瘤研究領域進展迅速。作為一種主要的表觀遺傳學修飾，DNA 甲基化在肺癌早期診斷中具有廣闊的應用前景，并且多基因甲基化的聯合檢測較單一基因甲基化檢測有更大的優勢。但是，現有關于多基因甲基化聯合檢測的研究樣本量相對較小，各研究之間數據差異較大，且基因少有重疊，因此需要大數據、多基因的多中心研究，來驗證其在肺癌早期診斷中的價值，并篩選最優的基因組合。此外，無創樣本的固有不足仍然需要檢測技術的不斷進步予以彌補，使其更好地應用于臨床。非惡性腫瘤患者檢出基因異常甲基化的問題仍然需要長期隨訪來了解其癌變的風險。抑癌基因甲基化與飲食、吸煙、環境、年齡等因素的關系仍然需要大規模流行病學研究來明確其相關性。總之，多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中具有重要意義，具有廣闊的臨床應用前景。
利益沖突：無。
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的主要原因[1]。在我國肺癌發病率及死亡率均居惡性腫瘤首位[2]。肺癌預后較差，5 年生存率僅為 16.1%[3]，而早期肺癌患者 5 年生存率可達 90%[4]。因此，肺癌早期診斷至關重要。
DNA 甲基化檢測是肺癌的一種主要早期診斷方法。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉移酶的作用下，以 S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的第 5 位碳原子上[5]，其在肺癌發生發展過程中發揮著重要作用，尤其是抑癌基因啟動子區域 CpG 島的異常甲基化可以導致抑癌基因的沉默，進而影響腫瘤的發生發展[6]。同時 DNA 較 RNA 及蛋白質性質穩定，且基于聚合酶鏈式反應（PCR）的 DNA 甲基化檢測技術可以大大提高檢測靈敏度，此外抑癌基因甲基化在穿刺病變組織、穿刺淋巴結組織等微創操作獲取的組織樣本及外周血、支氣管肺泡灌洗液、痰液等無創樣本中均有較高的檢出率，因此抑癌基因甲基化在肺癌早期診斷中具有廣闊的應用前景。
大量研究表明，SHOX2、RASSF1A、p16、CDH13 等抑癌基因甲基化與肺癌早期診斷密切相關[7-10]，但其靈敏度及特異度相對較低。而肺癌的發生發展是由多種基因共同參與的多步驟的復雜過程，多種抑癌基因在細胞信號轉導、周期調控、增殖分化、粘附、凋亡、DNA 修復等方面發揮著重要的作用。研究表明，抑癌基因甲基化發生于肺癌的不同時期[11]，因此單一基因甲基化檢測不足以診斷肺癌。并且隨著高通量檢測技術的不斷發展，可以實現多種基因的甲基化檢測。眾多研究表明，多基因甲基化聯合檢測在穿刺病變組織、淋巴結組織等微創操作獲取的組織樣本及外周血、支氣管肺泡灌洗液及痰液等無創樣本中均有較好的檢出率，并且與單一基因甲基化檢測相比，檢測肺癌的靈敏度及特異度更高。因此，本文就抑癌基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中的應用做一綜述。
1 組織中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
1.1 手術切除組織
大量研究表明，組織中抑癌基因甲基化與肺癌密切相關，并且多基因甲基化聯合檢測可以顯著區分組織良惡性。多項研究表明，手術切除組織中多基因甲基化聯合檢測肺癌的靈敏度為 65.38%～92%，特異度為 84.62%～100.0%[12-15]。
