引用本文： 任榮, 錢永軍, 黃云, 李濤, 肖錫俊. 機械瓣膜置換術后穩定期華法林抗凝治療質量評價及其基因學研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(7): 681-687. doi: 10.7507/1007-4848.201809047 復制
華法林抗凝治療效果評價的最佳方式是記錄與抗凝治療有關并發癥的確切數量[1]，然而機械瓣膜置換手術 6 個月后患者的抗凝治療有關并發癥發生率相對較低，此時的抗凝相關并發癥研究需要巨大的患者樣本量[2-3]。因此目前國外多采用治療范圍時間（time in therapeutic range ，TTR）及治療范圍時間分數（fraction of time in therapeutic range，FTTR）評價華法林抗凝治療的質量，但這些研究均存在著觀察評估時間較短的問題[4-6]。本研究采用了 TTR 和 FTTR 評價我們所施行的機械瓣膜置換手術患者術后較長期的抗凝治療質量。華法林抗凝治療的安全范圍窄，且其吸收及代謝受基因、食物、藥物以及肝功能等多因素影響[7-8]。患者達到抗凝治療要求所需的華法林劑量個體差異大[9-10]。復方丹參片是具有活血化淤的中成藥。有研究顯示它除本身能發揮抗凝作用外，還能增強華法林的抗凝效果，且作用平緩溫和[11]。既往研究將抗凝治療患者需服用明顯較低華法林劑量的現象定義為華法林敏感（warfarin sensitivity）[12-13]，而服用明顯較高華法林劑量的現象則定義為華法林抵抗（warfarin resistance）[14]。國內外研究顯示多個基因位點的多態性影響患者華法林起始及維持劑量，包括 CYP4F2、VKORC1 和 CYP2C9，但結果不一致[15-17]。因此目前尚不十分清楚導致華法林敏感或華法林抵抗的基因學基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
（1）在 2011 年 7 月至 2014 年 2 月共 32 個月的門診隨訪期間連續登記了我們所施行的機械瓣膜置換手術后的 1 831 例患者。記錄患者姓名、性別、年齡、身高、體重、手術日期、出院日期、手術方式、INR 監測值、INR 檢測時間，門診復查時每周的華法林服用劑量、門診復查后要求的每周華法林服用劑量、是否存在與抗凝治療有關的血栓形成、栓塞及出血情況。（2）本研究中患者國際標準化比值（international normalized ratio，INR）在可接受范圍低限時采用華法林聯合復方丹參片抗凝，并評估其療效。納入患者中篩選需加用復方丹參片患者共 46 例， INR 檢測次數為 92 次，前后 2 次檢測間隔時間為 2 個月。這些患者口服華法林劑量為 9.375～44.375 mg/周。（3）本研究患者按華法林服用劑量百分位數進行分組，將華法林服用劑量百分位數≤10% 的患者定義為華法林敏感（≤13.5 mg/周），即華法林低劑量組；將華法林服用劑量百分位數≥90% 的患者定義為華法林抵抗（≥31.25/周），即高劑量組；而將華法林服用劑量百分位數 45%～55% 的患者作為對照（17.5～23.75 mg/周），即中等劑量組。篩選其中 101 例患者進行基因檢測。
1.2 方法
1.2.1 納入及排除標準
納入機械瓣膜置換術后穩定期（≥6 個月）患者。排除標準為：（1）觀察期間內 2 次復查間隔時間≥6 個月的患者；（2）觀察期內連續 2 次未按要求服用華法林患者；（3）基因檢測中排除服用胺碘酮、巴比妥等影響華法林藥物代謝動力學的患者，并排除服用阿司匹林、維生素 K 等影響 INR 檢測值的患者。
1.2.2 華法林抗凝及復方丹參片治療策略[18 ]
本研究采用的目標 INR 為 1.6～2.2，可接受的 INR 值為目標 INR±0.1。當患者 INR 檢測值在目標 INR 范圍（1.6～2.2）時，要求患者 3 個月再次復查。以每周為單位進行華法林劑量調整。對于二尖瓣、三尖瓣及雙瓣膜置換手術及術前存在明顯危險因素（左房血栓、巨大左房、心房顫動等）的患者當其 INR 檢測值 ≥1.50 且<1.60 時要求每天加用復方丹參片（3 片，每日 1 次）。
1.2.3 患者華法林抗凝相關基因及方法
