引用本文： 姜大慶, 谷天祥, 徐兆發, 張光偉, 毛乃惠. 心肌細胞外基質對心肌球源性心肌干細胞體外分化、增殖及凋亡影響的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(9): 901-906. doi: 10.7507/1007-4848.20160216 復制
2004年，Messina等[1]報道一種從鼠科動物以及人類心房、心室心肌組織內分離表達c-kit心肌干細胞的新方法[2-3]。3年后，Smith等[4]應用人類和豬的心肌球（CS）獲得了心肌球源性干細胞（CDCs）并證實CDCs能夠改善心肌梗死后心臟功能并促進梗死組織心肌及血管再生。
近來體外研究證實組織特異性的心肌組織源性細胞外基質（ECM）能顯著改善皮膚、肌肉及肝臟細胞的粘附，生長速度及相關表型表達。ECM中玻連蛋白能夠促進干細胞的自我更新和增殖，而纖維連接蛋白（FN）、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白可促進干細胞向不同的細胞分化[5-6]。近來有研究表明向心肌梗死后瘢痕組織內注入心肌源性的ECM能夠顯著增加梗死區域的厚度，緩解梗死擴張及左室的矛盾收縮膨出，提高左心室射血分數（LVEF）[7]。我們由此推測CDCs在心肌組織源性的ECM上會生長得更好，且具有較高的向心肌細胞及血管細胞分化的潛能。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要試劑與儀器
主要試劑包括IMDM培養液、胎牛血清、L-谷氨酸、2-巰基乙醇、胰蛋白酶、不含鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（PBS）、FN、多聚-D-賴氨酸（PDL）、10×MEM，兔抗平滑肌細胞（α-SMA）多克隆抗體，兔抗vWF多克隆抗體，小鼠抗α-SA單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗c-kit多克隆抗體，FITC-標記二抗，PE-標記二抗（SantaCruz公司）。主要儀器包括凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Ⅰ型鼠尾膠原膠（3.75 mg/ml）（碧云天）；T10 basic ULTRA-TURRAX勻漿機（IKA，Wilmington，North Carolina）和FACSCAN流式細胞儀（美國Becton Dickison公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠CDC分離及培養
采用成年Wistar雄性大鼠，體重（170±10）g。參照Messina等的CDC培養法培養[1]。無菌條件下取Wistar大鼠心臟，PBS徹底清洗，將心肌組織剪碎成大約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，采用組織塊酶消化法以CEM培養液（IMDM、 20% FBS、 1 U/ml青鏈霉素，0.2 mM L-谷氨酸，0.1 mM2-巰基乙醇）培養組織塊源性細胞（EDC）。1～2周后當EDCs生長至70%~80%融合時，采集EDCs。將EDC以50 000～100 000/孔的密度移入12孔培養板中加入CGM培養液（35% IMDM/65% DMEM/F-12混合液、3.5% FBS、 1%青霉素-鏈霉素、1%L-谷氨酸、0.1 mM 2-巰基乙醇、1單位/ml凝血酶、2% B-27溶液、80 ng/ml bFGF、
25 ng/ml EGF以及4 ng/ml心肌營養素-1）培養心肌球（CS）。6～7 d后心肌球生成，采集心肌球重新平鋪于FN包被的（TCP組）或ECM包被的（ECM組）培養皿中繼續培養獲得CDC。ECM組常規包被FN后，再過夜包被ECM懸液（1 mg/ml）。每2～3 d更換一次培養液。心肌球平鋪6～7 d后，采集并鑒定CDCs（3代內的CDCs）。
1.2.2 大鼠心肌源性脫細胞ECM的制備
