引用本文： 張小寧, 莊建, 吳紅穗, 陳志紅, 蘇健, 陳世良, 陳劍光. 降鈣素基因相關肽轉基因對移植靜脈病的防治作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(11): 880-885. doi: 10.7507/1007-4848.201604054 復制
自體靜脈是動脈重建術的常用材料。然而，自體靜脈移植術后，由于自體靜脈經受缺血、損傷、炎癥反應和承受動脈血的高壓等因素，早期可出現栓塞、痙攣，隨后可產生移植靜脈內膜增生和粥樣硬化，偶見血管瘤，這些現象統稱為移植靜脈病，其嚴重影響著冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）和外周血管疾病術后的臨床效果[1]。
降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種含有 37 個氨基酸的生物活性肽，含 CGRP 的神經包繞著大部分血管。研究表明 CGRP 可通過多種機制抑制炎細胞浸潤[2]，具有保護血管內皮細胞的作用[3]，抑制血管平滑肌細胞增生[4]，CGRP 有可能從多方面逆轉移植靜脈引起的病理生理變化。我們構建了重組腺相關病毒 2/1 型載體（mosaic adeno-associated virus vector tipe 2/1，AAV2/1）包裝 CGRP（AAV2/1-CGRP），研究 CGRP 轉基因對移植靜脈病的防治作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物模型建立、基因轉染和標本留取
25 只雄性新西蘭白兔，體質量 2.5～3.0 kg（購自廣東省實驗動物中心）。將其隨機分為 3 組：實驗組 8 只、載體組 9 只和對照組 8 只，所有實驗動物使用 3% 戊巴比妥按 3 mg/kg 肌肉注射麻醉，采用同側頸靜脈到頸動脈端-側吻合移植建立實驗動物模型。給以靜脈注射 1 000 IU 肝素后，采用頸部正中切口，游離左側頸靜脈，選定長約 3.0 cm 的一段頸靜脈兩端予以結扎，其近端向外旁開 0.5 cm 再次結扎，在遠端內側用 1 ml 注射器吸凈血管內血液后，注入 0.4～0.6 ml AAV2/1-CGRP（5×1010 vg/ml，實驗組）、AAV2/1-LacZ（5×1010 vg/ml，載體組）或生理鹽水（對照組），以血管充盈為度，后在針孔內側結扎血管，在兩結扎線之間剪下靜脈，浸入裝有相同滴度的 2 ml AAV2/1-CGRP（實驗組）、AAV2/1-LacZ（載體組）或生理鹽水（對照組）的試管中，室溫放置 30 min。游離頸動脈，將頸靜脈反向端-側吻合植入頸動脈，用青霉素沖洗切口后，予以縫合。術畢，送動物中心飼養，青霉素 40 萬單位肌注，2 次/d，連續肌注 3 d 以預防術后感染。
實驗組、載體組和對照組分別死亡 1 只、2 只和 1 只，總死亡率 16%（4/25），術后 4 周取下植入靜脈（每組各 7 只），留取長 2.5 mm 的中段靜脈標本，用 10% 福爾馬林固定。各組中選擇 2 例再取長 2.5 mm 的中段標本及各組剩余標本收集到凍存管中，用液氮閃凍后，放入 –70℃ 冰箱凍存。
1.2 組織學研究
10% 福爾馬林固定的標本，經脫水、透明、石蠟包埋后，行連續切片，厚約 5 μm，分別行蘇木素伊紅（HE）染色和彈力 VG 染色（EVG），其中樣本經過 EVG 染色后中膜呈蘭色，用面積定量分析掃描程序分別測定中膜和內膜面積，并計算內膜面積/中膜面積比值。
1.3 β-半乳糖苷酶原位染色
取出載體組凍存組織，行全組織 β-半乳糖苷酶原位染色（GENMED，按說明書操作）后，制成蠟塊切片，切片厚 8 μm，在 200 倍顯微鏡下觀察 β-半乳糖苷酶染色情況，陽性細胞呈藍色。
1.4 免疫組化研究
切片脫蠟，3% 過氧化氫室溫孵育，水洗，抗原熱修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育，滴加 CD68 一抗（Dako，抗體稀釋比例 1∶30），4℃ 過夜。滴加二抗，37℃ 孵育 1 h。加生物素標記的鏈霉卵白素（SABC），37℃ 孵育，磷酸緩沖液（PBS）充分漂洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，光學顯微鏡下控制顯色時間。蘇木素復染。以 PBS 代替一抗作陰性對照。胞膜出現棕黃色為陽性細胞。