檢測篩選患者的基因位點為 CYP4F2：rs2108622C>T 位點、VKORC1：1639G>A 位點、VKORC1：1173C>T 位點、CYP2C9*2：rs1799853C>T 位點、CYP2C9*3：1061A>C 位點。采用 TIANGEN Blood DNA Kit 血液基因組 DNA 提取試劑盒提取樣本，以聚合酶鏈限制性片段-長度多態性分析法（PCR-RELP）測定患者基因型。
1.3 統計學分析
使用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（
±s）表示，采用 Fisher 確切概率法、卡方檢驗、成對樣本差分 t 檢驗及 Wilcoxon 帶符號秩檢驗進行樣本統計。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
1 831 例患者的臨床資料見表 1。
表1
1 831 例患者的臨床資料［例（%）/
/最小值～最大值］
2.1 手術類型
本研究納入患者所接受的手術為：二尖瓣置換術 1 151 例（64.0%），二尖瓣及主動脈置換術 463 例（28.6%），主動脈瓣置換術 168 例（9.6%），二尖瓣及三尖瓣置換術 32 例（1.0%），三尖瓣置換術 25 例（0.8%），二尖瓣、主動脈瓣及三尖瓣置換術 9 例（0.5%），主動脈瓣及三尖瓣置換術 3 例（0.05%）。
2.2 本研究觀察期納入患者的抗凝治療質量評價
本研究納入患者目標 INR 范圍內患者的 TTR 為 27.2%；而在可接受 INR 范圍內的 TTR 為 34.2%；本研究納入患者目標 FTTR 為 49.4%；在可接受 INR 范圍內 FTTR 為 63.4%。
2.3 抗凝有關并發癥與 ACCP 指南相關數據比較
本研究觀察期內患者發生 Ⅲ 級血栓形成及栓塞并發癥 4 例，其中腦梗塞 2 例，機械瓣瓣環血栓形成 1 例，眼底血栓 1 例；發生 Ⅲ 級出血并發癥 5 例，其中腦溢血 3 例，嚴重消化道出血 1 例及子宮出血 1 例；另有皮膚黏膜、牙齦出血及鼻衄等Ⅰ級出血并發癥 33 例 。
將本研究觀察期內納入患者的抗凝治療有關并發癥與 2012 ACCP 指南中的相關報道數據[19-20]進行比較；見表 2。
表2
本研究患者與 ACCP 報告的抗凝治療并發癥的比較
2.4 本研究納入患者 TTR、FTTR 與前階段研究納入患者的 TTR 及 FTTR的對比
本研究統計所得 TTR、FTTR 與前階段研究所得 TTR 及 FTTR 數值[18]進行比較，其中目標范圍內 TTR 為目標范圍內時間與總觀測時間之比，本研究中的 TTR 值為 27.2%，前階段研究中 TTR 值為 51.1%；而目標范圍內 FTTR 為目標范圍內 INR 檢測次數與總的檢測次數之比，本研究中的 FTTR 值為 49.3%，前階段研究中 FTTR 值為 49.4%；見表 3。
表3
本研究與前階段研究的 TTR 及 FTTR 對比（%）
2.5 復方丹參片對患者 INR 檢測值的影響
加用復方丹參片前后 2 個月患者 INR 檢測值中，首次 INR 檢測值為 1.55 ±0.03，2 個月后 INR 檢測值為 1.69±0.30，成對差分 t 檢驗 P 值為 0.002 及 Wilcoxon 帶符號秩檢驗中雙側 P 值均為 0.002，加用復方丹參片患者在治療前后 2 個月的 INR 檢測值均數之間的差異有統計學意義。加用復方丹參片的患者 INR 檢測值均數上升且未超過目標 INR 范圍上限值。亦未發生 Ⅰ～Ⅲ 級與抗凝有關的出血并發癥。
2.6 等位基因型位點分布及其 FTTR 均值
CYP2C9*2 基因中僅有兩例患者為（C/T）基因型，其余患者均為（C/C）基因型；VKORC1639 基因則患者全為（A/A）基因型。這兩種基因在低（38 例）、中（31 例）、高劑量組（32 例）患者中的分布均接近或達到 100.0%，各劑量組患者之間差異不明顯。基因檢測結果見表 4。華法林敏感組 FTTR 均值為 48%，對照組 FTTR 為 58%，華法林抵抗組 FTTR 為 49%，三組均數差異無統計學意義。
表4
各劑量組患者基因型分布［例（%）］
2.7 等位基因對華法林劑量影響結果
