引用本文： 田琨, 穆軍升, 伯平. 低氧三維培養微環境通過 HIF-1α 信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖機制的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(4): 385-389. doi: 10.7507/1007-4848.201809010 復制
心肌梗死后，心肌細胞無法再生，心肌細胞的數量絕對減少，患者的心臟功能將會不可逆性受損，心力衰竭成為其近遠期無法避免的結局。長期以來，臨床上對此類患者的治療手段極其有限。令人欣慰的是，隨著對干細胞及其臨床應用研究的不斷深入似乎讓人們看到了曙光。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有自我復制及在特定微環境下向多種類型細胞分化的能力，可在體外培養、擴增和維持在未分化狀態[1]。干細胞的這些特性是人們試圖通過干細胞移植來改善病變心臟功能的基礎。早在十幾年前，就有學者[2-3]試圖通過向心臟的梗死區移植干細胞的方法來修復受損的心肌，以期改善患者的心臟功能。
以往的眾多研究證實了該方法的有效性，但是依然存在很多問題。梗死區干細胞注射的傳統移植方式，雖然操作相對簡單，成本較低，但是移植后往往細胞流失嚴重且增殖緩慢，大大地影響了后期治療效果。我們的前期研究中將聚-3 羥基丁酸酯-co-4 羥基丁酸酯［poly 3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，P（3HB-co-4HB）］作為三維細胞載體，為細胞提供三維的黏附、生長的微環境，發現其能促進細胞的黏附和增殖分化[4-7]。心肌梗死發生后，梗死區域細胞將處于低氧微環境中。本實驗研究低氧三維培養條件對骨髓間充質干細胞黏附、存活和增殖產生的影響及影響機制。
1 材料及方法
1.1 主要材料
3 周齡昆明鼠來自安貞醫院動物房。該實驗經首都醫科大學附屬北京安貞醫院醫學倫理委員會審批（倫理審批編號：2018060X）。實驗材料包括胎牛血清（Gibco，美國），青鏈霉素雙抗（上海翊圣，中國），胰酶-EDTA（上海翊圣，中國），低糖 DMEM 培養基（Hyclone，美國），PBS 緩沖液（Gibco，美國），P（3HB-co-4HB）材料（清華大學化工系高分子研究所實驗室提供），HIF-1α 抗體（Immunoway，美國），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（天德悅，中國），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP（天德悅，中國），β-actin 鼠單抗（Immunoway，美國），離心管（Corning，美國），細胞培養瓶（Corning，美國），缺氧袋（三菱，日本），CCK-8 試劑（上海翊圣，中國），Trizol 試劑（天根生化，中國），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，中國），SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus（TaKaRa，日本），DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本），引物合成（Invitrogen，美國）。
1.2 主要儀器
主要使用的儀器包括高速控溫離心機（Thermo Fisher，美國），二氧化碳細胞培養箱（Thermo Fisher，美國），離心機（Thermo Fisher，美國），倒置相差顯微鏡（Leica，德國），缺氧箱（三菱，日本），恒溫水浴鍋，全光譜酶標儀（Thermo Fisher，美國），低溫冰箱（Thermo，美國），Mini P-4 電泳槽（Cavoy，中國），濕轉電泳槽（Cavoy，中國），電泳儀（Bio-Rad，美國），渦旋振蕩儀（其林貝爾，中國），凝膠成像系統（上海天能科技，中國），熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 小鼠骨髓間充質干細胞的提取
