引用本文： 安康, 劉旭光, 高健, 呂君其, 安君. 微創壓力超負荷小鼠心衰模型的建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(11): 1099-1102. doi: 10.7507/1007-4848.20160257 復制
小動物（大、小鼠）心衰模型被廣泛應用于心肌肥厚的病因、機制以及藥理學的研究[1]。目前心衰模型包括藥物誘導的小鼠心衰模型、轉基因方法制備的心衰模型、小鼠腹腔動-靜脈瘺方法的心衰模型以及主動脈縮窄（升主動脈、主動脈弓以及腹主動脈）致超負荷導致的心衰模型等。其中主動脈縮窄致超負荷導致的心衰模型是最為廣泛使用的模型[1-2]，但因主動脈縮窄的方法和部位不同，導致心衰模型的重復性、成功率以及心衰程度等不盡相同。我們通過胸骨上窩使用鉭夾部分夾閉主動脈弓的方法，使心衰模型的形成時間相對固定，心衰的程度可控，其重復性好。該模型制作技術相對簡單，不損傷胸膜，手術時間短，成功率高，現將其方法報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
實驗動物：選用雄性昆明種系小鼠，20～25克，鼠齡4周齡，共30只，吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。假手術組10只；實驗組20只，經胸骨上窩利用鉭夾部分夾閉主動脈弓組10周。其中部分夾閉主動脈弓為0.35 mm（縮窄后主動脈直徑為0.35 mm）10只；部分夾閉主動脈弓為0.25 mm（縮窄后主動脈直徑為0.25 mm）10只。
1.2 方法
1.2.1 外科手術
戊巴比妥鈉（30 mg/kg體重）腹腔內麻醉，仰臥位固定，用脫毛膏去除頸部及胸部毛發，本組未用呼吸機。在小鼠胸骨上窩縱行切開約1～2 cm皮膚（包括切開上部胸骨1.0～1.2 cm）。外科顯微鏡下輕柔、鈍、銳性剔除胸腺，顯露主動脈弓，顯露右無名動脈和左頸總動脈間隙，手術組用鉭夾部分夾閉右無名動脈和左頸總動脈間的主動脈弓（縮窄后主動脈直徑分別為0.35 mm、0.25 mm），縫合頸胸肌、皮膚，完成手術。假手術組，手術操作與模型制備組步驟完全相同，僅不縮窄夾閉主動脈弓。
1.2.2 心臟超聲動態觀察
手術10周后在麻醉下進行心臟超聲動態觀察，通過17 mHz探頭（General Electric，Vivid V echocardiograph）觀察左室后壁舒張期末厚度（LVPWD）、左室舒張期末直徑（LVEDD）、短軸縮短率（FS）以及射血分數（EF）。
1.2.3 小鼠體重及心臟稱重
心臟超聲動態觀察完畢后將小鼠用過量戊巴比妥鈉處死，分別稱體重和心臟重量，計算心臟（heart weight，HW）及小鼠體重（body weight，BW）之比（mg/g）。
1.2.4 血清NT-proBNT檢測
取假手術組和主動脈弓部分夾閉組各6只小鼠血液，3 000 rpm離心10 min，取上清，按照酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒操作說明進行檢測血清NT-proBNT[3]。
1.2.5 心肌形態學觀察
心臟超聲動態觀察完畢將小鼠用過量戊巴比妥鈉犧牲，而后用福爾馬林灌注固定，取左室前壁，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察。
1.3 統計學分析
所有數據均按照均數±標準差（X±s）表示，應用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，組間用單因素ANOVA分析，兩組間用配對t檢驗，P < 0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 手術成功率
假手術組成功率為100%（10/10只）；主動脈弓部分夾閉0.35 mm組為100%（10/10只）；主動脈弓部分夾閉0.25 mm組為40%（4/10只），其中死亡6例。
2.2 HW/BW
鉭夾夾閉部分主動脈弓10周后其HW/BW較假手術組明顯增加[（8.88±0.25）mg/g vs.（3.75±0.19）mg/g，P < 0.01]。
2.3 超聲動態觀察