CYP4F2：rs2108622C>T 位點中 C 等位基因位點與 T 等位基因位點、VKORC1：1173C>T 位點中 C 等位基因位點與 T 等位基因位點、CYP2C9*3：1061A>C 位點中 A 等位基因位點與 C 等位基因位點構成比在華法林敏感、對照、華法林抵抗患者中具差異性，見表 5。其中 VKORC1：1173C>T 基因位點中 C/T 和 CYP2C9*3：1061A>C 基因位點中 A/C 的構成比在華法林敏感、對照、華法林抵抗患者的 OR 值及 95%CI 值（>1），差異均有統計學意義（P<0.05）；見圖 1。上述現象提示 VKORC1：1173C>T 位點及 CYP2C9*3：1061A>C 位點的等位基因位點構成比差異導致華法林敏感、對照、華法林抵抗患者之間每周服用華法林劑量的明顯差異。
表5
基因組卡方檢驗結果
圖1
VKORC1：1173C>T 基因位點等位基因分布
2.8 華法林服用劑量與模型預測劑量的比較
比較華法林敏感（低劑量組）、對照（中劑量組）及抵抗患者（高劑量組）的實際服用華法林劑量與 IWPC 預測服用華法林劑量；見表 2。只有華法林敏感患者實際服用劑量與 IWPC 預測劑量的差異無統計學意義（P>0.05），余差異均有統計學意義，見表 6。
表6
患者華法林服用劑量與 IWPC 模型預測華法林劑量（M±SD）對比
3 討論
既往研究顯示抗凝治療有關并發癥多出現在機械瓣膜置換手術后 6 個月以內，而機械瓣膜置換手術 6 個月后患者華法林抗凝治療的有關并發癥會明顯下降，但是與抗凝治療有關的并發癥始終持續存在，并極大地影響這些患者的術后生活質量[21-24]。本研究進行了較長時間的觀察（32 個月），納入 1 831 例機械瓣膜置換術后穩定期（≥6 個月）的患者做為研究對象。本研究患者的 TTR 及 FTTR 低于國外相關報道[23, 25-26]，但抗凝治療相關Ⅲ級血栓形成、栓塞及出血并發癥發生率與國外相關報道的結果之間差異無統計學意義。這表明我們納入的患者術后穩定期相對較低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。
國外有研究顯示 TTR 和 FTTR 結果并不一致，TTR 較 FTTR 偏低[26]。2014 年我們在國內首先報告采用 TTR 和 FTTR 評價機械瓣膜置換術后患者華法林抗凝質量的初步觀察，該研究顯示 TTR 與 FTTR 的差異并不大[18]。而本研究觀察期間內所納入的患者 TTR 與 FTTR 的差異較大，在目標 INR 范圍內和可接受 INR 范圍內患者的 TTR 值均明顯下降。比較這兩次研究，注意到當前研究中術后達到 6 個月新納入的患者達 389 例，而新納入患者的 INR 檢測次數多為一次。根據線性插值法原理[1]，單次 INR 檢測結果無法用于 TTR 的計算，會使 TTR 計算時的有效數據大量損失，從而會造成統計差異。而 FTTR 可用于一個時間段內的抗凝質量評價的隊列研究，也可以做特定時間點的橫斷面研究[26]，而通過橫斷面研究可以監測醫療單位的抗凝治療質量并作出相應的改進。與 TTR 相比，FTTR 計算簡便，患者 INR 值的信息量損失小，評價機械瓣膜置換術后患者華法林抗凝治療質量更為可靠。
本研究也發現加用復方丹參片治療 2 個月后患者的 INR 檢測值由 1.55±0.03 增至 1.69±0.30（P<0.05），未觀察到這些患者出現明顯的出血及其它不適。既往在動物實驗中已明確丹參可提高動物血漿 INR 值[27]，丹參本身具有抗血小板聚集作用[28]。在一項時間跨度為 34 年的系統回顧[29]，Chan 提出不應將丹參應用于華法林抗凝治療的患者，以免增加這些患者出血的并發癥。而我們在門診隨訪中當患者 INR 檢測值位于可接受 INR 范圍下限時（1.5≤INR<1.6），且為二尖瓣、三尖瓣及雙瓣膜置換術等高危因素時常規加用復方丹參片以增強華法林抗凝治療效果，并未觀察到明顯的出血并發癥。