1.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應和實時熒光定量聚合酶鏈式反應
用 trizol 提取總 RNA，行質控和濃度測定后，逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）觀測 CGRP 及內參 GADPH 基因表達，所用引物如表 1（引物設計參考文獻[5]）使用一步法 RT-PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），條件均如下： 40℃ 保溫 1 h；94℃，5 min；94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，循環 30 次；72℃ 再延伸 10 min。
使用兩步法 RT-PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），按試劑合操作說明行 cDNA 合成，cDNA 合成以后置于 –20℃ 保存待下游工作。使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI 公司，美國）試劑盒，按試劑盒操作說明分別對目標孔和內對照孔（均以 GADPH 為內對照）進行加樣，所用引物如表 1。使用美國 ABI 公司 7000 分析儀進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）檢測，熱循環的條件為: Amp Erase UNG 50℃ 活化 2 min；AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 95℃ 活化 10 min。PCR 擴增（40 個循環）：95℃，15 s；60℃，1 min。待反應完畢，選擇目標孔和內對照探針孔，分析各個樣品的結果。
表1
RT-PCR 和 real-time PCR 引物
1.6 統計學分析
實驗所得數據應用 SPSS13.0 統計軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（
）表示，多組間均數比較采用方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 基因表達情況
在實驗組 AAV2/1-CGRP 病毒中 CGRP RT-PCR 檢測呈陽性，而載體組和對照組中 CGRP RT-PCR 檢測呈陰性，這說明僅在實驗組中有 CGRP 基因表達。β-半乳糖苷酶原位染色結果顯示載體組有 LacZ 基因表達；見圖 1。
圖1
基因表達情況 a. 實驗組作為陽性對照，對照組作為陰性對照，只有實驗組有 CGRP 基因表達； b. 載體組 β-gal 原位染色×200，β-gal 原位染色陽性為藍色
2.2 CGRP 基因轉染對移植靜脈內膜增生的抑制作用
EVG 染色后，行內膜面積/中膜面積比值統計顯示，實驗組內膜面積/中膜面積比值與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 37% 和 39%，這說明實驗組發揮了防治移植靜脈病的作用（圖 2，圖 3）。實驗組移植靜脈結構完好，管腔通暢，而載體組和對照組則出現大量炎細胞浸潤，血管壁結構增厚、破壞甚至閉塞；經巨噬細胞標志抗體 CD68 免疫組化研究證實，實驗組巨噬細胞很少，而載體組和對照組則出現大量巨噬細胞浸潤（圖 4）。
圖2
實驗組、載體組和對照組經 EVG 染色后的移植靜脈組織切面（EVG×100）
圖3
實驗組、載體組、對照組移植靜脈 4 周后內膜面積/中膜面積的比值，*與載體組和對照組相比，P<0.001
2.3 CGRP 對炎癥因子 MCP-1、TNF-α、iNOS、MMP-9 的抑制作用