3 周齡昆明鼠，斷頸處死后，酒精浸泡 15 min，然后用無菌解剖剪和解剖鑷取出小鼠股骨，LG-DMEM 培養基沖洗骨髓腔，并用無菌尼龍網過濾，1 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清液后用完全 LG-DMEM 培養基重懸細胞，然后接種于 25T 培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中，72 h 后更換培養基，以后每 2 d 換液，以除去非貼壁的造血系細胞和其他細胞，直到細胞形態趨于一致后進行鑒定。
1.3.2 CCK-8 法測定低氧對干細胞增殖的影響
在培養的第 24 h，各組分別隨機選取 12 個孔，吸去培養基，每孔加入含 10% CCK-8 試劑的 DMEM 完全培養基，在培養箱中孵育 2 h，然后用酶標儀測定 450 nm 處的吸光度值。
1.3.3 實時定量 PCR 檢測 HIF-1α 基因表達情況
培養 12 h 后，用 Trizol 試劑提取樣品總 RNA（實驗操作按產品說明書進行）。紫外吸收測定法檢測濃度和純度，RNA 溶液的 A260/A280 的比值范圍應在 1.8～2.1 之間。變性瓊脂糖凝膠電泳并在紫外透射光下觀察并拍照。采用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 進行 cDNA 反轉錄（實驗操作按產品說明書進行），內參選用 GADPH，將 cDNA 樣品加入實時定量 PCR 反應體系中進行反應，擴增程序如下：95℃，30 s；40 個 PCR 循環［95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光）］。為了建立 PCR 產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s 進行產物分析，并收集熒光信號；并從 60℃ 緩慢加熱到 99℃（儀器自動進行-Ramp Rate 為 0.05℃/s）。檢測結果按照 2?△△ct 方法進行相對定量計算。引物序列如下：HIF-1α forward 5’-AAGGACAAGTCACCACAGGACA-3’reverse 5’-AGGGAGAAAATCAAGTCGTGCT-3’GAPDH forward 5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAG-3’GAPDH reverse 5’ACATACTCAGCACCGGCCTC-3’。
1.4 統計學分析
實驗數據采用 SPSS20.0 軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（
）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 骨髓間充質干細胞光鏡照片
P5 代骨髓間充質干細胞散在分布，呈三角形、星形、梭形或多角形，不規則形，絕大部分貼壁細胞，生長較快；見圖 1。
圖1
骨髓間充質干細胞（×100）
2.2 CCK-8 法測定干細胞的增殖情況
在開始培養時，兩組的 OD 值是相等的，均為為 0.23。經過 24 h 的培養，低氧組的 OD 值已經明顯大于常氧組（0.455±0.027 vs. 0.352±0.090，n=12，P=0.01）；見圖 2。
圖2
兩組的 OD 值變化
2.3 實時定量 PCR 檢測 HIF-1α 基因表達
檢測結果使用 2-△△ct方法進行相對定量計算，并且進行統計學檢驗，低氧培養 12 h 后，低氧組的 HIF-1α mRNA 表達水平顯著高于常氧組（P<0.05）；見圖 3。
圖3
低氧培養 12 h 后，兩組 HIF-1α mRNA 表達水平
2.4 Western blotting 檢測 HIF-1α 的表達
將膠片進行灰度分析并進行統計學分析得出結果：同常氧組比較，低氧組 HIF-1α 蛋白相對表達水平顯著增高（0.47±0.05 vs. 0.63±0.06，n=3，P<0.05）；見圖 4。
圖4
兩組 HIF-1α 表達
3 討論