Nawaz 等[12]從 38 種抑癌基因中篩選出 HOXA9、TBX5、PITX2、CALCA、RASSF1A、和 DLEC1 等 6 種靈敏度及特異度較高的抑癌基因組成甲基化檢測模板。利用多重甲基化特異性 PCR（MMSP）技術對 70 例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織及相應正常肺組織中的 6 種基因進行甲基化檢測，發現單一基因甲基化檢測非小細胞肺癌的靈敏度為 37%～87%，特異度為 86%～99%，而至少 2 種抑癌基因發生甲基化可以顯著區分肺癌組織及正常肺組織，其檢測肺癌的靈敏度為 87%，特異度為 94%，顯著優于單一基因甲基化檢測。并且在早期肺癌中也具有良好的檢出率，靈敏度為 86%，特異度為 100%。Zhang 等[13]利用甲基化特異性 PCR（MSP）對 78 例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織及瘤旁正常組織中的 20 種基因進行甲基化分析，且定義 CPG 島甲基化表型（CIMP）為至少 4 種基因甲基化。發現 CIMP 可以顯著區分組織良惡性，腫瘤組織中 CIMP 陽性率為 65.38%，而瘤旁正常組織中 CIMP 陽性率僅為 1.28%。可見，手術切除組織中多基因甲基化聯合檢測可以顯著區分腫瘤組織及正常肺組織，這為多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中的應用提供了理論基礎。
1.2 穿刺病變組織
CT 引導下肺部結節穿刺活檢是目前胸部 CT 上發現可疑結節患者的主要早期診斷方法，其可以直接獲取組織，但受結節大小、位置、穿刺人員技術等原因的限制。Gao 等[16]利用定量甲基化特異性 PCR（QMSP）技術對 39 例肺癌患者的穿刺組織中的 APC 及 RASSF1A 基因進行甲基化分析，發現肺癌組織中 APC 基因甲基化檢出率為 59%，RASSF1A 基因甲基化檢出率為 66.7%，而兩種基因聯合檢測可以檢出 69.2% 的肺癌患者。雖然檢出率相對較低，但是基因甲基化聯合檢測可以用于穿刺組織的輔助病理診斷。目前穿刺組織中甲基化檢測研究較少，需要進一步研究來證實其在肺癌早期診斷中的價值。
1.3 癌前病變組織
肺癌癌前病變中多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中也具有重要意義。Licchesi 等[17]利用多重巢式甲基化特異性 PCR 對 16 例多發非典型腺瘤樣增生（AAH）患者的 AAH 病灶、鄰近正常肺組織和同時存在的肺腺癌組織中的 7 種基因（p16、TIMP3、DAPK、MGMT、RARβ、RASSF1A 和 hTERT）進行聯合甲基化分析。發現鄰近正常肺組織中基因甲基化平均數目為 0.67，低級別 AAH 中基因甲基化平均數目為1.30，高級別 AAH 中基因甲基化平均數目為 2.67，腺癌組織中基因甲基化平均數目為 3.72。基因甲基化的平均數目隨著疾病的發展而逐漸增加，這提示甲基化數目可以輔助組織學診斷。并且單一基因甲基化的絕對危險度（OR）值為 5.39～11.38，而至少 4 種基因發生甲基化的患者發生肺腺癌的風險是少于 4 種基因甲基化患者的 18.66 倍。因此，基因甲基化聯合檢測可以識別肺腺癌的高危人群，從而早期發現肺腺癌患者。
1.4 淋巴結組織
超聲內鏡引導下支氣管針吸活檢術（EBUS-TBNA）可以對可疑淋巴結進行穿刺活檢，是肺癌的一種主要診斷方法。對穿刺淋巴結組織中基因甲基化進行聯合檢測，可以輔助病理診斷，從而早期診斷肺癌。Millares 等[18]利用甲基化敏感性高分辨率熔解（MS-HRM）技術對通過 EBUS-TBNA 獲取的 90 個淋巴結進行 DAPK、p16、RASSF1、APC 和 CDH13 等 5 種基因的甲基化分析，發現 67% 的轉移淋巴結中可以檢出至少一種基因的甲基化。并且在 53 例非小細胞肺癌患者中，APC 基因甲基化檢出率為 30.2%，P16 基因甲基化檢出率為 17%，而 2 種基因甲基化聯合檢測可以檢出 39.6% 的非小細胞肺癌患者，優于單一基因甲基化檢測。但是其檢測靈敏度相對較低，且目前淋巴結組織中基因甲基化研究相對較少，其在肺癌早期診斷中的應用價值需要進一步研究驗證。