實驗組 MCP-1 mRNA 與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 0.21 倍（1.81/8.49）和 0.20 倍（1.81/9.04）；實驗組 TNF-α mRNA 與載體組和對照組相比降低，是載體組和對照組的 0.48 倍（4.66/9.79）和 0.45 倍（4.66/10.47）；實驗組 iNOS mRNA 與載體組和對照組相比降低，是載體組和對照組的 0.54 倍（5.40/10.08）和 0.51 倍（5.40/10.60）；實驗組 MMP-9 mRNA 與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 0.14 倍（1.05/7.29）和 0.12 倍（1.05/8.41）；見圖 5。
圖5
炎癥因子 mRNA real-time PCR 檢測結果（每組 n=7） a. 炎癥因子 MCP-1； b. TNF-α； c. iNOS； d. MMP-9； *與載體組和對照組相比，P<0.05
3 討論
重組腺相關病毒載體源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣（分裂和非分裂細胞）、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。Kilian 等[6]研究表明重組腺相關病毒載體可成功轉染移植靜脈，而經改造的重組腺相關病毒載體 1 型進一步提高了基因轉染效率[7]。Stachler 等[8]研究顯示嵌合型重組腺相關病毒載體 1 型 50～100 倍地增加了血管內皮細胞基因轉染效率，并建議嵌合型重組腺相關病毒載體 1 型很有希望進行血管基因轉染。本課題構建嵌合型重組腺相關病毒降鈣素基因相關肽基因載體（AAV2/1-CGRP），這一載體的構建國內外未見報道。通過 RT-PCR 檢測術后 4 周 CGRP 基因表達情況及 β-半乳糖苷酶原位染色檢測 LacZ 基因表達，顯示 AAV2/1-CGRP 和 AAV2/1-LacZ 有效地轉染了移植靜脈。實驗組內膜面積/中膜面積比率與載體組和對照組相比顯著降低，實驗組巨噬細胞浸潤與載體組和對照組相比顯著減少，這說明實驗組發揮了防治移植靜脈病的作用。研究中使用的轉基因方法簡便易行，可適用于臨床冠狀動脈外科手術操作。
正常血管很少表達 MCP-1，而在損傷和炎癥刺激下，血管內皮、血管平滑肌細胞和巨噬細胞均可表達 MCP-1[9-10]。研究顯示，巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的增高與移植靜脈病密切相關，MCP-1 的增高在移植靜脈病形成過程中起關鍵作用[10-11]，而抗 MCP-1基因治療可有效防治移植靜脈病[12]。有報道 CGRP 抑制 IL-1β 引起的 MCP-1 增高[2]，抑制巨噬細胞[13]，在本課題中 CGRP 基因轉染有效抑制了巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的增高，所以，CGRP 可通過抑制巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的途徑發揮防治移植靜脈病的作用。
巨噬細胞浸潤后釋放 TNF-α、iNOS，巨噬細胞轉化為泡沫細胞，泡沫細胞進一步釋放 MMP-9[14]，MMP-9 與移植靜脈病中血管內膜增厚和血管平滑肌細胞增生有密切關系[15-16]。TNF-α 刺激 MMP-9 合成[17]；而抑制 TNF-α，則可進一步抑制 MMP-9 介導的 VSMC 移行、增生[18-19]。iNOS 同樣可刺激 MMP-9 的合成和血管平滑肌細胞增生，iNOS 與血管粥樣硬化的形成有密切的關系[20-21]。研究顯示，CGRP 抑制巨噬細胞及巨噬細胞釋放 TNF-α、iNOS[22]。本研究中 CGRP 基因表達抑制了巨噬細胞浸潤，TNF-α、iNOS 表達也減少，顯著抑制了 MMP-9 合成，減少了 MMP-9 刺激引起的移植靜脈病。
總之，CGRP 基因表達抑制了巨噬細胞浸潤及炎癥因子 MCP-1、TNF-α、iNOS、MMP-9 的表達，通過多種機制保護移植靜脈，發揮防治移植靜脈病的作用。這一研究結果提示 AAV2/1 CGRP 基因治療有望得到臨床應用。