伴隨著我國經濟、社會的高速發展，全國疾病譜也悄然發生了翻天覆地的變化。幾十年間，心血管系統疾病早已替代感染性疾病，成為威脅我國人民健康的頭號殺手。其中缺血性心臟病，由于其發病快，病情重，預后差，死亡率極高，嚴重威脅人們的生命健康，心肌細胞無法再生的特點使得心肌梗死患者心臟功能的破壞具有不可逆性。干細胞移植技術的發展似乎帶給人們新的希望。Strauer 等[8]在患者發生心肌梗死 6 d 后，將患者的自體干細胞輸注到與梗死相關的動脈（“罪犯”血管）中。通過單光子發射計算機斷層成像術（SPECT），在休息和運動時測量左心室功能，梗死面積，心室幾何形狀和心肌灌注，同時進行多靶點分析，多巴酚丁胺負荷超聲心動圖，右心導管檢查和放射性核素心室檢查。結果顯示干細胞移植 10 周后，左心室周圍的透壁梗死面積從 24.6%降至 15.7%，射血分數、心臟指數和每搏輸出量增加了 20%～30%。Stamm 在冠狀動脈旁路移植術（CABG）期間將其自體骨髓干細胞注射到梗死邊界區。12 例接受注射的患者都沒有發生心律失常或成瘤的嚴重并發癥，隨后的閃爍照相顯示注射干細胞的梗死區比沒有注射干細胞的梗死區的灌注情況得到了顯著改善[8-11]。這些結果證明，干細胞移植治療心臟疾病是可行的，可使得心肌梗死后的瘢痕面積縮小，改善心室功能。
雖然干細胞移植術治療心肌梗死取得了一些成就，但是由于以往的研究多以直接梗死區注射的方式進行，遠期來看，細胞往往流失嚴重，治療效果不盡人意。所以就需要用載體材料來為干細胞提供物理支撐使細胞可以黏附其上，以期達到降低流失率的效果。補片材料是能夠模仿細胞外基質的特異性三維排列結構，為種子細胞提供生存和增殖的環境，補片材料要有良好的生物相容性、可降解性以及生物安全性，從而減少細胞移植過程中細胞的流失，因此支架材料的選擇是心肌補片的重要環節之一。前期有運用聚氨酯（polyurethane，PU）、聚碳酸亞丙酯（poly propylene carbonate）等材料的報道，但由于毒性、可塑性、難以降解等種種問題而不能進一步應用于研究，且目前的載體材料大多無法給細胞提供近似體內的三維生長微環境，往往移植細胞流失嚴重，因此一種既能為細胞提供生長的三維空間又能有效防止細胞流失的載體材料對于移植成功來說是十分重要的。近年來 P（3HB-co-4HB）引起了人們的注意，其全稱為聚-3 羥基丁酸酯-co-4 羥基丁酸酯，是一種新型生物相容材料，具有良好的可塑性及延展性，在體內外條件下降解終產物為無毒的二氧化碳和水，利用現在工業技術可加工成三維支撐材料，為細胞提供三維物理性支撐，且具有良好的生物相容性，在醫學領域具有巨大潛力[12-14]。我們的前期實驗工作表明：P（3HB-co-4HB）具有很好的生物相容性、韌性和加工性；在作為種植干細胞的載體，制作心肌補片的相關實驗研究中，干細胞種植于補片能促進干細胞的黏附存留和增殖分化，形成心肌補片，改善梗死心肌。
心肌梗死發生后，梗死區域細胞將處于低氧微環境中。有研究顯示低氧環境下心肌細分化相關基因和蛋白質的表達顯著增加。Correia 等[15]研究了不同溶解氧對鼠 iPSC 向心肌分化的影響。發現與常氧（20% O2 張力）相比，缺氧培養（4% O2 張力）導致心肌細胞的分化數量提高約 1 000 倍。表現出典型的心肌肌節結構，鈣瞬變，電生理學特征和藥物反應性。缺氧在發育過程中心血管系統的增殖，分化和維持中起著重要的作用。缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在分子水平上對低氧信號的處理起著重要的作用。Ng 等[16]在研究中證明了外源性 HIF-1α cDNA 在小鼠胚胎干細胞中的表達顯著促進了心肌細胞的形成，表現為較高比例的跳動胚狀體和肌鈣蛋白-T 陽性細胞計數以及早期和晚期心臟標志物的表達增加，如 GATA 結合蛋白 4 和 6，NK2 轉錄因子相關基因座 5，α-肌球蛋白重鏈，β-肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈都明顯增加。另外，轉導的細胞顯示心肌營養素-1 和血管內皮生長因子的 mRNA 水平增加以及 eNOS 的磷酸化［p-eNOS（ser1171）］。應用 NOS 抑制劑二苯基碘鎓氯化物（DPI），Nω-硝基-1-精氨酸甲酯鹽酸鹽（l-NAME）或 Nω-硝基-1-精氨酸（l-NNA）消除了 HIF-1α 誘導的心肌分化。說明了 HIF-1 途徑的激活促進了胚胎干細胞向心肌細胞的分化與成熟[15-17]。