按照Dai等[7]的方案制備大鼠心肌源性ECM。具體方案如下：取雌性Wistar大鼠心臟，組織粉碎機（IKA，Wilmington，North Carolina）將心肌組織做成勻漿懸液，離心去上清。應用DNAse和RNAse去除核酸物質。通過反復離心洗滌最終將得到的ECM置于-80 ℃保存備用。體重200 g左右的大鼠心臟可制備10 mg的ECM。
Ⅰ型鼠尾膠原膠（3.75 mg/ml）3 ml+10×MEM 1 ml+ nuclease free無菌水6 ml，配置成10 ml濃度為1 mg/ml的Ⅰ型鼠尾膠原膠溶液，制備成1 mg/ml的ECM溶液，可用于包被培養皿。用HE染色檢測ECM中是否有細胞成分殘余。
1.2.3 免疫熒光檢測CDC中c-kit表達
胰酶消化采集第2代CDC至24孔培養板，10 000/well，貼壁12 h。應用免疫熒光法鑒定CDC體外培養表達c-kit情況。兔抗大鼠c-kit多克隆抗體，FITC-標記二抗，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.4 CDC體外包被培養皿的增殖分化及凋亡對比（ECM vs FN）
用ECM懸液（ECM組）或FN包被（FN組）適當數目的96孔培養板，用胰酶消化法采集第2代CDC至96孔培養板，5 000/well，同一般培養條件，培養12 h，1 d，3 d，7 d以及14 d。應用MTT法對比兩組CDC體外增殖情況。使用免疫熒光法鑒定兩組CDC表達vWF、α-SA及α-SMA表達率。一抗：兔抗大鼠-vWF，兔抗大鼠-α-SMA，小鼠抗大鼠-心肌細胞；二抗PE標記，熒光顯微鏡下觀察。按照凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行，對比兩組凋亡率（圖 1）。
圖1
實驗流程圖
1.3 統計學分析
實驗所得數據以均值±標準差（
2 結果
2.1 大鼠CDC體外培養形態及c-kit表達鑒定
心肌組織塊平鋪于FN包被的培養皿上3～5 d后，從心肌組織塊中生長出EDC（圖 2A、2B、2C）。EDC平鋪于PDL包被的12孔培養板后5～7 d可生長出一代心肌球（圖 2D、2E），采集一代心肌球平鋪于FN包被的60 mm培養皿后3～5 d生長出CDC（圖 2F、圖 2G）。體外免疫熒光檢測提示心肌球中心部為大量表達c-kit的細胞，心肌球平鋪后的CDC也表達c-kit（圖 2H、2I）。
圖2
大鼠CDC體外培養形態及c-kit表達鑒定
注：A、B、C為小圓亮細胞從成纖維細胞樣細胞床上爬出（EDC）；D、E：CDC平鋪于PDL包被的12孔培養板后2～3 d后可形成一代心肌球；F：第7 d后采集心肌球培養CDC；G：CDCs從平鋪第3 d的心肌球內爬出；H：心肌球平鋪5～6 d后的CDCs生長狀態，傳代第2代；I：用于在體移植前的CDCs在心肌球平鋪第3 d（A）后及第6 d（B）后表達c-kit
2.2 大鼠心肌ECM制備后HE染色
本實驗中所應用心肌源性ECM的制備方法可徹底清除細胞成分，并完整保留了ECM的成分及結構（圖 3）。
圖3
大鼠心肌ECM內無細胞成分殘留，且完整保留了ECM結構
注：A為正常大鼠心臟組織結構（對照）；B為脫細胞化大鼠心肌ECM
2.3 大鼠CDC體外分化、增殖、凋亡對比（ECM vs TCP）
體外熒光鑒定提示ECM包被的培養皿內生長的CDC v-WF，α-SA、α-SMA表達率較常規FN包被的培養皿內生長的CDC的表達率顯著增高（分別為0.060±0.002 vs. 0.043±0.002，P < 0.001；0.082±0.003 vs. 0.051±0.002，P < 0.001；0.055±0.002 vs. 0.034±0.001，P < 0.001）（圖 4 A、4B、4C），且ECM包被的培養皿內生長的CDC具有較高的增殖活力以及較低的凋亡率（0.052±0.002 vs. 0.025±0.001，P < 0.001）（圖 4），差異有統計學意義。
圖4