致謝 人 CT/CGRP 基因第 2、3、5 和 6 外顯子序列的 pcDNA3.1-CGRP 質粒由北京大學生理研究所王憲教授惠贈，rAAV2/1-CGRP 由北京本元正陽基因技術有限公司構建。
自體靜脈是動脈重建術的常用材料。然而，自體靜脈移植術后，由于自體靜脈經受缺血、損傷、炎癥反應和承受動脈血的高壓等因素，早期可出現栓塞、痙攣，隨后可產生移植靜脈內膜增生和粥樣硬化，偶見血管瘤，這些現象統稱為移植靜脈病，其嚴重影響著冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）和外周血管疾病術后的臨床效果[1]。
降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種含有 37 個氨基酸的生物活性肽，含 CGRP 的神經包繞著大部分血管。研究表明 CGRP 可通過多種機制抑制炎細胞浸潤[2]，具有保護血管內皮細胞的作用[3]，抑制血管平滑肌細胞增生[4]，CGRP 有可能從多方面逆轉移植靜脈引起的病理生理變化。我們構建了重組腺相關病毒 2/1 型載體（mosaic adeno-associated virus vector tipe 2/1，AAV2/1）包裝 CGRP（AAV2/1-CGRP），研究 CGRP 轉基因對移植靜脈病的防治作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物模型建立、基因轉染和標本留取
25 只雄性新西蘭白兔，體質量 2.5～3.0 kg（購自廣東省實驗動物中心）。將其隨機分為 3 組：實驗組 8 只、載體組 9 只和對照組 8 只，所有實驗動物使用 3% 戊巴比妥按 3 mg/kg 肌肉注射麻醉，采用同側頸靜脈到頸動脈端-側吻合移植建立實驗動物模型。給以靜脈注射 1 000 IU 肝素后，采用頸部正中切口，游離左側頸靜脈，選定長約 3.0 cm 的一段頸靜脈兩端予以結扎，其近端向外旁開 0.5 cm 再次結扎，在遠端內側用 1 ml 注射器吸凈血管內血液后，注入 0.4～0.6 ml AAV2/1-CGRP（5×1010 vg/ml，實驗組）、AAV2/1-LacZ（5×1010 vg/ml，載體組）或生理鹽水（對照組），以血管充盈為度，后在針孔內側結扎血管，在兩結扎線之間剪下靜脈，浸入裝有相同滴度的 2 ml AAV2/1-CGRP（實驗組）、AAV2/1-LacZ（載體組）或生理鹽水（對照組）的試管中，室溫放置 30 min。游離頸動脈，將頸靜脈反向端-側吻合植入頸動脈，用青霉素沖洗切口后，予以縫合。術畢，送動物中心飼養，青霉素 40 萬單位肌注，2 次/d，連續肌注 3 d 以預防術后感染。
實驗組、載體組和對照組分別死亡 1 只、2 只和 1 只，總死亡率 16%（4/25），術后 4 周取下植入靜脈（每組各 7 只），留取長 2.5 mm 的中段靜脈標本，用 10% 福爾馬林固定。各組中選擇 2 例再取長 2.5 mm 的中段標本及各組剩余標本收集到凍存管中，用液氮閃凍后，放入 –70℃ 冰箱凍存。
1.2 組織學研究
10% 福爾馬林固定的標本，經脫水、透明、石蠟包埋后，行連續切片，厚約 5 μm，分別行蘇木素伊紅（HE）染色和彈力 VG 染色（EVG），其中樣本經過 EVG 染色后中膜呈蘭色，用面積定量分析掃描程序分別測定中膜和內膜面積，并計算內膜面積/中膜面積比值。
1.3 β-半乳糖苷酶原位染色
取出載體組凍存組織，行全組織 β-半乳糖苷酶原位染色（GENMED，按說明書操作）后，制成蠟塊切片，切片厚 8 μm，在 200 倍顯微鏡下觀察 β-半乳糖苷酶染色情況，陽性細胞呈藍色。
1.4 免疫組化研究
切片脫蠟，3% 過氧化氫室溫孵育，水洗，抗原熱修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育，滴加 CD68 一抗（Dako，抗體稀釋比例 1∶30），4℃ 過夜。滴加二抗，37℃ 孵育 1 h。加生物素標記的鏈霉卵白素（SABC），37℃ 孵育，磷酸緩沖液（PBS）充分漂洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，光學顯微鏡下控制顯色時間。蘇木素復染。以 PBS 代替一抗作陰性對照。胞膜出現棕黃色為陽性細胞。
