引用本文： 湯銳, 谷天祥, 師恩祎, 王春, 張光偉, 毛乃惠. 丙戊酸對大鼠胸主動脈瘤抑制作用及機制. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(6): 578-584. doi: 10.7507/1007-4848.20150147 復制
胸主動脈瘤發病率10.4人/10萬人/年，其發病病因尚不明確未經治療的胸主動脈瘤體一旦破裂其死亡率高達50%～80%[1-2]。組織學上的典型改變是中膜和外膜彈性蛋白和膠原的缺失平滑肌細胞凋亡，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤及新生血管形成。膠原和彈性蛋白的丟失降解起到非常重要的作用[3]，炎癥介導下的基質金屬蛋白酶類（MMPs）誘導反應[4]，主動脈瘤是一種嚴重的血管外科疾病，其主要病理改變為內皮細胞損傷及剝脫、中膜平滑肌細胞凋亡、細胞外基質的病理性重塑，同時伴有炎性細胞浸潤。大量研究表明，炎性細胞在主動脈瘤形成過程中發揮重要作用[5-6]。我們通過對人動脈瘤組織的研究發現,炎性細胞浸潤程度越重，腹主動脈基質損傷程度越重。研究結果發現，在動脈瘤形成早期，腹主動脈尚未擴張之前，即有炎性因子浸潤。隨著炎性因子浸潤程度的逐漸加重，MMPs的種類增加、活性逐漸增高，彈力纖維和膠原纖維損傷程度、腹主動脈的擴張程度逐漸加重。可見炎性細胞浸潤與膠原纖維和彈力纖維的損傷密切相關。炎性細胞浸潤貫穿于腹主動脈瘤（AAA）形成的全過程，由炎性浸潤增加以及MMPs分泌增多在AAA形成中起關鍵作用。
首先在局部炎癥刺激下，炎性因子浸潤增加，平滑肌細胞可以分泌蛋白酶，如MMPs，導致細胞外基質蛋白：膠原和彈性蛋白破壞，晚期動脈瘤形成中，動物實驗及人體研究表明外部環境的改變，如血管損傷、動脈粥樣硬化等可以導致平滑肌細胞（SMC）發生一系列表型轉換[7]，包括：細胞增殖及轉移能力增強，基因表達形式的改變，比如抑制平滑肌細胞標志基因以及炎癥介導下的MMPs誘導反應[8]。在粥樣硬化患者中，已經發現SM22α、SMα-肌動蛋白、SM-MHC基因被抑制，MMP-2、MMP-3、和MMP-9的高水平表達[8]。所以在動脈瘤形成過程中，炎性細胞扮演著重要角色。
組蛋白去乙酰化酶（HDAC）對很多細胞增殖分化具有調控作用，近年來已成為癌癥、間質纖維化、炎癥性疾病及代謝性疾病研究靶點[9]。在血管平滑肌領域，有研究發現組蛋白乙酰化酶可調控平滑肌細胞的分化[10]和內皮細胞增生[11]。HDAC可以影響細胞周期從而調控平滑肌細胞增殖，文獻報道HDAC在平滑肌細胞由G1到S期有絲分裂過程中表達增加，在血管損傷后的管腔再狹窄中起重要作用[12]。在多個炎癥性疾病動物模型的實驗研究中表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）具有抗炎作用[13]。HDACI除了通過調控組蛋白乙酰化狀態引起炎性細胞因子的表達，還可以通過調控包括轉錄因子在內的非組蛋白乙酰化狀態，抑制或是激活炎性因子的表達，其中最主要的通過對核轉錄因子KB的抑制實現的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
2～4個月成年SD大鼠，體重150～200 g，雌雄不拘。分成3組，每組20只。分別為：生理鹽水C組、外膜浸泡豬胰彈性蛋白酶（PPE）組（P組）和外膜浸泡PPE+腹腔注射丙戊酸（VPA）組（PV組）。
1.2 方法
1.2.1 模型建立