鉭夾部分夾閉主動脈弓10周其LVEDD與假手術組比較顯著增大[（9.24±0.23）cm vs.（6.96±0.2）cm，P < 0.01]；LVPWD與假手術組比較顯著變薄[（1.43±0.22）mm vs.（1.95±0.14）mm，P < 0.01]；EF與假手術組比較顯著變小（44.70%±1.95% vs. 69.80%±2.20%，P < 0.01）；FS與假手術組比較顯著變小（20.30%±0.95% vs. 33.90%±1.85%，P < 0.01）。鉭夾夾閉部分主動脈弓10周后其NT-proBNT較假手術組明顯增加[（459.783±22.79）ng/L，vs.（54.10±8.92）ng/L，P < 0.01）]。
2.4 形態學觀察
光鏡下假手術組小鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊，第10周心肌纖維保持正常（圖 1A）；實驗組小鼠部分心肌纖維斷裂，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性或片狀壞死（圖 1B）。
圖1
假手術和實驗組術后10周心肌纖維光鏡下觀察
注：A為假手術組HE ×100；B為實驗組HE ×100
3 討論
各種方法制備的心衰模型廣泛應用于機制探討以及長期藥理干預，包括長期生存等研究[1, 3-4]。在制備心衰模型上根據研究目的使用大[5]、中動物[6-7]到小動物[8-11]，采取藥物[12-13]、外科手術[8-9, 11]等不同方法。目前最常用的動物是大、小鼠，最常用的制備心衰模型的方法為主動脈“縮窄”，其縮窄部位為升主動脈、主動脈弓、腎動脈上部腹主動脈以及腹主動脈動靜脈瘺等。縮窄方法大多是結扎部分主動脈。結扎方法的不利點是結扎后的動脈縮窄直徑、程度往往難于控制和統一，因此縮窄后心臟的后負荷不一，故同一批制備的心衰模型形成的時間、程度不一。經典的經胸路徑制備心衰模型的技術較難，特別是分離主動脈弓，弓下穿線時容易損傷大血管出血，嚴重影響了模型的成功率。而本胸骨上窩徑路不開胸，技術加結扎方法容易掌握，胸腺剔除和主動脈弓分離較經典路徑容易，用鉭夾縮窄主動脈弓代替動脈弓下穿線，避免了因穿線導致大血管損傷出血，手術時間明顯縮短，成功率高。另一方面，通過鉭夾可控制縮窄直徑使其心衰模型形成時間基本一致，心臟超聲和形態學結果證明，心衰模型的形成時間取決于主動脈縮窄直徑。我們通過自制的鉭夾鉗控制夾閉直徑，本實驗主動脈縮窄直徑為0.35 mm時，10周后形態學上出現心肌纖維斷裂，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性壞死，同時心衰小鼠血清NT-proBNT明顯高于假手術組，證明通過該壓力超負荷心衰模型的可靠性。NT-proBNT目前已被認為是心功能不全的標志物之一，但并非NT-proBNT增高就診斷為心衰，因為當心肌損傷缺血、壞死、心室容量擴大或心室壁張力增加時，心室肌細胞迅速合成并釋放NT-proBNT，引起血中濃度增高[14]。因此，NT-proBNT不能作為診斷心衰的唯一指標，在判斷小鼠心衰時應和心臟超聲、形態學相結合。也有報道，IL-17A[15]、熱休克蛋白[3, 14]在心衰的診斷上與NT-proBNT正相關，甚至優于NT-proBNT可作為心衰的標志物，尤其近來IL-17A與心衰發生、心衰心臟重塑密切相關[8]，血清IL-17A濃度、IL-17A在心肌中的表達可能成為診斷心衰的標志物[16]。
本模型手術的關鍵是剔除胸腺時勿同時損傷雙側胸膜，如發生雙側胸膜破裂即導致小鼠死亡，而損傷單側則在縫合頸胸肌、皮膚時排凈氣體即可，一般不導致小鼠死亡，不影響模型制備。我們也觀察了主動脈縮窄后直徑為0.25 mm一組10只，但死亡6只（分別在術后2周死亡1例，3周小鼠出現雙眼球凸出、失明，死亡3例，4周死亡2例），余下4例在4～5周內死亡，提示主動脈縮窄直徑過小引起急劇后負荷增加，可能導致小鼠急性心衰而死亡。而在主動脈縮窄直徑為0.35 mm條件下，經10周可制備可靠的心衰模型，但需要通過心臟超聲確認后再用于研究。我們認為通過胸骨上窩途徑，利用鉭夾部分夾閉主動脈弓建立小鼠心衰模型的方法具有：（1）切口小，技術容易掌握；（2）無需使用呼吸機，不開胸，胸部并發癥少，避免血管損傷；（3）通過鉭夾控制縮窄直徑，心衰模型形成時間基本一致等優點，是一種更為安全易行、穩定可靠的壓力超負荷心衰模型制備方法。