本研究按華法林服用劑量百分位數分組定義華法林敏感及華法林抵抗，原因是達到抗凝治療要求的華法林劑量隨目標 INR 范圍及患者種族的不一而有所不同[30]，按照目標患者人群的百分位數定義華法林敏感及及抵抗更為合理。華法林敏感患者所服用劑量容易超出實際所需劑量因而易引起出血并發癥，反之華法林抵抗患者所服用劑量容易低于實際所需劑量則可導致血栓形成及栓塞。本組患者 2.5～61.2 mg/周的華法林范圍清楚地顯示了患者個體之間的巨大差異，且需華法林劑量最多的患者在術后經近 2 年的 INR 檢測及華法林劑量調整方達到要求的目標 INR 值。本研究中也發現華法林敏感及華法林抵抗患者的 FTTR 較對照患者明顯較低（48% vs. 49% vs. 58%），雖然差異無統計學意義，但據國外研究這樣的差異足可導致華法林抗凝并發癥發生率的明顯變化[4-5,31]。
本研究檢測了影響患者華法林口服劑量常見的 5 個基因位點，其中 VKORC1：1173C/T 是一個對華法林代謝有重要影響等位基因位點，在第 1173 堿基位置上發生了堿基 C 和 T 的互換，進而影響了華法林代謝[32-37]。本研究結果顯示 VKORC1：1173C/T 位點堿基由 C→T 變異時，患者所需華法林劑量會增加。而患者 VKORC：1639G>A 基因全部為 A/A 基因型，既往研究也提示 VKORC1 -1639A/G 與 1173 C/T 呈現高度連鎖不平衡[35]。因此在患者的華法林抗凝基因中檢測 VKORC1 -1639A/G 基因位點意義不大。
CYP2C9 是華法林主要的代謝酶，CYP2C9 基因突變會導致 CYP2C9 酶活性的改變[36]。而在 CYP2C9 基因眾多的多態性位點中，有兩個多態性位點與華法林代謝密切相關：CYP2C9*2 和 CYP2C9*3。本研究中 CYP2C9*3：1061A>C 基因堿基由 A→C 變異時，個體所需華法林劑量增高。中國人 CYP2C9*2 基因變異少見，本研究中 CYP2C9*2 突變基因型的患者很少，研究納入的 101 例患者中，只有 2 例為雜合子（C/T 型），其它均為野生型純合子（C/C 型）。
Sagrieya 等[37]研究認為 CYP4F2 等位基因頻率與華法林穩定劑量無相關性，也未發現 CYP4F2 等位基因頻率與 TTR、華法林敏感、華法林抵抗有相關性。結合本研究中各組患者 CYP4F2 基因變異性并不明顯，我們認為其對于臨床預測患者華法林服用劑量的作用有限。
綜上所述，本研究測定的各等位基因位點上，在華法林敏感患者中 VKORC1：1173C>T 位點的 C 等位基因低而 T 等位基因高，CYP2C9*3：1061A>C 位點的 A 等位基因頻率高而 C 等位基因低；而華法林抵抗患者等位基因分布相反，VKORC1：1173C>T 位點的 C 等位基因高而 T 等位基因低，CYP2C9*3：1061A>C 位點的 A 等位基因低而 C 等位基因高；中劑量組的等位基因位點的分布頻率則處于這兩者之間，而且 3 組差異無統計學意義。而其他等位基因位點變異不明顯。因此我們認為機械瓣膜置換術后穩定期患者抗凝相關基因檢測中 VKORC1：1173C>T 位點及 CYP2C9*3：1061A>C 位點應是重點，當患者存在上述基因位點的變異時需適當縮短 INR 檢測間隔時間及增加華法林調整的頻率，以減少患者可能的血栓形成、栓塞及出血并發癥。
國際華法林臨床藥理協會（IWPC）認為服用華法林前對患者進行基因檢測，用藥后總體住院率及出血或血栓并發癥導致的住院率均會減少[38-39]。與 IWPC 華法林穩定劑量預測模型預測的劑量進行比較，結果顯示：華法林敏感患者實際服用華法林劑量與 IWPC 模型預測劑量吻合，有明顯相關性；而華法林抵抗及正常對照組患者則無這種相關性，實際華法林服用劑量與 IWPC 模型預測劑量相差太遠，無明顯相關性。該觀察提示在我國應用 IWPC 模型預測華法林劑量對多數機械瓣膜置換術后穩定期患者并不可行。
總之，本研究表明：（1）機械瓣膜置換術后穩定期患者相對較低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。（2）FTTR 計算簡便，系統誤差小，因而 FTTR 做為抗凝治療質量的評價指標更為可靠。（3）在適當的患者加用復方丹參片是有益的。（4） 華法林敏感患者基因學基礎為 VKORC1 1173C>T 基因中 T 等位基因頻率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 A 等位基因頻率升高；華法林抵抗患者基因學基礎為 VKORC1 1173C>T 基因中 C 等位基因頻率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 C 等位基因頻率升高。（5）IWPC 劑量預測模型僅與華法林敏感患者的實際服用劑量吻合。