應用2.5%戊巴比妥40 mg/kg腹膜內注射麻醉大鼠，氣管切開后行氣管內插管并固定，連接呼吸機，呼吸頻率90次/分，吸呼比1∶1.5，壓力支持0.01 Mpa。選取胸骨左緣第5肋間開胸，充分顯露胸降主動脈，游離動脈，暴露約1 cm，將已用1.5 U/μl豬胰彈性蛋白酶浸泡好的棉紗覆蓋血管外膜15～20 min，待血管明顯改變及擴張后移除棉紗，肉眼見血管擴張約1.5倍，生理鹽水沖洗胸腔。適當調整呼吸機促進左肺復張后，留置胸腔引流管（20G套管針）以5-0 Prolene滑線逐層縫合關閉胸腔。于胸腔引流管充分排氣及抽取胸腔積液后，可撤除呼吸機，在充分清理呼吸道分泌物后，用6-0 Prolene滑線縫閉氣管及皮膚；見圖 1。
圖1
大鼠主動脈血管比較
注：A為顯露的正常大鼠主動脈血管；B為應用PPE浸泡15 min后的主動脈成瘤血管
1.2.2 成瘤標準
瘤體內徑大于正常血管內徑50%，并分別通過血管超聲檢測術后7 d、14 d、21 d的血管瘤增長情況。并于手術日起連續7 d腹腔注射丙戊酸（200 mg/kg），應用超聲動態檢測并對照；見圖 2、表 1。
表1
大鼠術后血管內徑監測結果（
圖2
大鼠術后在體血管觀察
注：血管超聲監測說明應用PPE浸泡20 min后擴張明顯，并于術后7 d，14 d，21 d分別進行檢測記錄；*表示血管內徑P組、PV組與C組比較，
1.2.3 HE檢測
分別將C組、P組、PV組的大鼠分別在第7 d、14 d、21 d（每組5只，共45只）行超聲檢測后的取材，將取材后主動脈組織放入10%福爾馬林固定，部分主動脈組織直接冰凍。將組織標本分別置于無水乙醇分別浸泡，再將脫水組織放入無水乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡，最后浸泡二甲苯。把組織標本放入融化的石蠟和二甲苯1∶1等量混合液浸泡，再分別移入融化的石蠟液中浸漬。將浸漬后的組織放在裝有蠟液的容器中，迅速放入冷水中冷卻。修整組織蠟塊形狀，置于切片機上，切成5 μm薄片，用毛筆輕托放在紙上。在載玻片上涂上蛋白甘油作為粘附劑，將展平的蠟片鋪在玻片上，將載玻片放入45 ℃溫箱中干燥。將組織分別放入二甲苯液體、無水乙醇浸泡，最后蒸餾水沖洗，蘇木精染色，中性樹膠封片。
1.2.4 免疫組織化學檢測
將取得組織從低濃度酒精逐漸遞升到高濃度酒精進行脫水，浸泡二甲苯并用石蠟包埋后切成5 μm的薄片進行烘干。將制成的切片脫蠟至水后行抗原修復，過氧化氫孵育，再用山羊血清封閉，將一抗IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9及SM22α均用磷酸鹽緩沖液（PBS）1∶100稀釋后浸泡切片，將二抗用PBS稀釋200倍，滴加至完全覆蓋組織浸泡，取出切片后滴加辣根過氧化物酶標記親和素，并將DAB顯色試劑A、B等量混合進行顯色，蘇木素復染，最后再次浸入75%、85%、95%的乙醇中脫水透明后封片，于顯微鏡下觀察。
1.2.5 Western blot檢測
蛋白質抽提。蛋白質定量：標準曲線制備，蛋白質待測液制備，二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）反應，數據讀取，以標準蛋白濃度及對應吸光值繪制標準曲線；聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)：組裝電泳裝置，聚丙烯酰胺凝膠制備，蛋白上樣液制備，SDS-PAGE，轉印，封閉，孵育一抗，孵育二抗，電致化學發光（electrochemiluminescence，ECL）底物發光，抗體剝脫，封閉，孵育內參抗體，孵育二抗，ECL底物發光。
1.3 統計學分析
所有計量資料以均數±標準差（
2 結果
在PPE的作用下，15～20 min后動脈即出現明顯擴張，術后應用血管超聲檢測顯示P組及PV組成瘤率較高，但兩組之間無明顯區別，3周后動脈瘤大小基本穩定，本實驗每組20只大鼠，應用PPE浸泡后的擴張率為100%，其中擴張達到正常血管1.5倍的達到標準的32只，成瘤率為80%，其中因人為因素及浸泡過度使血管破裂導致大鼠死亡3只，術后因為切口感染或其他原因致死5只，死亡率為20%。本實驗結果高于Castigliano等報道的在腹主動脈中成瘤率60%[14]。