1.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應和實時熒光定量聚合酶鏈式反應
用 trizol 提取總 RNA，行質控和濃度測定后，逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）觀測 CGRP 及內參 GADPH 基因表達，所用引物如表 1（引物設計參考文獻[5]）使用一步法 RT-PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），條件均如下： 40℃ 保溫 1 h；94℃，5 min；94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，循環 30 次；72℃ 再延伸 10 min。
使用兩步法 RT-PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），按試劑合操作說明行 cDNA 合成，cDNA 合成以后置于 –20℃ 保存待下游工作。使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI 公司，美國）試劑盒，按試劑盒操作說明分別對目標孔和內對照孔（均以 GADPH 為內對照）進行加樣，所用引物如表 1。使用美國 ABI 公司 7000 分析儀進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）檢測，熱循環的條件為: Amp Erase UNG 50℃ 活化 2 min；AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 95℃ 活化 10 min。PCR 擴增（40 個循環）：95℃，15 s；60℃，1 min。待反應完畢，選擇目標孔和內對照探針孔，分析各個樣品的結果。
表1
RT-PCR 和 real-time PCR 引物
1.6 統計學分析
實驗所得數據應用 SPSS13.0 統計軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（
）表示，多組間均數比較采用方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 基因表達情況
在實驗組 AAV2/1-CGRP 病毒中 CGRP RT-PCR 檢測呈陽性，而載體組和對照組中 CGRP RT-PCR 檢測呈陰性，這說明僅在實驗組中有 CGRP 基因表達。β-半乳糖苷酶原位染色結果顯示載體組有 LacZ 基因表達；見圖 1。
圖1
基因表達情況 a. 實驗組作為陽性對照，對照組作為陰性對照，只有實驗組有 CGRP 基因表達； b. 載體組 β-gal 原位染色×200，β-gal 原位染色陽性為藍色
2.2 CGRP 基因轉染對移植靜脈內膜增生的抑制作用
EVG 染色后，行內膜面積/中膜面積比值統計顯示，實驗組內膜面積/中膜面積比值與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 37% 和 39%，這說明實驗組發揮了防治移植靜脈病的作用（圖 2，圖 3）。實驗組移植靜脈結構完好，管腔通暢，而載體組和對照組則出現大量炎細胞浸潤，血管壁結構增厚、破壞甚至閉塞；經巨噬細胞標志抗體 CD68 免疫組化研究證實，實驗組巨噬細胞很少，而載體組和對照組則出現大量巨噬細胞浸潤（圖 4）。
圖2
實驗組、載體組和對照組經 EVG 染色后的移植靜脈組織切面（EVG×100）
圖3
實驗組、載體組、對照組移植靜脈 4 周后內膜面積/中膜面積的比值，*與載體組和對照組相比，P<0.001
2.3 CGRP 對炎癥因子 MCP-1、TNF-α、iNOS、MMP-9 的抑制作用
