引用本文： 肖正華, 古君, 秦超毅, 胡佳, 方智, 蒙煒. 烏司他丁對機械通氣相關性肺損傷的保護作用及其機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(10): 1001-1005. doi: 10.7507/1007-4848.20160238 復制
機械通氣是臨床重癥監護中最常使用的支持手段之一，隨著機械通氣使用率的增加，其所帶來的并發癥也越來越受到重視。其中機械通氣相關性肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是呼吸機最常見的并發癥之一[1-3]。VILI的發生會導致患者住院時間延長，住院費用提高，甚至增加患者死亡率[4-5]。已有文獻報道，VILI的形成機制之一是由于機械因素導致高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）釋放，從而引起肺炎癥反應和肺損傷[6]。烏司他丁是從人尿液中提取的特異性蛋白酶抑制劑，具有降低炎癥因子的作用[7]。目前臨床已有利用烏司他丁治療VILI取得良好效果的報道[8]，但尚未明確闡釋其可能機制。本研究旨在探討烏司他丁治療VILI的相關機制。
1 材料與方法
1.1 動物分組及模型建立
清潔級健康SD大鼠24只，體重250～300 g，購自四川大學華西實驗動物中心。隨機分成3組：對照組：常規潮氣量（8 ml/kg，呼吸頻率90次/min）；呼吸機肺損傷組（VILI組，20 ml/kg，呼吸頻率50次/min）；烏司他丁組（通氣設置同VILI組，通氣前5min尾靜脈注射烏司他丁50 000 U/kg）[9]。三組動物通氣時長均為2 h，實驗完成后處死動物獲取標本。
1.2 方法
1.2.1 樣本及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）獲取和肺組織病理學
實驗完成后，通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉實驗動物，開胸、暴露氣管及肺，用套管針插入左支氣管并固定，拔出針芯后用2 ml生理鹽水灌洗左肺，然后緩慢回抽，如此反復3次，回收率約75%；取出右上肺固定24 h，常規石蠟包埋、切片，行HE染色觀察肺組織病理改變情況。
1.2.2 干濕重比（dry/wetratio）
開胸取肺組織，稱重后置80℃烤箱烘烤48 h，干燥至恒重。肺干濕比=濕重/干重。
1.2.3 肺組織TLR4蛋白的檢測
采用Western蛋白質印跡法，取20 mg冰凍肺組織加入0.5 ml預冷的組織細胞裂解液，勻漿后4 ℃下1 000 r/min離心10 min。采用二辛可寧酸法（BCA法）測定蛋白濃度。每個樣本取40 μg總蛋白進行標準Western步驟。使用一抗稀釋液1 : 1 000稀釋一抗（TLR4抗體，abcam公司），使用1 : 2 000稀釋的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后加入化學發光劑，暗室中曝光、顯影和定影，使用專門的圖像分析儀分析和定量照片。
1.2.4 肺臟組織損傷評分標準
在處死動物后取得的肺病理切片中，對鏡下肺組織的以下5種病理改變進行綜合評估：肺泡腔壁水腫增厚，肺泡內出血，中性粒細胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根據每項有無指標病變，進行評分（0= 無病變，1= 有病變），累加各項評分的總分作為肺病理損傷評分，0分為正常肺組織，5分為損傷最嚴重[10]。
1.2.5 BALF中TNF-α、IL-6和HMGB-1的測定
肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、HMGB-1分別采用相應的試劑盒（索萊寶，北京）進行測定，所有步驟均嚴格按照說明書進行。
1.3 統計學分析
所有數據采用均數±標準差（X±s）的表示。統計數據采用IBM SPSS Statistics 20軟件作方差分析及單因素分析ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組實驗動物BALF中HMGB-1及炎癥因子水平
VILI組BALF中HMGB-1高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組BALF中HMGB-1水平較VILI組降低（P＜0.05）；VILI組BALF中TNF-α、IL-6顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組BALF中HMGB1水平較VILI組顯著降低（P＜0.05），差異均有統計學意義，見圖 1。