術后當天應用血管超聲對大鼠動脈瘤的監測情況。C組血管內徑[（2.05±0.13）mm]無明顯變化，同一時間血管內徑P組[（3.18±0.26）mm]與PV組[（3.16±0.23）mm]較C組明顯擴張。
術后大鼠應用血管超聲經胸分別于術后7 d、14 d、21 d進行檢測并記錄數據，并對成瘤效果行主動脈造影檢查。單因素方差分析結果顯示各組之間差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
免疫組織化學結果與HE染色結果（圖 3～8）基本一致：P組和PV組SM22α高表達，說明SMC增生活躍，動脈瘤組織中IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9高表達（圖 9～13）。PV組的MMP-2、MMP-9表達低于P組（圖 9～13）。這說明VPA可以抑制基質金屬蛋白酶的表達。
圖3
術后14 d染色結果HE×40（注：細胞核呈藍染，細胞質呈紅染，P組和PV組的血管壁明顯厚于C組，細胞增生活躍，細胞外基質表達增加） ? ?圖 4 術后14 d IL-1免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，IL-1陽性呈棕色） ? ?圖 5 術后14 d IL-6免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，IL-6陽性呈棕色） ? ?圖 6 術后MMP-2免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，MMP-2陽性呈棕色） ? ?圖 7 術后MMP-9免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，SM22α陽性呈棕色） ? ?圖 8 術后14 d SM22α免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，MMP-2陽性呈棕色）；A為C組；B為P組；C為PV組
圖4
術后IL-1蛋白定量分析
注：IL-1蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖5
術后IL-6蛋白定量分析
注：IL-6蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖6
術后MMP-2蛋白定量分析
注：MMP-2蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖7
術后MMP-9蛋白定量分析
注：MMP-9蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖8
術后SM22α蛋白定量分析
注：SM22α蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
3 討論