利益沖突：無。
華法林抗凝治療效果評價的最佳方式是記錄與抗凝治療有關并發癥的確切數量[1]，然而機械瓣膜置換手術 6 個月后患者的抗凝治療有關并發癥發生率相對較低，此時的抗凝相關并發癥研究需要巨大的患者樣本量[2-3]。因此目前國外多采用治療范圍時間（time in therapeutic range ，TTR）及治療范圍時間分數（fraction of time in therapeutic range，FTTR）評價華法林抗凝治療的質量，但這些研究均存在著觀察評估時間較短的問題[4-6]。本研究采用了 TTR 和 FTTR 評價我們所施行的機械瓣膜置換手術患者術后較長期的抗凝治療質量。華法林抗凝治療的安全范圍窄，且其吸收及代謝受基因、食物、藥物以及肝功能等多因素影響[7-8]。患者達到抗凝治療要求所需的華法林劑量個體差異大[9-10]。復方丹參片是具有活血化淤的中成藥。有研究顯示它除本身能發揮抗凝作用外，還能增強華法林的抗凝效果，且作用平緩溫和[11]。既往研究將抗凝治療患者需服用明顯較低華法林劑量的現象定義為華法林敏感（warfarin sensitivity）[12-13]，而服用明顯較高華法林劑量的現象則定義為華法林抵抗（warfarin resistance）[14]。國內外研究顯示多個基因位點的多態性影響患者華法林起始及維持劑量，包括 CYP4F2、VKORC1 和 CYP2C9，但結果不一致[15-17]。因此目前尚不十分清楚導致華法林敏感或華法林抵抗的基因學基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
（1）在 2011 年 7 月至 2014 年 2 月共 32 個月的門診隨訪期間連續登記了我們所施行的機械瓣膜置換手術后的 1 831 例患者。記錄患者姓名、性別、年齡、身高、體重、手術日期、出院日期、手術方式、INR 監測值、INR 檢測時間，門診復查時每周的華法林服用劑量、門診復查后要求的每周華法林服用劑量、是否存在與抗凝治療有關的血栓形成、栓塞及出血情況。（2）本研究中患者國際標準化比值（international normalized ratio，INR）在可接受范圍低限時采用華法林聯合復方丹參片抗凝，并評估其療效。納入患者中篩選需加用復方丹參片患者共 46 例， INR 檢測次數為 92 次，前后 2 次檢測間隔時間為 2 個月。這些患者口服華法林劑量為 9.375～44.375 mg/周。（3）本研究患者按華法林服用劑量百分位數進行分組，將華法林服用劑量百分位數≤10% 的患者定義為華法林敏感（≤13.5 mg/周），即華法林低劑量組；將華法林服用劑量百分位數≥90% 的患者定義為華法林抵抗（≥31.25/周），即高劑量組；而將華法林服用劑量百分位數 45%～55% 的患者作為對照（17.5～23.75 mg/周），即中等劑量組。篩選其中 101 例患者進行基因檢測。
1.2 方法
1.2.1 納入及排除標準
納入機械瓣膜置換術后穩定期（≥6 個月）患者。排除標準為：（1）觀察期間內 2 次復查間隔時間≥6 個月的患者；（2）觀察期內連續 2 次未按要求服用華法林患者；（3）基因檢測中排除服用胺碘酮、巴比妥等影響華法林藥物代謝動力學的患者，并排除服用阿司匹林、維生素 K 等影響 INR 檢測值的患者。
1.2.2 華法林抗凝及復方丹參片治療策略[18 ]
本研究采用的目標 INR 為 1.6～2.2，可接受的 INR 值為目標 INR±0.1。當患者 INR 檢測值在目標 INR 范圍（1.6～2.2）時，要求患者 3 個月再次復查。以每周為單位進行華法林劑量調整。對于二尖瓣、三尖瓣及雙瓣膜置換手術及術前存在明顯危險因素（左房血栓、巨大左房、心房顫動等）的患者當其 INR 檢測值 ≥1.50 且<1.60 時要求每天加用復方丹參片（3 片，每日 1 次）。
1.2.3 患者華法林抗凝相關基因及方法