小動物（大、小鼠）心衰模型被廣泛應用于心肌肥厚的病因、機制以及藥理學的研究[1]。目前心衰模型包括藥物誘導的小鼠心衰模型、轉基因方法制備的心衰模型、小鼠腹腔動-靜脈瘺方法的心衰模型以及主動脈縮窄（升主動脈、主動脈弓以及腹主動脈）致超負荷導致的心衰模型等。其中主動脈縮窄致超負荷導致的心衰模型是最為廣泛使用的模型[1-2]，但因主動脈縮窄的方法和部位不同，導致心衰模型的重復性、成功率以及心衰程度等不盡相同。我們通過胸骨上窩使用鉭夾部分夾閉主動脈弓的方法，使心衰模型的形成時間相對固定，心衰的程度可控，其重復性好。該模型制作技術相對簡單，不損傷胸膜，手術時間短，成功率高，現將其方法報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
實驗動物：選用雄性昆明種系小鼠，20～25克，鼠齡4周齡，共30只，吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。假手術組10只；實驗組20只，經胸骨上窩利用鉭夾部分夾閉主動脈弓組10周。其中部分夾閉主動脈弓為0.35 mm（縮窄后主動脈直徑為0.35 mm）10只；部分夾閉主動脈弓為0.25 mm（縮窄后主動脈直徑為0.25 mm）10只。
1.2 方法
1.2.1 外科手術
戊巴比妥鈉（30 mg/kg體重）腹腔內麻醉，仰臥位固定，用脫毛膏去除頸部及胸部毛發，本組未用呼吸機。在小鼠胸骨上窩縱行切開約1～2 cm皮膚（包括切開上部胸骨1.0～1.2 cm）。外科顯微鏡下輕柔、鈍、銳性剔除胸腺，顯露主動脈弓，顯露右無名動脈和左頸總動脈間隙，手術組用鉭夾部分夾閉右無名動脈和左頸總動脈間的主動脈弓（縮窄后主動脈直徑分別為0.35 mm、0.25 mm），縫合頸胸肌、皮膚，完成手術。假手術組，手術操作與模型制備組步驟完全相同，僅不縮窄夾閉主動脈弓。
1.2.2 心臟超聲動態觀察
手術10周后在麻醉下進行心臟超聲動態觀察，通過17 mHz探頭（General Electric，Vivid V echocardiograph）觀察左室后壁舒張期末厚度（LVPWD）、左室舒張期末直徑（LVEDD）、短軸縮短率（FS）以及射血分數（EF）。
1.2.3 小鼠體重及心臟稱重
心臟超聲動態觀察完畢后將小鼠用過量戊巴比妥鈉處死，分別稱體重和心臟重量，計算心臟（heart weight，HW）及小鼠體重（body weight，BW）之比（mg/g）。
1.2.4 血清NT-proBNT檢測
取假手術組和主動脈弓部分夾閉組各6只小鼠血液，3 000 rpm離心10 min，取上清，按照酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒操作說明進行檢測血清NT-proBNT[3]。
1.2.5 心肌形態學觀察
心臟超聲動態觀察完畢將小鼠用過量戊巴比妥鈉犧牲，而后用福爾馬林灌注固定，取左室前壁，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察。
1.3 統計學分析
所有數據均按照均數±標準差（X±s）表示，應用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，組間用單因素ANOVA分析，兩組間用配對t檢驗，P < 0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 手術成功率
假手術組成功率為100%（10/10只）；主動脈弓部分夾閉0.35 mm組為100%（10/10只）；主動脈弓部分夾閉0.25 mm組為40%（4/10只），其中死亡6例。
2.2 HW/BW
鉭夾夾閉部分主動脈弓10周后其HW/BW較假手術組明顯增加[（8.88±0.25）mg/g vs.（3.75±0.19）mg/g，P < 0.01]。
2.3 超聲動態觀察