圖1
各組實驗動物BALF中HMGB1及炎癥因子表達情況
注：#與對照組比較
2.2 各組實驗動物肺組織TLR4表達情況
VILI組肺組織中TLR4表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組肺組織中TLR4表達水平較VILI組顯著降低（P＜0.05），差異均有統計學意義，見圖 2。
圖2
各組實驗動物肺組織中TLR4表達情況
注：#與對照組比較
2.3 各組實驗動物肺損傷情況比較
VILI組肺干濕重比顯著高于對照組（P＜0.05，圖 3A），VILI+ 烏司他丁組肺干濕重比較VILI組顯著降低（P＜0.05）；VILI組肺病理評分顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組肺病理評分較VILI組顯著降低（P＜0.05，圖 3B）。與對照組（圖 4A）比較，VILI組（圖 4B） 肺組織出現肺泡壁組織水腫、肺間質出血以及中性粒細胞浸潤等典型肺損傷的病理結構改變更大，VILI+ 烏司他丁組（圖 4C）肺組織病理損傷程度較VILI組（圖 4B）出現顯著改善。
圖3
各組實驗動物肺干濕重比及肺病理評分情況
注：#與對照組比較
圖4
各組實驗動物肺病理損傷情況 HE ×200
注：A為對照組；B為VILI組；C為VILI+ulinastatin組
3 討論
既往文獻表明，呼吸機使用不當可以造成肺氣壓傷、容量肺和肺不張等機械性損傷，然后誘發肺炎癥細胞浸潤和炎性因子釋放，引起VILI [11-14]。VILI的中心環節是炎癥反應，參與VILI的主要炎癥因子有TNF-α和IL-6。TNF-α是導致炎性介質級聯反應的始發因子，可促進其他細胞因子的繼發釋放，促進機體產生炎性反應瀑布效應，同時更能直接作用于肺泡上皮細胞，對肺功能及結構產生直接損傷[9-10]。IL-6在感染或外傷引起的急性炎癥反應中誘導急性期反應蛋白的合成，發揮放大炎癥反應程度的作用[9]。本研究結果顯示VILI大鼠模型BALF中TNF-α和IL-6水平升高，肺干/濕重比較對照組顯著升高，肺病理損傷程度明顯比對照組嚴重，說明TNF-α和IL-6參與VILI的形成過程，大潮氣量機械通氣引起了實驗動物肺部嚴重的炎癥反應，繼而導致肺損傷。
HMGB-1是核內一類非組蛋白核蛋白，存在于所有真核細胞中，其序列高度保守。結構上HMGB1由三個區域組成，兩個含正電荷的區域（A盒和B盒）和一個含負電荷的羧基端；功能上，A盒和B盒為DNA結合區，B盒具有細胞因子樣活性，可誘導巨噬細胞分泌其他炎癥因子[15-16]。HMGB-1在組織損傷或者細胞破壞后可釋放入血直接作為炎癥因子參與機體固有免疫應答，激活多形核白細胞、單核巨噬細胞及自然殺傷細胞，促進炎癥的發生和發展[17]。研究發現Toll樣受體4可作為HMGB-1的受體與HMGB-1結合，繼而通過MyD88依賴途徑，最后激活NF-кB，引起炎癥反應[18]。本研究結果也發現VILI組大鼠肺泡灌洗液中HMGB-1、肺組織中TLR4表達水平均較對照組升高，這說明VILI組肺泡灌洗液中升高的炎癥因子可能是由升高的HMGB-1刺激TLR4受體引起的。
烏司他丁是一種廣譜的酶抑制劑，對胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、纖溶酶、激肽釋放酶等具有較強的抑制作用，同時它能穩定線粒體膜，從而抑制多種炎癥細胞因子（包括TNF-α、IL-6）的表達上調[19]。本研究結果顯示烏司他丁可抑制VILI模型BALF中HMGB-1、TNF-α和IL-6的表達以及肺組織中TLR4的表達。從機制上講，破壞的線粒體膜可引起細胞凋亡，進一步導致HMGB-1的釋放增加，烏司他丁可以穩定線粒體膜，從而減少HMGB-1的釋放[20]，并減少HMGB-1通過TLR4途徑引起的下游TNF-α和IL-6水平升高；從另一方面講，烏司他丁本身具有強大的非特異性抗炎作用，可降低機體TNF-α和IL-6的水平[9]，減少炎癥反應對組織的炎性損傷，進一步減少HMGB-1的釋放。因此烏司他丁在VILI中的作用在于打破了“細胞損傷-HMGB-1釋放-炎癥水平升高-細胞損傷”這個惡性循環，從整體上降低了VILI過程中肺的炎癥反應水平，從而發揮保護VILI肺功能和結構的作用。