檢測篩選患者的基因位點為 CYP4F2：rs2108622C>T 位點、VKORC1：1639G>A 位點、VKORC1：1173C>T 位點、CYP2C9*2：rs1799853C>T 位點、CYP2C9*3：1061A>C 位點。采用 TIANGEN Blood DNA Kit 血液基因組 DNA 提取試劑盒提取樣本，以聚合酶鏈限制性片段-長度多態性分析法（PCR-RELP）測定患者基因型。
1.3 統計學分析
使用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用 Fisher 確切概率法、卡方檢驗、成對樣本差分 t 檢驗及 Wilcoxon 帶符號秩檢驗進行樣本統計。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
1 831 例患者的臨床資料見表 1。
表1
1 831 例患者的臨床資料［例（%）//最小值～最大值］
2.1 手術類型
本研究納入患者所接受的手術為：二尖瓣置換術 1 151 例（64.0%），二尖瓣及主動脈置換術 463 例（28.6%），主動脈瓣置換術 168 例（9.6%），二尖瓣及三尖瓣置換術 32 例（1.0%），三尖瓣置換術 25 例（0.8%），二尖瓣、主動脈瓣及三尖瓣置換術 9 例（0.5%），主動脈瓣及三尖瓣置換術 3 例（0.05%）。
2.2 本研究觀察期納入患者的抗凝治療質量評價
本研究納入患者目標 INR 范圍內患者的 TTR 為 27.2%；而在可接受 INR 范圍內的 TTR 為 34.2%；本研究納入患者目標 FTTR 為 49.4%；在可接受 INR 范圍內 FTTR 為 63.4%。
2.3 抗凝有關并發癥與 ACCP 指南相關數據比較
本研究觀察期內患者發生 Ⅲ 級血栓形成及栓塞并發癥 4 例，其中腦梗塞 2 例，機械瓣瓣環血栓形成 1 例，眼底血栓 1 例；發生 Ⅲ 級出血并發癥 5 例，其中腦溢血 3 例，嚴重消化道出血 1 例及子宮出血 1 例；另有皮膚黏膜、牙齦出血及鼻衄等Ⅰ級出血并發癥 33 例 。
將本研究觀察期內納入患者的抗凝治療有關并發癥與 2012 ACCP 指南中的相關報道數據[19-20]進行比較；見表 2。
表2
本研究患者與 ACCP 報告的抗凝治療并發癥的比較
2.4 本研究納入患者 TTR、FTTR 與前階段研究納入患者的 TTR 及 FTTR的對比
本研究統計所得 TTR、FTTR 與前階段研究所得 TTR 及 FTTR 數值[18]進行比較，其中目標范圍內 TTR 為目標范圍內時間與總觀測時間之比，本研究中的 TTR 值為 27.2%，前階段研究中 TTR 值為 51.1%；而目標范圍內 FTTR 為目標范圍內 INR 檢測次數與總的檢測次數之比，本研究中的 FTTR 值為 49.3%，前階段研究中 FTTR 值為 49.4%；見表 3。
表3
本研究與前階段研究的 TTR 及 FTTR 對比（%）
2.5 復方丹參片對患者 INR 檢測值的影響
加用復方丹參片前后 2 個月患者 INR 檢測值中，首次 INR 檢測值為 1.55 ±0.03，2 個月后 INR 檢測值為 1.69±0.30，成對差分 t 檢驗 P 值為 0.002 及 Wilcoxon 帶符號秩檢驗中雙側 P 值均為 0.002，加用復方丹參片患者在治療前后 2 個月的 INR 檢測值均數之間的差異有統計學意義。加用復方丹參片的患者 INR 檢測值均數上升且未超過目標 INR 范圍上限值。亦未發生 Ⅰ～Ⅲ 級與抗凝有關的出血并發癥。
2.6 等位基因型位點分布及其 FTTR 均值
CYP2C9*2 基因中僅有兩例患者為（C/T）基因型，其余患者均為（C/C）基因型；VKORC1639 基因則患者全為（A/A）基因型。這兩種基因在低（38 例）、中（31 例）、高劑量組（32 例）患者中的分布均接近或達到 100.0%，各劑量組患者之間差異不明顯。基因檢測結果見表 4。華法林敏感組 FTTR 均值為 48%，對照組 FTTR 為 58%，華法林抵抗組 FTTR 為 49%，三組均數差異無統計學意義。
表4
各劑量組患者基因型分布［例（%）］
2.7 等位基因對華法林劑量影響結果