實驗組 MCP-1 mRNA 與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 0.21 倍（1.81/8.49）和 0.20 倍（1.81/9.04）；實驗組 TNF-α mRNA 與載體組和對照組相比降低，是載體組和對照組的 0.48 倍（4.66/9.79）和 0.45 倍（4.66/10.47）；實驗組 iNOS mRNA 與載體組和對照組相比降低，是載體組和對照組的 0.54 倍（5.40/10.08）和 0.51 倍（5.40/10.60）；實驗組 MMP-9 mRNA 與載體組和對照組相比顯著降低，是載體組和對照組的 0.14 倍（1.05/7.29）和 0.12 倍（1.05/8.41）；見圖 5。
圖5
炎癥因子 mRNA real-time PCR 檢測結果（每組 n=7） a. 炎癥因子 MCP-1； b. TNF-α； c. iNOS； d. MMP-9； *與載體組和對照組相比，P<0.05
3 討論
重組腺相關病毒載體源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣（分裂和非分裂細胞）、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。Kilian 等[6]研究表明重組腺相關病毒載體可成功轉染移植靜脈，而經改造的重組腺相關病毒載體 1 型進一步提高了基因轉染效率[7]。Stachler 等[8]研究顯示嵌合型重組腺相關病毒載體 1 型 50～100 倍地增加了血管內皮細胞基因轉染效率，并建議嵌合型重組腺相關病毒載體 1 型很有希望進行血管基因轉染。本課題構建嵌合型重組腺相關病毒降鈣素基因相關肽基因載體（AAV2/1-CGRP），這一載體的構建國內外未見報道。通過 RT-PCR 檢測術后 4 周 CGRP 基因表達情況及 β-半乳糖苷酶原位染色檢測 LacZ 基因表達，顯示 AAV2/1-CGRP 和 AAV2/1-LacZ 有效地轉染了移植靜脈。實驗組內膜面積/中膜面積比率與載體組和對照組相比顯著降低，實驗組巨噬細胞浸潤與載體組和對照組相比顯著減少，這說明實驗組發揮了防治移植靜脈病的作用。研究中使用的轉基因方法簡便易行，可適用于臨床冠狀動脈外科手術操作。
正常血管很少表達 MCP-1，而在損傷和炎癥刺激下，血管內皮、血管平滑肌細胞和巨噬細胞均可表達 MCP-1[9-10]。研究顯示，巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的增高與移植靜脈病密切相關，MCP-1 的增高在移植靜脈病形成過程中起關鍵作用[10-11]，而抗 MCP-1基因治療可有效防治移植靜脈病[12]。有報道 CGRP 抑制 IL-1β 引起的 MCP-1 增高[2]，抑制巨噬細胞[13]，在本課題中 CGRP 基因轉染有效抑制了巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的增高，所以，CGRP 可通過抑制巨噬細胞浸潤和 MCP-1 的途徑發揮防治移植靜脈病的作用。
巨噬細胞浸潤后釋放 TNF-α、iNOS，巨噬細胞轉化為泡沫細胞，泡沫細胞進一步釋放 MMP-9[14]，MMP-9 與移植靜脈病中血管內膜增厚和血管平滑肌細胞增生有密切關系[15-16]。TNF-α 刺激 MMP-9 合成[17]；而抑制 TNF-α，則可進一步抑制 MMP-9 介導的 VSMC 移行、增生[18-19]。iNOS 同樣可刺激 MMP-9 的合成和血管平滑肌細胞增生，iNOS 與血管粥樣硬化的形成有密切的關系[20-21]。研究顯示，CGRP 抑制巨噬細胞及巨噬細胞釋放 TNF-α、iNOS[22]。本研究中 CGRP 基因表達抑制了巨噬細胞浸潤，TNF-α、iNOS 表達也減少，顯著抑制了 MMP-9 合成，減少了 MMP-9 刺激引起的移植靜脈病。
總之，CGRP 基因表達抑制了巨噬細胞浸潤及炎癥因子 MCP-1、TNF-α、iNOS、MMP-9 的表達，通過多種機制保護移植靜脈，發揮防治移植靜脈病的作用。這一研究結果提示 AAV2/1 CGRP 基因治療有望得到臨床應用。
致謝 人 CT/CGRP 基因第 2、3、5 和 6 外顯子序列的 pcDNA3.1-CGRP 質粒由北京大學生理研究所王憲教授惠贈，rAAV2/1-CGRP 由北京本元正陽基因技術有限公司構建。