我們的實驗結果表明：在低氧三維培養條件下，低氧組的細胞增殖程度（OD=0.455±0.027）明顯大于常氧組（OD=0.352±0.090，n=12，P=0.01）。低氧組的 HIF-1α mRNA 表達水平在 12 h 后顯著高于常氧組（P<0.05）。24 h 后 Western blotting 檢測到 HIF-1α 蛋白表達增加。所以我們認為，低氧三維培養微環境促進骨髓間充質干細胞增殖，這一效應可能與 HIF-1α 信號通路的激活有關。
心肌梗死后，心肌細胞無法再生，心肌細胞的數量絕對減少，患者的心臟功能將會不可逆性受損，心力衰竭成為其近遠期無法避免的結局。長期以來，臨床上對此類患者的治療手段極其有限。令人欣慰的是，隨著對干細胞及其臨床應用研究的不斷深入似乎讓人們看到了曙光。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有自我復制及在特定微環境下向多種類型細胞分化的能力，可在體外培養、擴增和維持在未分化狀態[1]。干細胞的這些特性是人們試圖通過干細胞移植來改善病變心臟功能的基礎。早在十幾年前，就有學者[2-3]試圖通過向心臟的梗死區移植干細胞的方法來修復受損的心肌，以期改善患者的心臟功能。
以往的眾多研究證實了該方法的有效性，但是依然存在很多問題。梗死區干細胞注射的傳統移植方式，雖然操作相對簡單，成本較低，但是移植后往往細胞流失嚴重且增殖緩慢，大大地影響了后期治療效果。我們的前期研究中將聚-3 羥基丁酸酯-co-4 羥基丁酸酯［poly 3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，P（3HB-co-4HB）］作為三維細胞載體，為細胞提供三維的黏附、生長的微環境，發現其能促進細胞的黏附和增殖分化[4-7]。心肌梗死發生后，梗死區域細胞將處于低氧微環境中。本實驗研究低氧三維培養條件對骨髓間充質干細胞黏附、存活和增殖產生的影響及影響機制。
1 材料及方法
1.1 主要材料
3 周齡昆明鼠來自安貞醫院動物房。該實驗經首都醫科大學附屬北京安貞醫院醫學倫理委員會審批（倫理審批編號：2018060X）。實驗材料包括胎牛血清（Gibco，美國），青鏈霉素雙抗（上海翊圣，中國），胰酶-EDTA（上海翊圣，中國），低糖 DMEM 培養基（Hyclone，美國），PBS 緩沖液（Gibco，美國），P（3HB-co-4HB）材料（清華大學化工系高分子研究所實驗室提供），HIF-1α 抗體（Immunoway，美國），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（天德悅，中國），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP（天德悅，中國），β-actin 鼠單抗（Immunoway，美國），離心管（Corning，美國），細胞培養瓶（Corning，美國），缺氧袋（三菱，日本），CCK-8 試劑（上海翊圣，中國），Trizol 試劑（天根生化，中國），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，中國），SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus（TaKaRa，日本），DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本），引物合成（Invitrogen，美國）。
1.2 主要儀器
主要使用的儀器包括高速控溫離心機（Thermo Fisher，美國），二氧化碳細胞培養箱（Thermo Fisher，美國），離心機（Thermo Fisher，美國），倒置相差顯微鏡（Leica，德國），缺氧箱（三菱，日本），恒溫水浴鍋，全光譜酶標儀（Thermo Fisher，美國），低溫冰箱（Thermo，美國），Mini P-4 電泳槽（Cavoy，中國），濕轉電泳槽（Cavoy，中國），電泳儀（Bio-Rad，美國），渦旋振蕩儀（其林貝爾，中國），凝膠成像系統（上海天能科技，中國），熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 小鼠骨髓間充質干細胞的提取