培養在ECM或常規FN包被的（TCP）培養皿上的CDCs14 d后表達vWF、 α-SA以及α-SMA（A、B、C）
注：D為培養在ECM或常規FN包被的（TCP）培養皿上的CDCs在不同時點（12 h、1 d、3 d、7 d、14 d）的增殖對比，*
3 討論
2004年，Messina等[1]報道了一種從鼠科動物以及人類心房、心室心肌組織內分離心肌干細胞的新方法。首次報告3年后，Smith等[4]應用人類和豬的心肌球（CS）獲得了心肌球源性干細胞（CDCs）并發現CDC為c-kit+。
到目前為止，許多可注入型生物材料，如玻尿酸[8]、纖維蛋白膠[9]、膠原[10]、藻酸鹽[11]、小腸ECM [12]、心包ECM [13]、自組裝肽物質[14]、血小板膠[15]、心室肌ECM [16]，在不同的心肌梗死動物模型中評估了其治療價值，取得了與單獨干細胞移植相似的治療效果。可注入型生物材料能促進位于生物材料微環境中的干細胞向內皮細胞及血管平滑肌及α-SA分化[10, 17-21]。
同組織來源的細胞在其相對應組織來源的ECM上生長最好，即肝臟細胞在肝臟源性的ECM上生長最佳，皮膚細胞在皮膚源性的ECM上生長最佳，肌細胞在肌源性的ECM上生長最佳[22-25]，同理我們推測心肌源性CDC在心肌源性的ECM上生長最好，可能成為修補受損心肌的一個最有應用前景的生物材料。
與以往研究結果類似，本實驗細胞培養法也獲得表達c-kit的CDC細胞（圖 2），脫細胞法所獲得的心肌源性ECM較好地保留了心肌細胞外ECM的結構及成分（圖 3），提示其可為CDC提供更加良好的生長微環境。本次研究也證實了心肌源性ECM能夠促進體外CDC增殖，抑制CDC凋亡及壞死（圖 4），并促進CDC表達α-SA、α-SMA及vWF（圖 4）。依據上述實驗結果，我們有理由將CDC進一步應用于在體研究評價在體攜帶CDC的治療價值，并可以將前述研究的生物材料與心肌源性的ECM體外及體內對CDC分化增殖凋亡影響做對比研究，推測研究結果應提示心肌源性的ECM具有較其他生物材料為優的治療價值。以上結果提示本實驗提取的心肌組織源性ECM可考慮應用于在體攜帶干細胞治療缺血性心肌病或心肌梗死，從而為將來臨床應用心肌組織源性ECM攜帶心肌干細胞治療缺血性心肌病或心肌梗死提供了一定的理論依據。
2004年，Messina等[1]報道一種從鼠科動物以及人類心房、心室心肌組織內分離表達c-kit心肌干細胞的新方法[2-3]。3年后，Smith等[4]應用人類和豬的心肌球（CS）獲得了心肌球源性干細胞（CDCs）并證實CDCs能夠改善心肌梗死后心臟功能并促進梗死組織心肌及血管再生。
近來體外研究證實組織特異性的心肌組織源性細胞外基質（ECM）能顯著改善皮膚、肌肉及肝臟細胞的粘附，生長速度及相關表型表達。ECM中玻連蛋白能夠促進干細胞的自我更新和增殖，而纖維連接蛋白（FN）、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白可促進干細胞向不同的細胞分化[5-6]。近來有研究表明向心肌梗死后瘢痕組織內注入心肌源性的ECM能夠顯著增加梗死區域的厚度，緩解梗死擴張及左室的矛盾收縮膨出，提高左心室射血分數（LVEF）[7]。我們由此推測CDCs在心肌組織源性的ECM上會生長得更好，且具有較高的向心肌細胞及血管細胞分化的潛能。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要試劑與儀器
主要試劑包括IMDM培養液、胎牛血清、L-谷氨酸、2-巰基乙醇、胰蛋白酶、不含鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（PBS）、FN、多聚-D-賴氨酸（PDL）、10×MEM，兔抗平滑肌細胞（α-SMA）多克隆抗體，兔抗vWF多克隆抗體，小鼠抗α-SA單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗c-kit多克隆抗體，FITC-標記二抗，PE-標記二抗（SantaCruz公司）。主要儀器包括凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Ⅰ型鼠尾膠原膠（3.75 mg/ml）（碧云天）；T10 basic ULTRA-TURRAX勻漿機（IKA，Wilmington，North Carolina）和FACSCAN流式細胞儀（美國Becton Dickison公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠CDC分離及培養
采用成年Wistar雄性大鼠，體重（170±10）g。參照Messina等的CDC培養法培養[1]。無菌條件下取Wistar大鼠心臟，PBS徹底清洗，將心肌組織剪碎成大約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，采用組織塊酶消化法以CEM培養液（IMDM、 20% FBS、 1 U/ml青鏈霉素，0.2 mM L-谷氨酸，0.1 mM2-巰基乙醇）培養組織塊源性細胞（EDC）。1～2周后當EDCs生長至70%~80%融合時，采集EDCs。將EDC以50 000～100 000/孔的密度移入12孔培養板中加入CGM培養液（35% IMDM/65% DMEM/F-12混合液、3.5% FBS、 1%青霉素-鏈霉素、1%L-谷氨酸、0.1 mM 2-巰基乙醇、1單位/ml凝血酶、2% B-27溶液、80 ng/ml bFGF、
25 ng/ml EGF以及4 ng/ml心肌營養素-1）培養心肌球（CS）。6～7 d后心肌球生成，采集心肌球重新平鋪于FN包被的（TCP組）或ECM包被的（ECM組）培養皿中繼續培養獲得CDC。ECM組常規包被FN后，再過夜包被ECM懸液（1 mg/ml）。每2～3 d更換一次培養液。心肌球平鋪6～7 d后，采集并鑒定CDCs（3代內的CDCs）。
1.2.2 大鼠心肌源性脫細胞ECM的制備
按照Dai等[7]的方案制備大鼠心肌源性ECM。具體方案如下：取雌性Wistar大鼠心臟，組織粉碎機（IKA，Wilmington，North Carolina）將心肌組織做成勻漿懸液，離心去上清。應用DNAse和RNAse去除核酸物質。通過反復離心洗滌最終將得到的ECM置于-80 ℃保存備用。體重200 g左右的大鼠心臟可制備10 mg的ECM。
Ⅰ型鼠尾膠原膠（3.75 mg/ml）3 ml+10×MEM 1 ml+ nuclease free無菌水6 ml，配置成10 ml濃度為1 mg/ml的Ⅰ型鼠尾膠原膠溶液，制備成1 mg/ml的ECM溶液，可用于包被培養皿。用HE染色檢測ECM中是否有細胞成分殘余。
1.2.3 免疫熒光檢測CDC中c-kit表達
胰酶消化采集第2代CDC至24孔培養板，10 000/well，貼壁12 h。應用免疫熒光法鑒定CDC體外培養表達c-kit情況。兔抗大鼠c-kit多克隆抗體，FITC-標記二抗，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.4 CDC體外包被培養皿的增殖分化及凋亡對比（ECM vs FN）
用ECM懸液（ECM組）或FN包被（FN組）適當數目的96孔培養板，用胰酶消化法采集第2代CDC至96孔培養板，5 000/well，同一般培養條件，培養12 h，1 d，3 d，7 d以及14 d。應用MTT法對比兩組CDC體外增殖情況。使用免疫熒光法鑒定兩組CDC表達vWF、α-SA及α-SMA表達率。一抗：兔抗大鼠-vWF，兔抗大鼠-α-SMA，小鼠抗大鼠-心肌細胞；二抗PE標記，熒光顯微鏡下觀察。按照凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行，對比兩組凋亡率（圖 1）。
圖1
實驗流程圖
1.3 統計學分析
實驗所得數據以均值±標準差（
2 結果
2.1 大鼠CDC體外培養形態及c-kit表達鑒定