動脈瘤的大體病理改變主要表現為中層變性，彈力層、細胞外基質的破壞以及平滑肌細胞的凋亡[15]。目前已發現的與動脈瘤相關的基因包括FBN1[16]，TGFBR1[17]，SMAD3[18]，ACTA2[19]，MYH11[20]等。Kuivaniemi等發現自身免疫也參與了主動脈瘤的發生發展過程[21]。炎癥反應同樣也是動脈瘤發生發展過程中的一個重要因素，炎癥細胞可以分泌多種炎癥因子，如細胞因子、趨化因子、白三烯、活性氧自由基及免疫球蛋白等。這些炎癥因子可以侵入血管壁及壁內血栓，持續的炎癥反應可打破管壁內蛋白水解平衡，進而加重基質成分的降解。Schonbeck等認為主動脈瘤是一種Th2介導的疾病，主要表現為：Th2相關細胞因子IL-4，IL-5和IL-10的高表達以及Th1相關γ-干擾素的少量表達[22]。但是Xiong [23]和Galle等[24]發現在人體及動物動脈瘤只與Th1相關。Lindeman在對動脈瘤炎癥指紋圖譜進行全面研究之后發現動脈瘤可以被表述為IL-6和IL-8高表達的促炎過程[25]。所以動脈瘤形成是多基因調控多種通道控制的復雜病理過程。
本項研究是首次應用外膜浸泡豬胰彈性蛋白酶的方法制作大鼠胸主動脈瘤模型，形成機理主要是PPE浸泡后血管炎性細胞浸潤，對彈性蛋白層的破壞以及MMPs的高表達。實驗中我們發現經PPE浸泡過的血管，管壁增厚程度、炎癥侵襲程度及平滑肌細胞變異均高于C組。在較小的人體動脈瘤病理檢查中也發現了相似的結果[26]，同時也支持了平滑肌細胞、成纖維細胞參與了動脈瘤自我修復的過程。實驗中的動脈瘤模型均成梭形擴張，與人體動脈瘤形態相似，故在病理及形態學上能夠模擬人體動脈瘤形成過程。
HDAC正在成為腫瘤和其他疾病治療方面的重要靶點[27]，HDACI可以抑制腫瘤細胞的生長，VPA屬于Ⅰ類HDACI，目前對它的研究側重于血液病和癲癇領域，與血管相關的研究側重于血管管腔狹窄及內膜損傷修復，針對動脈瘤方面的研究目前尚無文獻報道。在血管的損傷與修復過程中，巨噬細胞與平滑肌細胞都起著重要作用，巨噬細胞對炎性介質的吞噬及平滑肌細胞的增殖、遷移、分泌等功能，過度增殖及MMPs所致的炎癥反應，可導致血管纖維化[27]，進而喪失血管本來的彈性舒縮功能，容易導致動脈瘤的形成和瘤體破裂。超聲結果提示應用VPA后血管管徑有減小趨勢，說明VPA可以抑制大鼠胸主動脈瘤生長。
組織標本HE染色及免疫組織化學染色結果提示P組和PV組的血管壁明顯厚于C組，細胞增生活躍，細胞外基質表達增加，與人體動脈瘤病理標本類似[28]，通過標本染色我們發現，在修復過程中伴隨著MMP-9、MMP-2的高表達，基質金屬蛋白酶可以破壞細胞外基質，導致血管抵抗張力能力下降。免疫組織化學結果與HE染色結果基本一致：P組和PV組SM22α、IL-1、IL-6高表達，說明炎性細胞及平滑肌細胞增生活躍，同時進一步證實了動脈瘤組織中MMP-2、MMP-9高表達。說明VPA可以抑制基質金屬蛋白酶的表達。
在動脈瘤形成過程中，可導致血管壁產生過度的炎癥反應，基質金屬蛋白酶高表達，細胞外基質破壞加重，進而破壞血管壁的完整性，降低血管壁抵抗張力的能力，所以在高壓狀態下，容易進一步擴張、形成夾層或破裂。
綜上，本研究表明動脈瘤形成早期，IL-1、IL-6表達明顯增加，基質金屬蛋白酶高表達。VPA通過抑制炎癥因子及血管壁內基質金屬蛋白酶的產生，增加細胞外基質合成的方式，抑制大鼠胸主動脈瘤進展。
胸主動脈瘤發病率10.4人/10萬人/年，其發病病因尚不明確未經治療的胸主動脈瘤體一旦破裂其死亡率高達50%～80%[1-2]。組織學上的典型改變是中膜和外膜彈性蛋白和膠原的缺失平滑肌細胞凋亡，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤及新生血管形成。膠原和彈性蛋白的丟失降解起到非常重要的作用[3]，炎癥介導下的基質金屬蛋白酶類（MMPs）誘導反應[4]，主動脈瘤是一種嚴重的血管外科疾病，其主要病理改變為內皮細胞損傷及剝脫、中膜平滑肌細胞凋亡、細胞外基質的病理性重塑，同時伴有炎性細胞浸潤。大量研究表明，炎性細胞在主動脈瘤形成過程中發揮重要作用[5-6]。我們通過對人動脈瘤組織的研究發現,炎性細胞浸潤程度越重，腹主動脈基質損傷程度越重。研究結果發現，在動脈瘤形成早期，腹主動脈尚未擴張之前，即有炎性因子浸潤。隨著炎性因子浸潤程度的逐漸加重，MMPs的種類增加、活性逐漸增高，彈力纖維和膠原纖維損傷程度、腹主動脈的擴張程度逐漸加重。可見炎性細胞浸潤與膠原纖維和彈力纖維的損傷密切相關。炎性細胞浸潤貫穿于腹主動脈瘤（AAA）形成的全過程，由炎性浸潤增加以及MMPs分泌增多在AAA形成中起關鍵作用。