鉭夾部分夾閉主動脈弓10周其LVEDD與假手術組比較顯著增大[（9.24±0.23）cm vs.（6.96±0.2）cm，P < 0.01]；LVPWD與假手術組比較顯著變薄[（1.43±0.22）mm vs.（1.95±0.14）mm，P < 0.01]；EF與假手術組比較顯著變小（44.70%±1.95% vs. 69.80%±2.20%，P < 0.01）；FS與假手術組比較顯著變小（20.30%±0.95% vs. 33.90%±1.85%，P < 0.01）。鉭夾夾閉部分主動脈弓10周后其NT-proBNT較假手術組明顯增加[（459.783±22.79）ng/L，vs.（54.10±8.92）ng/L，P < 0.01）]。
2.4 形態學觀察
光鏡下假手術組小鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊，第10周心肌纖維保持正常（圖 1A）；實驗組小鼠部分心肌纖維斷裂，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性或片狀壞死（圖 1B）。
圖1
假手術和實驗組術后10周心肌纖維光鏡下觀察
注：A為假手術組HE ×100；B為實驗組HE ×100
3 討論
各種方法制備的心衰模型廣泛應用于機制探討以及長期藥理干預，包括長期生存等研究[1, 3-4]。在制備心衰模型上根據研究目的使用大[5]、中動物[6-7]到小動物[8-11]，采取藥物[12-13]、外科手術[8-9, 11]等不同方法。目前最常用的動物是大、小鼠，最常用的制備心衰模型的方法為主動脈“縮窄”，其縮窄部位為升主動脈、主動脈弓、腎動脈上部腹主動脈以及腹主動脈動靜脈瘺等。縮窄方法大多是結扎部分主動脈。結扎方法的不利點是結扎后的動脈縮窄直徑、程度往往難于控制和統一，因此縮窄后心臟的后負荷不一，故同一批制備的心衰模型形成的時間、程度不一。經典的經胸路徑制備心衰模型的技術較難，特別是分離主動脈弓，弓下穿線時容易損傷大血管出血，嚴重影響了模型的成功率。而本胸骨上窩徑路不開胸，技術加結扎方法容易掌握，胸腺剔除和主動脈弓分離較經典路徑容易，用鉭夾縮窄主動脈弓代替動脈弓下穿線，避免了因穿線導致大血管損傷出血，手術時間明顯縮短，成功率高。另一方面，通過鉭夾可控制縮窄直徑使其心衰模型形成時間基本一致，心臟超聲和形態學結果證明，心衰模型的形成時間取決于主動脈縮窄直徑。我們通過自制的鉭夾鉗控制夾閉直徑，本實驗主動脈縮窄直徑為0.35 mm時，10周后形態學上出現心肌纖維斷裂，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性壞死，同時心衰小鼠血清NT-proBNT明顯高于假手術組，證明通過該壓力超負荷心衰模型的可靠性。NT-proBNT目前已被認為是心功能不全的標志物之一，但并非NT-proBNT增高就診斷為心衰，因為當心肌損傷缺血、壞死、心室容量擴大或心室壁張力增加時，心室肌細胞迅速合成并釋放NT-proBNT，引起血中濃度增高[14]。因此，NT-proBNT不能作為診斷心衰的唯一指標，在判斷小鼠心衰時應和心臟超聲、形態學相結合。也有報道，IL-17A[15]、熱休克蛋白[3, 14]在心衰的診斷上與NT-proBNT正相關，甚至優于NT-proBNT可作為心衰的標志物，尤其近來IL-17A與心衰發生、心衰心臟重塑密切相關[8]，血清IL-17A濃度、IL-17A在心肌中的表達可能成為診斷心衰的標志物[16]。
本模型手術的關鍵是剔除胸腺時勿同時損傷雙側胸膜，如發生雙側胸膜破裂即導致小鼠死亡，而損傷單側則在縫合頸胸肌、皮膚時排凈氣體即可，一般不導致小鼠死亡，不影響模型制備。我們也觀察了主動脈縮窄后直徑為0.25 mm一組10只，但死亡6只（分別在術后2周死亡1例，3周小鼠出現雙眼球凸出、失明，死亡3例，4周死亡2例），余下4例在4～5周內死亡，提示主動脈縮窄直徑過小引起急劇后負荷增加，可能導致小鼠急性心衰而死亡。而在主動脈縮窄直徑為0.35 mm條件下，經10周可制備可靠的心衰模型，但需要通過心臟超聲確認后再用于研究。我們認為通過胸骨上窩途徑，利用鉭夾部分夾閉主動脈弓建立小鼠心衰模型的方法具有：（1）切口小，技術容易掌握；（2）無需使用呼吸機，不開胸，胸部并發癥少，避免血管損傷；（3）通過鉭夾控制縮窄直徑，心衰模型形成時間基本一致等優點，是一種更為安全易行、穩定可靠的壓力超負荷心衰模型制備方法。