心肌組織塊平鋪于FN包被的培養皿上3～5 d后，從心肌組織塊中生長出EDC（圖 2A、2B、2C）。EDC平鋪于PDL包被的12孔培養板后5～7 d可生長出一代心肌球（圖 2D、2E），采集一代心肌球平鋪于FN包被的60 mm培養皿后3～5 d生長出CDC（圖 2F、圖 2G）。體外免疫熒光檢測提示心肌球中心部為大量表達c-kit的細胞，心肌球平鋪后的CDC也表達c-kit（圖 2H、2I）。
圖2
大鼠CDC體外培養形態及c-kit表達鑒定
注：A、B、C為小圓亮細胞從成纖維細胞樣細胞床上爬出（EDC）；D、E：CDC平鋪于PDL包被的12孔培養板后2～3 d后可形成一代心肌球；F：第7 d后采集心肌球培養CDC；G：CDCs從平鋪第3 d的心肌球內爬出；H：心肌球平鋪5～6 d后的CDCs生長狀態，傳代第2代；I：用于在體移植前的CDCs在心肌球平鋪第3 d（A）后及第6 d（B）后表達c-kit
2.2 大鼠心肌ECM制備后HE染色
本實驗中所應用心肌源性ECM的制備方法可徹底清除細胞成分，并完整保留了ECM的成分及結構（圖 3）。
圖3
大鼠心肌ECM內無細胞成分殘留，且完整保留了ECM結構
注：A為正常大鼠心臟組織結構（對照）；B為脫細胞化大鼠心肌ECM
2.3 大鼠CDC體外分化、增殖、凋亡對比（ECM vs TCP）
體外熒光鑒定提示ECM包被的培養皿內生長的CDC v-WF，α-SA、α-SMA表達率較常規FN包被的培養皿內生長的CDC的表達率顯著增高（分別為0.060±0.002 vs. 0.043±0.002，P < 0.001；0.082±0.003 vs. 0.051±0.002，P < 0.001；0.055±0.002 vs. 0.034±0.001，P < 0.001）（圖 4 A、4B、4C），且ECM包被的培養皿內生長的CDC具有較高的增殖活力以及較低的凋亡率（0.052±0.002 vs. 0.025±0.001，P < 0.001）（圖 4），差異有統計學意義。
圖4
培養在ECM或常規FN包被的（TCP）培養皿上的CDCs14 d后表達vWF、 α-SA以及α-SMA（A、B、C）
注：D為培養在ECM或常規FN包被的（TCP）培養皿上的CDCs在不同時點（12 h、1 d、3 d、7 d、14 d）的增殖對比，*
3 討論
2004年，Messina等[1]報道了一種從鼠科動物以及人類心房、心室心肌組織內分離心肌干細胞的新方法。首次報告3年后，Smith等[4]應用人類和豬的心肌球（CS）獲得了心肌球源性干細胞（CDCs）并發現CDC為c-kit+。
到目前為止，許多可注入型生物材料，如玻尿酸[8]、纖維蛋白膠[9]、膠原[10]、藻酸鹽[11]、小腸ECM [12]、心包ECM [13]、自組裝肽物質[14]、血小板膠[15]、心室肌ECM [16]，在不同的心肌梗死動物模型中評估了其治療價值，取得了與單獨干細胞移植相似的治療效果。可注入型生物材料能促進位于生物材料微環境中的干細胞向內皮細胞及血管平滑肌及α-SA分化[10, 17-21]。
同組織來源的細胞在其相對應組織來源的ECM上生長最好，即肝臟細胞在肝臟源性的ECM上生長最佳，皮膚細胞在皮膚源性的ECM上生長最佳，肌細胞在肌源性的ECM上生長最佳[22-25]，同理我們推測心肌源性CDC在心肌源性的ECM上生長最好，可能成為修補受損心肌的一個最有應用前景的生物材料。
與以往研究結果類似，本實驗細胞培養法也獲得表達c-kit的CDC細胞（圖 2），脫細胞法所獲得的心肌源性ECM較好地保留了心肌細胞外ECM的結構及成分（圖 3），提示其可為CDC提供更加良好的生長微環境。本次研究也證實了心肌源性ECM能夠促進體外CDC增殖，抑制CDC凋亡及壞死（圖 4），并促進CDC表達α-SA、α-SMA及vWF（圖 4）。依據上述實驗結果，我們有理由將CDC進一步應用于在體研究評價在體攜帶CDC的治療價值，并可以將前述研究的生物材料與心肌源性的ECM體外及體內對CDC分化增殖凋亡影響做對比研究，推測研究結果應提示心肌源性的ECM具有較其他生物材料為優的治療價值。以上結果提示本實驗提取的心肌組織源性ECM可考慮應用于在體攜帶干細胞治療缺血性心肌病或心肌梗死，從而為將來臨床應用心肌組織源性ECM攜帶心肌干細胞治療缺血性心肌病或心肌梗死提供了一定的理論依據。