2 外周血中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞可以釋放 DNA 進入血液循環，因此可以在外周血中檢測到 DNA 的甲基化[19]。并且有研究表明，腫瘤組織及外周血樣本中基因甲基化的檢出水平具有良好的一致性，兩種樣本中 9 種抑癌基因甲基化水平的 Kappa 值為 0.758～0.906[13]。這提示外周血樣本中甲基化聯合檢測可以用于肺癌早期診斷。
Weiss 等[20-21]利用實時 PCR（RT-PCR）技術對三項獨立病例-對照研究中的 330 例患者血漿樣本進行 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化檢測，發現 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化組成的模板可以顯著區分肺癌患者及非惡性腫瘤患者，并在包含 172 例患者血漿樣本的驗證試驗中得到了證實。其曲線下面積（AUC）為 0.88。靈敏度為 90% 時，特異度為 73%，特異度為 90% 時，靈敏度為 67%，顯著優于由 CEA、CYFRA21-1、CA-125、CA-19-9 等傳統血漿蛋白標志物組成的模板（AUC 為 0.79）。Hulbert 等[22]的研究也得到相似的結論，他們對肺 CT 上可見結節的 150 例Ⅰ～ⅡA 期肺癌患者及 60 例非腫瘤患者血漿樣本中的 SOX17、TAC1、HOXA7、CDO1、HOXA9 和 ZFP42 等 6 種基因進行甲基化分析。篩選出靈敏度及特異度較高的 CDO1、TAC1 和 SOX17 等 3 種基因，其靈敏度分別為 65%、76% 和 73%，特異度分別為 74%、78% 和 84%。而 3 種基因聯合檢測檢出肺癌的靈敏度為 86%，特異度為 78%，優于單一基因甲基化檢測。
外周血樣本獲取方便，操作簡便，并且可以重復采集，這都提示外周血可以作為肺癌早期診斷的一種理想的檢測樣本。但是血液樣本中 DNA 含量相對較少，腫瘤負荷較小，并且缺乏器官特異性。隨著檢測技術的不斷進步，DNA 擴增技術不斷成熟，外周血樣本在肺癌早期診斷中具有廣闊的臨床應用前景。
3 支氣管肺泡灌洗液中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
目前纖維支氣管鏡檢查廣泛應用于臨床，支氣管肺泡灌洗液獲取簡便，并且允許局部采樣，相對靠近腫瘤細胞，定位相對準確，特異性較強，是肺癌生物標志物的主要替代來源。并且 Ma 等[14]的研究發現，PCDHGB6，HOXA9 和 RASSF1A 組成的甲基化聯合檢測模板在腫瘤組織中可以檢出 92% 的非小細胞肺癌患者，而在支氣管肺泡灌洗液中的靈敏度可以達到 80%。可見支氣管肺泡灌洗液與腫瘤組織具有較好的一致性，是一種理想的早期診斷樣本。
Ren 等[23]應用實時甲基化特異性 PCR（RT-PCR）技術對 305 例支氣管肺泡灌洗液樣本中的 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化進行檢測，發現肺癌組 SHOX2 和 RASSF1A 甲基化陽性率分別為 64.2% 和 50.4%，明顯高于對照組（7.7% 和 3.8%）。而將兩種基因化進行聯合分析發現，肺癌組陽性檢出率由 64.2% 和 50.4% 提高到 71.5%。這提示 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化的聯合檢測有很好的鑒別肺部良惡性疾病的潛力。Zhang 等[24]的研究也得到了相似的結論，在 322 例樣本中，SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化聯合檢測的靈敏度為 81.0%，特異度為 97.4%，顯著優于單一基因甲基化檢測。