CYP4F2：rs2108622C>T 位點中 C 等位基因位點與 T 等位基因位點、VKORC1：1173C>T 位點中 C 等位基因位點與 T 等位基因位點、CYP2C9*3：1061A>C 位點中 A 等位基因位點與 C 等位基因位點構成比在華法林敏感、對照、華法林抵抗患者中具差異性，見表 5。其中 VKORC1：1173C>T 基因位點中 C/T 和 CYP2C9*3：1061A>C 基因位點中 A/C 的構成比在華法林敏感、對照、華法林抵抗患者的 OR 值及 95%CI 值（>1），差異均有統計學意義（P<0.05）；見圖 1。上述現象提示 VKORC1：1173C>T 位點及 CYP2C9*3：1061A>C 位點的等位基因位點構成比差異導致華法林敏感、對照、華法林抵抗患者之間每周服用華法林劑量的明顯差異。
表5
基因組卡方檢驗結果
圖1
VKORC1：1173C>T 基因位點等位基因分布
2.8 華法林服用劑量與模型預測劑量的比較
比較華法林敏感（低劑量組）、對照（中劑量組）及抵抗患者（高劑量組）的實際服用華法林劑量與 IWPC 預測服用華法林劑量；見表 2。只有華法林敏感患者實際服用劑量與 IWPC 預測劑量的差異無統計學意義（P>0.05），余差異均有統計學意義，見表 6。
表6
患者華法林服用劑量與 IWPC 模型預測華法林劑量（M±SD）對比
3 討論
既往研究顯示抗凝治療有關并發癥多出現在機械瓣膜置換手術后 6 個月以內，而機械瓣膜置換手術 6 個月后患者華法林抗凝治療的有關并發癥會明顯下降，但是與抗凝治療有關的并發癥始終持續存在，并極大地影響這些患者的術后生活質量[21-24]。本研究進行了較長時間的觀察（32 個月），納入 1 831 例機械瓣膜置換術后穩定期（≥6 個月）的患者做為研究對象。本研究患者的 TTR 及 FTTR 低于國外相關報道[23, 25-26]，但抗凝治療相關Ⅲ級血栓形成、栓塞及出血并發癥發生率與國外相關報道的結果之間差異無統計學意義。這表明我們納入的患者術后穩定期相對較低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。
國外有研究顯示 TTR 和 FTTR 結果并不一致，TTR 較 FTTR 偏低[26]。2014 年我們在國內首先報告采用 TTR 和 FTTR 評價機械瓣膜置換術后患者華法林抗凝質量的初步觀察，該研究顯示 TTR 與 FTTR 的差異并不大[18]。而本研究觀察期間內所納入的患者 TTR 與 FTTR 的差異較大，在目標 INR 范圍內和可接受 INR 范圍內患者的 TTR 值均明顯下降。比較這兩次研究，注意到當前研究中術后達到 6 個月新納入的患者達 389 例，而新納入患者的 INR 檢測次數多為一次。根據線性插值法原理[1]，單次 INR 檢測結果無法用于 TTR 的計算，會使 TTR 計算時的有效數據大量損失，從而會造成統計差異。而 FTTR 可用于一個時間段內的抗凝質量評價的隊列研究，也可以做特定時間點的橫斷面研究[26]，而通過橫斷面研究可以監測醫療單位的抗凝治療質量并作出相應的改進。與 TTR 相比，FTTR 計算簡便，患者 INR 值的信息量損失小，評價機械瓣膜置換術后患者華法林抗凝治療質量更為可靠。
本研究也發現加用復方丹參片治療 2 個月后患者的 INR 檢測值由 1.55±0.03 增至 1.69±0.30（P<0.05），未觀察到這些患者出現明顯的出血及其它不適。既往在動物實驗中已明確丹參可提高動物血漿 INR 值[27]，丹參本身具有抗血小板聚集作用[28]。在一項時間跨度為 34 年的系統回顧[29]，Chan 提出不應將丹參應用于華法林抗凝治療的患者，以免增加這些患者出血的并發癥。而我們在門診隨訪中當患者 INR 檢測值位于可接受 INR 范圍下限時（1.5≤INR<1.6），且為二尖瓣、三尖瓣及雙瓣膜置換術等高危因素時常規加用復方丹參片以增強華法林抗凝治療效果，并未觀察到明顯的出血并發癥。
本研究按華法林服用劑量百分位數分組定義華法林敏感及華法林抵抗，原因是達到抗凝治療要求的華法林劑量隨目標 INR 范圍及患者種族的不一而有所不同[30]，按照目標患者人群的百分位數定義華法林敏感及及抵抗更為合理。華法林敏感患者所服用劑量容易超出實際所需劑量因而易引起出血并發癥，反之華法林抵抗患者所服用劑量容易低于實際所需劑量則可導致血栓形成及栓塞。本組患者 2.5～61.2 mg/周的華法林范圍清楚地顯示了患者個體之間的巨大差異，且需華法林劑量最多的患者在術后經近 2 年的 INR 檢測及華法林劑量調整方達到要求的目標 INR 值。本研究中也發現華法林敏感及華法林抵抗患者的 FTTR 較對照患者明顯較低（48% vs. 49% vs. 58%），雖然差異無統計學意義，但據國外研究這樣的差異足可導致華法林抗凝并發癥發生率的明顯變化[4-5,31]。