3 周齡昆明鼠，斷頸處死后，酒精浸泡 15 min，然后用無菌解剖剪和解剖鑷取出小鼠股骨，LG-DMEM 培養基沖洗骨髓腔，并用無菌尼龍網過濾，1 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清液后用完全 LG-DMEM 培養基重懸細胞，然后接種于 25T 培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中，72 h 后更換培養基，以后每 2 d 換液，以除去非貼壁的造血系細胞和其他細胞，直到細胞形態趨于一致后進行鑒定。
1.3.2 CCK-8 法測定低氧對干細胞增殖的影響
在培養的第 24 h，各組分別隨機選取 12 個孔，吸去培養基，每孔加入含 10% CCK-8 試劑的 DMEM 完全培養基，在培養箱中孵育 2 h，然后用酶標儀測定 450 nm 處的吸光度值。
1.3.3 實時定量 PCR 檢測 HIF-1α 基因表達情況
培養 12 h 后，用 Trizol 試劑提取樣品總 RNA（實驗操作按產品說明書進行）。紫外吸收測定法檢測濃度和純度，RNA 溶液的 A260/A280 的比值范圍應在 1.8～2.1 之間。變性瓊脂糖凝膠電泳并在紫外透射光下觀察并拍照。采用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 進行 cDNA 反轉錄（實驗操作按產品說明書進行），內參選用 GADPH，將 cDNA 樣品加入實時定量 PCR 反應體系中進行反應，擴增程序如下：95℃，30 s；40 個 PCR 循環［95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光）］。為了建立 PCR 產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s 進行產物分析，并收集熒光信號；并從 60℃ 緩慢加熱到 99℃（儀器自動進行-Ramp Rate 為 0.05℃/s）。檢測結果按照 2?△△ct 方法進行相對定量計算。引物序列如下：HIF-1α forward 5’-AAGGACAAGTCACCACAGGACA-3’reverse 5’-AGGGAGAAAATCAAGTCGTGCT-3’GAPDH forward 5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAG-3’GAPDH reverse 5’ACATACTCAGCACCGGCCTC-3’。
1.4 統計學分析
實驗數據采用 SPSS20.0 軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 骨髓間充質干細胞光鏡照片
P5 代骨髓間充質干細胞散在分布，呈三角形、星形、梭形或多角形，不規則形，絕大部分貼壁細胞，生長較快；見圖 1。
圖1
骨髓間充質干細胞（×100）
2.2 CCK-8 法測定干細胞的增殖情況
在開始培養時，兩組的 OD 值是相等的，均為為 0.23。經過 24 h 的培養，低氧組的 OD 值已經明顯大于常氧組（0.455±0.027 vs. 0.352±0.090，n=12，P=0.01）；見圖 2。
圖2
兩組的 OD 值變化
2.3 實時定量 PCR 檢測 HIF-1α 基因表達
檢測結果使用 2-△△ct方法進行相對定量計算，并且進行統計學檢驗，低氧培養 12 h 后，低氧組的 HIF-1α mRNA 表達水平顯著高于常氧組（P<0.05）；見圖 3。
圖3
低氧培養 12 h 后，兩組 HIF-1α mRNA 表達水平
2.4 Western blotting 檢測 HIF-1α 的表達
將膠片進行灰度分析并進行統計學分析得出結果：同常氧組比較，低氧組 HIF-1α 蛋白相對表達水平顯著增高（0.47±0.05 vs. 0.63±0.06，n=3，P<0.05）；見圖 4。
圖4
兩組 HIF-1α 表達
3 討論