纖維支氣管鏡較少應用于可疑周圍型肺癌患者，并且具有一定的侵入性，這限制了支氣管肺泡灌洗液的臨床應用。但是對于可疑中央型肺癌患者而言，支氣管肺泡灌洗液則為理想的檢測樣本。
4 痰液中抑癌基因甲基化聯合檢測與肺癌早期診斷
痰液是支氣管肺泡灌洗液的首選替代樣本，其容易通過非侵入性方法獲取，簡單方便，易被患者接受。且有研究表明痰液中基因甲基化水平與腫瘤組織的一致率達 78%[25]，這提示痰液標本中基因甲基化檢測有望成為理想的肺癌早期診斷。
Hubers 等[26]對 275 名健康受試者痰液中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因甲基化進行檢測，并對受試者進行隨訪，發現 3 種基因甲基化聯合檢測可以在臨床診斷之前 2 年檢出部分肺癌患者。肺癌組 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因高甲基化陽性率分別為 17.2%、3.4%、6.9%，而 3 種基因組成的模板可以檢測出 28% 的肺癌病例，且特異度為 90%。雖然靈敏度較低，但提示痰液基因甲基化聯合檢測具有能夠在臨床診斷之前識別無癥狀肺癌高危個體的潛力，這對肺癌早期診斷至關重要。此外 Hubers 等[27]對 72 例肺癌患者及 86 例非腫瘤患者痰液樣本中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM14 三種基因進行甲基化檢測，發現三種基因甲基化檢測肺癌的靈敏度為 42.5%～60.3%，而聯合檢測可以檢出 82.2% 的肺癌病例，顯著優于單一基因甲基化檢測。在另一項研究中，Hubers 等[28]前瞻性收集 697 例痰液標本，隨機生成 2 個子集，并對其進行 RASSF1A、APC、CYGB 等 3 種基因甲基化檢測。在集合 1 中，三種基因靈敏度為 31%～40%，特異度為 87%～96%，而聯合分析可以將靈敏度提高至 63%，特異度為 78%。在集合 2 中也得到了相似的結論，三種基因聯合檢測可以檢出 90% 的肺癌患者，并且顯著優于痰液細胞學檢測（靈敏度為 22%）。
然而痰液中細胞含量具有多變性，可能含有口腔上皮細胞，因此需要對患者進行適當培訓，正確收集痰標本[29]。此外，對于非吸煙的患者來講，痰液的收集相對困難，而誘導排痰在臨床上較難實施。痰液樣本量相對較小，所含 DNA 含量少，需要反復收集，且有研究表明，延長痰液收集時間可以顯著提高痰液中甲基化聯合檢測的靈敏度[30]。因此就痰液收集過程中的相關難點需要進一步研究來提高痰標本在臨床中的應用。
5 結語與展望
表觀遺傳學研究近年來蓬勃發展，尤其在腫瘤研究領域進展迅速。作為一種主要的表觀遺傳學修飾，DNA 甲基化在肺癌早期診斷中具有廣闊的應用前景，并且多基因甲基化的聯合檢測較單一基因甲基化檢測有更大的優勢。但是，現有關于多基因甲基化聯合檢測的研究樣本量相對較小，各研究之間數據差異較大，且基因少有重疊，因此需要大數據、多基因的多中心研究，來驗證其在肺癌早期診斷中的價值，并篩選最優的基因組合。此外，無創樣本的固有不足仍然需要檢測技術的不斷進步予以彌補，使其更好地應用于臨床。非惡性腫瘤患者檢出基因異常甲基化的問題仍然需要長期隨訪來了解其癌變的風險。抑癌基因甲基化與飲食、吸煙、環境、年齡等因素的關系仍然需要大規模流行病學研究來明確其相關性。總之，多基因甲基化聯合檢測在肺癌早期診斷中具有重要意義，具有廣闊的臨床應用前景。
利益沖突：無。