本研究檢測了影響患者華法林口服劑量常見的 5 個基因位點，其中 VKORC1：1173C/T 是一個對華法林代謝有重要影響等位基因位點，在第 1173 堿基位置上發生了堿基 C 和 T 的互換，進而影響了華法林代謝[32-37]。本研究結果顯示 VKORC1：1173C/T 位點堿基由 C→T 變異時，患者所需華法林劑量會增加。而患者 VKORC：1639G>A 基因全部為 A/A 基因型，既往研究也提示 VKORC1 -1639A/G 與 1173 C/T 呈現高度連鎖不平衡[35]。因此在患者的華法林抗凝基因中檢測 VKORC1 -1639A/G 基因位點意義不大。
CYP2C9 是華法林主要的代謝酶，CYP2C9 基因突變會導致 CYP2C9 酶活性的改變[36]。而在 CYP2C9 基因眾多的多態性位點中，有兩個多態性位點與華法林代謝密切相關：CYP2C9*2 和 CYP2C9*3。本研究中 CYP2C9*3：1061A>C 基因堿基由 A→C 變異時，個體所需華法林劑量增高。中國人 CYP2C9*2 基因變異少見，本研究中 CYP2C9*2 突變基因型的患者很少，研究納入的 101 例患者中，只有 2 例為雜合子（C/T 型），其它均為野生型純合子（C/C 型）。
Sagrieya 等[37]研究認為 CYP4F2 等位基因頻率與華法林穩定劑量無相關性，也未發現 CYP4F2 等位基因頻率與 TTR、華法林敏感、華法林抵抗有相關性。結合本研究中各組患者 CYP4F2 基因變異性并不明顯，我們認為其對于臨床預測患者華法林服用劑量的作用有限。
綜上所述，本研究測定的各等位基因位點上，在華法林敏感患者中 VKORC1：1173C>T 位點的 C 等位基因低而 T 等位基因高，CYP2C9*3：1061A>C 位點的 A 等位基因頻率高而 C 等位基因低；而華法林抵抗患者等位基因分布相反，VKORC1：1173C>T 位點的 C 等位基因高而 T 等位基因低，CYP2C9*3：1061A>C 位點的 A 等位基因低而 C 等位基因高；中劑量組的等位基因位點的分布頻率則處于這兩者之間，而且 3 組差異無統計學意義。而其他等位基因位點變異不明顯。因此我們認為機械瓣膜置換術后穩定期患者抗凝相關基因檢測中 VKORC1：1173C>T 位點及 CYP2C9*3：1061A>C 位點應是重點，當患者存在上述基因位點的變異時需適當縮短 INR 檢測間隔時間及增加華法林調整的頻率，以減少患者可能的血栓形成、栓塞及出血并發癥。
國際華法林臨床藥理協會（IWPC）認為服用華法林前對患者進行基因檢測，用藥后總體住院率及出血或血栓并發癥導致的住院率均會減少[38-39]。與 IWPC 華法林穩定劑量預測模型預測的劑量進行比較，結果顯示：華法林敏感患者實際服用華法林劑量與 IWPC 模型預測劑量吻合，有明顯相關性；而華法林抵抗及正常對照組患者則無這種相關性，實際華法林服用劑量與 IWPC 模型預測劑量相差太遠，無明顯相關性。該觀察提示在我國應用 IWPC 模型預測華法林劑量對多數機械瓣膜置換術后穩定期患者并不可行。
總之，本研究表明：（1）機械瓣膜置換術后穩定期患者相對較低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。（2）FTTR 計算簡便，系統誤差小，因而 FTTR 做為抗凝治療質量的評價指標更為可靠。（3）在適當的患者加用復方丹參片是有益的。（4） 華法林敏感患者基因學基礎為 VKORC1 1173C>T 基因中 T 等位基因頻率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 A 等位基因頻率升高；華法林抵抗患者基因學基礎為 VKORC1 1173C>T 基因中 C 等位基因頻率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 C 等位基因頻率升高。（5）IWPC 劑量預測模型僅與華法林敏感患者的實際服用劑量吻合。
利益沖突：無。