本研究結果發現HMGB-1可能通過TLR4受體途徑參與VILI引起的炎癥反應和繼發的肺炎性損傷；而烏司他丁可以通過減少HMGB-1通過TLR4途徑引起的肺炎癥因子升高，起到保護肺功能和結構的作用。這為臨床使用烏司他丁治療VILI提供了理論依據和實驗基礎。
機械通氣是臨床重癥監護中最常使用的支持手段之一，隨著機械通氣使用率的增加，其所帶來的并發癥也越來越受到重視。其中機械通氣相關性肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是呼吸機最常見的并發癥之一[1-3]。VILI的發生會導致患者住院時間延長，住院費用提高，甚至增加患者死亡率[4-5]。已有文獻報道，VILI的形成機制之一是由于機械因素導致高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）釋放，從而引起肺炎癥反應和肺損傷[6]。烏司他丁是從人尿液中提取的特異性蛋白酶抑制劑，具有降低炎癥因子的作用[7]。目前臨床已有利用烏司他丁治療VILI取得良好效果的報道[8]，但尚未明確闡釋其可能機制。本研究旨在探討烏司他丁治療VILI的相關機制。
1 材料與方法
1.1 動物分組及模型建立
清潔級健康SD大鼠24只，體重250～300 g，購自四川大學華西實驗動物中心。隨機分成3組：對照組：常規潮氣量（8 ml/kg，呼吸頻率90次/min）；呼吸機肺損傷組（VILI組，20 ml/kg，呼吸頻率50次/min）；烏司他丁組（通氣設置同VILI組，通氣前5min尾靜脈注射烏司他丁50 000 U/kg）[9]。三組動物通氣時長均為2 h，實驗完成后處死動物獲取標本。
1.2 方法
1.2.1 樣本及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）獲取和肺組織病理學
實驗完成后，通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉實驗動物，開胸、暴露氣管及肺，用套管針插入左支氣管并固定，拔出針芯后用2 ml生理鹽水灌洗左肺，然后緩慢回抽，如此反復3次，回收率約75%；取出右上肺固定24 h，常規石蠟包埋、切片，行HE染色觀察肺組織病理改變情況。
1.2.2 干濕重比（dry/wetratio）
開胸取肺組織，稱重后置80℃烤箱烘烤48 h，干燥至恒重。肺干濕比=濕重/干重。
1.2.3 肺組織TLR4蛋白的檢測
采用Western蛋白質印跡法，取20 mg冰凍肺組織加入0.5 ml預冷的組織細胞裂解液，勻漿后4 ℃下1 000 r/min離心10 min。采用二辛可寧酸法（BCA法）測定蛋白濃度。每個樣本取40 μg總蛋白進行標準Western步驟。使用一抗稀釋液1 : 1 000稀釋一抗（TLR4抗體，abcam公司），使用1 : 2 000稀釋的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后加入化學發光劑，暗室中曝光、顯影和定影，使用專門的圖像分析儀分析和定量照片。
1.2.4 肺臟組織損傷評分標準
在處死動物后取得的肺病理切片中，對鏡下肺組織的以下5種病理改變進行綜合評估：肺泡腔壁水腫增厚，肺泡內出血，中性粒細胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根據每項有無指標病變，進行評分（0= 無病變，1= 有病變），累加各項評分的總分作為肺病理損傷評分，0分為正常肺組織，5分為損傷最嚴重[10]。
1.2.5 BALF中TNF-α、IL-6和HMGB-1的測定
肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、HMGB-1分別采用相應的試劑盒（索萊寶，北京）進行測定，所有步驟均嚴格按照說明書進行。
1.3 統計學分析
所有數據采用均數±標準差（X±s）的表示。統計數據采用IBM SPSS Statistics 20軟件作方差分析及單因素分析ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組實驗動物BALF中HMGB-1及炎癥因子水平
VILI組BALF中HMGB-1高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組BALF中HMGB-1水平較VILI組降低（P＜0.05）；VILI組BALF中TNF-α、IL-6顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組BALF中HMGB1水平較VILI組顯著降低（P＜0.05），差異均有統計學意義，見圖 1。