伴隨著我國經濟、社會的高速發展，全國疾病譜也悄然發生了翻天覆地的變化。幾十年間，心血管系統疾病早已替代感染性疾病，成為威脅我國人民健康的頭號殺手。其中缺血性心臟病，由于其發病快，病情重，預后差，死亡率極高，嚴重威脅人們的生命健康，心肌細胞無法再生的特點使得心肌梗死患者心臟功能的破壞具有不可逆性。干細胞移植技術的發展似乎帶給人們新的希望。Strauer 等[8]在患者發生心肌梗死 6 d 后，將患者的自體干細胞輸注到與梗死相關的動脈（“罪犯”血管）中。通過單光子發射計算機斷層成像術（SPECT），在休息和運動時測量左心室功能，梗死面積，心室幾何形狀和心肌灌注，同時進行多靶點分析，多巴酚丁胺負荷超聲心動圖，右心導管檢查和放射性核素心室檢查。結果顯示干細胞移植 10 周后，左心室周圍的透壁梗死面積從 24.6%降至 15.7%，射血分數、心臟指數和每搏輸出量增加了 20%～30%。Stamm 在冠狀動脈旁路移植術（CABG）期間將其自體骨髓干細胞注射到梗死邊界區。12 例接受注射的患者都沒有發生心律失常或成瘤的嚴重并發癥，隨后的閃爍照相顯示注射干細胞的梗死區比沒有注射干細胞的梗死區的灌注情況得到了顯著改善[8-11]。這些結果證明，干細胞移植治療心臟疾病是可行的，可使得心肌梗死后的瘢痕面積縮小，改善心室功能。
雖然干細胞移植術治療心肌梗死取得了一些成就，但是由于以往的研究多以直接梗死區注射的方式進行，遠期來看，細胞往往流失嚴重，治療效果不盡人意。所以就需要用載體材料來為干細胞提供物理支撐使細胞可以黏附其上，以期達到降低流失率的效果。補片材料是能夠模仿細胞外基質的特異性三維排列結構，為種子細胞提供生存和增殖的環境，補片材料要有良好的生物相容性、可降解性以及生物安全性，從而減少細胞移植過程中細胞的流失，因此支架材料的選擇是心肌補片的重要環節之一。前期有運用聚氨酯（polyurethane，PU）、聚碳酸亞丙酯（poly propylene carbonate）等材料的報道，但由于毒性、可塑性、難以降解等種種問題而不能進一步應用于研究，且目前的載體材料大多無法給細胞提供近似體內的三維生長微環境，往往移植細胞流失嚴重，因此一種既能為細胞提供生長的三維空間又能有效防止細胞流失的載體材料對于移植成功來說是十分重要的。近年來 P（3HB-co-4HB）引起了人們的注意，其全稱為聚-3 羥基丁酸酯-co-4 羥基丁酸酯，是一種新型生物相容材料，具有良好的可塑性及延展性，在體內外條件下降解終產物為無毒的二氧化碳和水，利用現在工業技術可加工成三維支撐材料，為細胞提供三維物理性支撐，且具有良好的生物相容性，在醫學領域具有巨大潛力[12-14]。我們的前期實驗工作表明：P（3HB-co-4HB）具有很好的生物相容性、韌性和加工性；在作為種植干細胞的載體，制作心肌補片的相關實驗研究中，干細胞種植于補片能促進干細胞的黏附存留和增殖分化，形成心肌補片，改善梗死心肌。
心肌梗死發生后，梗死區域細胞將處于低氧微環境中。有研究顯示低氧環境下心肌細分化相關基因和蛋白質的表達顯著增加。Correia 等[15]研究了不同溶解氧對鼠 iPSC 向心肌分化的影響。發現與常氧（20% O2 張力）相比，缺氧培養（4% O2 張力）導致心肌細胞的分化數量提高約 1 000 倍。表現出典型的心肌肌節結構，鈣瞬變，電生理學特征和藥物反應性。缺氧在發育過程中心血管系統的增殖，分化和維持中起著重要的作用。缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在分子水平上對低氧信號的處理起著重要的作用。Ng 等[16]在研究中證明了外源性 HIF-1α cDNA 在小鼠胚胎干細胞中的表達顯著促進了心肌細胞的形成，表現為較高比例的跳動胚狀體和肌鈣蛋白-T 陽性細胞計數以及早期和晚期心臟標志物的表達增加，如 GATA 結合蛋白 4 和 6，NK2 轉錄因子相關基因座 5，α-肌球蛋白重鏈，β-肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈都明顯增加。另外，轉導的細胞顯示心肌營養素-1 和血管內皮生長因子的 mRNA 水平增加以及 eNOS 的磷酸化［p-eNOS（ser1171）］。應用 NOS 抑制劑二苯基碘鎓氯化物（DPI），Nω-硝基-1-精氨酸甲酯鹽酸鹽（l-NAME）或 Nω-硝基-1-精氨酸（l-NNA）消除了 HIF-1α 誘導的心肌分化。說明了 HIF-1 途徑的激活促進了胚胎干細胞向心肌細胞的分化與成熟[15-17]。
我們的實驗結果表明：在低氧三維培養條件下，低氧組的細胞增殖程度（OD=0.455±0.027）明顯大于常氧組（OD=0.352±0.090，n=12，P=0.01）。低氧組的 HIF-1α mRNA 表達水平在 12 h 后顯著高于常氧組（P<0.05）。24 h 后 Western blotting 檢測到 HIF-1α 蛋白表達增加。所以我們認為，低氧三維培養微環境促進骨髓間充質干細胞增殖，這一效應可能與 HIF-1α 信號通路的激活有關。