首先在局部炎癥刺激下，炎性因子浸潤增加，平滑肌細胞可以分泌蛋白酶，如MMPs，導致細胞外基質蛋白：膠原和彈性蛋白破壞，晚期動脈瘤形成中，動物實驗及人體研究表明外部環境的改變，如血管損傷、動脈粥樣硬化等可以導致平滑肌細胞（SMC）發生一系列表型轉換[7]，包括：細胞增殖及轉移能力增強，基因表達形式的改變，比如抑制平滑肌細胞標志基因以及炎癥介導下的MMPs誘導反應[8]。在粥樣硬化患者中，已經發現SM22α、SMα-肌動蛋白、SM-MHC基因被抑制，MMP-2、MMP-3、和MMP-9的高水平表達[8]。所以在動脈瘤形成過程中，炎性細胞扮演著重要角色。
組蛋白去乙酰化酶（HDAC）對很多細胞增殖分化具有調控作用，近年來已成為癌癥、間質纖維化、炎癥性疾病及代謝性疾病研究靶點[9]。在血管平滑肌領域，有研究發現組蛋白乙酰化酶可調控平滑肌細胞的分化[10]和內皮細胞增生[11]。HDAC可以影響細胞周期從而調控平滑肌細胞增殖，文獻報道HDAC在平滑肌細胞由G1到S期有絲分裂過程中表達增加，在血管損傷后的管腔再狹窄中起重要作用[12]。在多個炎癥性疾病動物模型的實驗研究中表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）具有抗炎作用[13]。HDACI除了通過調控組蛋白乙酰化狀態引起炎性細胞因子的表達，還可以通過調控包括轉錄因子在內的非組蛋白乙酰化狀態，抑制或是激活炎性因子的表達，其中最主要的通過對核轉錄因子KB的抑制實現的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
2～4個月成年SD大鼠，體重150～200 g，雌雄不拘。分成3組，每組20只。分別為：生理鹽水C組、外膜浸泡豬胰彈性蛋白酶（PPE）組（P組）和外膜浸泡PPE+腹腔注射丙戊酸（VPA）組（PV組）。
1.2 方法
1.2.1 模型建立
應用2.5%戊巴比妥40 mg/kg腹膜內注射麻醉大鼠，氣管切開后行氣管內插管并固定，連接呼吸機，呼吸頻率90次/分，吸呼比1∶1.5，壓力支持0.01 Mpa。選取胸骨左緣第5肋間開胸，充分顯露胸降主動脈，游離動脈，暴露約1 cm，將已用1.5 U/μl豬胰彈性蛋白酶浸泡好的棉紗覆蓋血管外膜15～20 min，待血管明顯改變及擴張后移除棉紗，肉眼見血管擴張約1.5倍，生理鹽水沖洗胸腔。適當調整呼吸機促進左肺復張后，留置胸腔引流管（20G套管針）以5-0 Prolene滑線逐層縫合關閉胸腔。于胸腔引流管充分排氣及抽取胸腔積液后，可撤除呼吸機，在充分清理呼吸道分泌物后，用6-0 Prolene滑線縫閉氣管及皮膚；見圖 1。
圖1
大鼠主動脈血管比較
注：A為顯露的正常大鼠主動脈血管；B為應用PPE浸泡15 min后的主動脈成瘤血管
1.2.2 成瘤標準
瘤體內徑大于正常血管內徑50%，并分別通過血管超聲檢測術后7 d、14 d、21 d的血管瘤增長情況。并于手術日起連續7 d腹腔注射丙戊酸（200 mg/kg），應用超聲動態檢測并對照；見圖 2、表 1。
表1
大鼠術后血管內徑監測結果（
圖2
大鼠術后在體血管觀察
注：血管超聲監測說明應用PPE浸泡20 min后擴張明顯，并于術后7 d，14 d，21 d分別進行檢測記錄；*表示血管內徑P組、PV組與C組比較，
1.2.3 HE檢測