圖1
各組實驗動物BALF中HMGB1及炎癥因子表達情況
注：#與對照組比較
2.2 各組實驗動物肺組織TLR4表達情況
VILI組肺組織中TLR4表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組肺組織中TLR4表達水平較VILI組顯著降低（P＜0.05），差異均有統計學意義，見圖 2。
圖2
各組實驗動物肺組織中TLR4表達情況
注：#與對照組比較
2.3 各組實驗動物肺損傷情況比較
VILI組肺干濕重比顯著高于對照組（P＜0.05，圖 3A），VILI+ 烏司他丁組肺干濕重比較VILI組顯著降低（P＜0.05）；VILI組肺病理評分顯著高于對照組（P＜0.05），VILI+ 烏司他丁組肺病理評分較VILI組顯著降低（P＜0.05，圖 3B）。與對照組（圖 4A）比較，VILI組（圖 4B） 肺組織出現肺泡壁組織水腫、肺間質出血以及中性粒細胞浸潤等典型肺損傷的病理結構改變更大，VILI+ 烏司他丁組（圖 4C）肺組織病理損傷程度較VILI組（圖 4B）出現顯著改善。
圖3
各組實驗動物肺干濕重比及肺病理評分情況
注：#與對照組比較
圖4
各組實驗動物肺病理損傷情況 HE ×200
注：A為對照組；B為VILI組；C為VILI+ulinastatin組
3 討論
既往文獻表明，呼吸機使用不當可以造成肺氣壓傷、容量肺和肺不張等機械性損傷，然后誘發肺炎癥細胞浸潤和炎性因子釋放，引起VILI [11-14]。VILI的中心環節是炎癥反應，參與VILI的主要炎癥因子有TNF-α和IL-6。TNF-α是導致炎性介質級聯反應的始發因子，可促進其他細胞因子的繼發釋放，促進機體產生炎性反應瀑布效應，同時更能直接作用于肺泡上皮細胞，對肺功能及結構產生直接損傷[9-10]。IL-6在感染或外傷引起的急性炎癥反應中誘導急性期反應蛋白的合成，發揮放大炎癥反應程度的作用[9]。本研究結果顯示VILI大鼠模型BALF中TNF-α和IL-6水平升高，肺干/濕重比較對照組顯著升高，肺病理損傷程度明顯比對照組嚴重，說明TNF-α和IL-6參與VILI的形成過程，大潮氣量機械通氣引起了實驗動物肺部嚴重的炎癥反應，繼而導致肺損傷。
HMGB-1是核內一類非組蛋白核蛋白，存在于所有真核細胞中，其序列高度保守。結構上HMGB1由三個區域組成，兩個含正電荷的區域（A盒和B盒）和一個含負電荷的羧基端；功能上，A盒和B盒為DNA結合區，B盒具有細胞因子樣活性，可誘導巨噬細胞分泌其他炎癥因子[15-16]。HMGB-1在組織損傷或者細胞破壞后可釋放入血直接作為炎癥因子參與機體固有免疫應答，激活多形核白細胞、單核巨噬細胞及自然殺傷細胞，促進炎癥的發生和發展[17]。研究發現Toll樣受體4可作為HMGB-1的受體與HMGB-1結合，繼而通過MyD88依賴途徑，最后激活NF-кB，引起炎癥反應[18]。本研究結果也發現VILI組大鼠肺泡灌洗液中HMGB-1、肺組織中TLR4表達水平均較對照組升高，這說明VILI組肺泡灌洗液中升高的炎癥因子可能是由升高的HMGB-1刺激TLR4受體引起的。
烏司他丁是一種廣譜的酶抑制劑，對胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、纖溶酶、激肽釋放酶等具有較強的抑制作用，同時它能穩定線粒體膜，從而抑制多種炎癥細胞因子（包括TNF-α、IL-6）的表達上調[19]。本研究結果顯示烏司他丁可抑制VILI模型BALF中HMGB-1、TNF-α和IL-6的表達以及肺組織中TLR4的表達。從機制上講，破壞的線粒體膜可引起細胞凋亡，進一步導致HMGB-1的釋放增加，烏司他丁可以穩定線粒體膜，從而減少HMGB-1的釋放[20]，并減少HMGB-1通過TLR4途徑引起的下游TNF-α和IL-6水平升高；從另一方面講，烏司他丁本身具有強大的非特異性抗炎作用，可降低機體TNF-α和IL-6的水平[9]，減少炎癥反應對組織的炎性損傷，進一步減少HMGB-1的釋放。因此烏司他丁在VILI中的作用在于打破了“細胞損傷-HMGB-1釋放-炎癥水平升高-細胞損傷”這個惡性循環，從整體上降低了VILI過程中肺的炎癥反應水平，從而發揮保護VILI肺功能和結構的作用。
本研究結果發現HMGB-1可能通過TLR4受體途徑參與VILI引起的炎癥反應和繼發的肺炎性損傷；而烏司他丁可以通過減少HMGB-1通過TLR4途徑引起的肺炎癥因子升高，起到保護肺功能和結構的作用。這為臨床使用烏司他丁治療VILI提供了理論依據和實驗基礎。