分別將C組、P組、PV組的大鼠分別在第7 d、14 d、21 d（每組5只，共45只）行超聲檢測后的取材，將取材后主動脈組織放入10%福爾馬林固定，部分主動脈組織直接冰凍。將組織標本分別置于無水乙醇分別浸泡，再將脫水組織放入無水乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡，最后浸泡二甲苯。把組織標本放入融化的石蠟和二甲苯1∶1等量混合液浸泡，再分別移入融化的石蠟液中浸漬。將浸漬后的組織放在裝有蠟液的容器中，迅速放入冷水中冷卻。修整組織蠟塊形狀，置于切片機上，切成5 μm薄片，用毛筆輕托放在紙上。在載玻片上涂上蛋白甘油作為粘附劑，將展平的蠟片鋪在玻片上，將載玻片放入45 ℃溫箱中干燥。將組織分別放入二甲苯液體、無水乙醇浸泡，最后蒸餾水沖洗，蘇木精染色，中性樹膠封片。
1.2.4 免疫組織化學檢測
將取得組織從低濃度酒精逐漸遞升到高濃度酒精進行脫水，浸泡二甲苯并用石蠟包埋后切成5 μm的薄片進行烘干。將制成的切片脫蠟至水后行抗原修復，過氧化氫孵育，再用山羊血清封閉，將一抗IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9及SM22α均用磷酸鹽緩沖液（PBS）1∶100稀釋后浸泡切片，將二抗用PBS稀釋200倍，滴加至完全覆蓋組織浸泡，取出切片后滴加辣根過氧化物酶標記親和素，并將DAB顯色試劑A、B等量混合進行顯色，蘇木素復染，最后再次浸入75%、85%、95%的乙醇中脫水透明后封片，于顯微鏡下觀察。
1.2.5 Western blot檢測
蛋白質抽提。蛋白質定量：標準曲線制備，蛋白質待測液制備，二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）反應，數據讀取，以標準蛋白濃度及對應吸光值繪制標準曲線；聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)：組裝電泳裝置，聚丙烯酰胺凝膠制備，蛋白上樣液制備，SDS-PAGE，轉印，封閉，孵育一抗，孵育二抗，電致化學發光（electrochemiluminescence，ECL）底物發光，抗體剝脫，封閉，孵育內參抗體，孵育二抗，ECL底物發光。
1.3 統計學分析
所有計量資料以均數±標準差（
2 結果
在PPE的作用下，15～20 min后動脈即出現明顯擴張，術后應用血管超聲檢測顯示P組及PV組成瘤率較高，但兩組之間無明顯區別，3周后動脈瘤大小基本穩定，本實驗每組20只大鼠，應用PPE浸泡后的擴張率為100%，其中擴張達到正常血管1.5倍的達到標準的32只，成瘤率為80%，其中因人為因素及浸泡過度使血管破裂導致大鼠死亡3只，術后因為切口感染或其他原因致死5只，死亡率為20%。本實驗結果高于Castigliano等報道的在腹主動脈中成瘤率60%[14]。
術后當天應用血管超聲對大鼠動脈瘤的監測情況。C組血管內徑[（2.05±0.13）mm]無明顯變化，同一時間血管內徑P組[（3.18±0.26）mm]與PV組[（3.16±0.23）mm]較C組明顯擴張。
術后大鼠應用血管超聲經胸分別于術后7 d、14 d、21 d進行檢測并記錄數據，并對成瘤效果行主動脈造影檢查。單因素方差分析結果顯示各組之間差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
免疫組織化學結果與HE染色結果（圖 3～8）基本一致：P組和PV組SM22α高表達，說明SMC增生活躍，動脈瘤組織中IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9高表達（圖 9～13）。PV組的MMP-2、MMP-9表達低于P組（圖 9～13）。這說明VPA可以抑制基質金屬蛋白酶的表達。
圖3
術后14 d染色結果HE×40（注：細胞核呈藍染，細胞質呈紅染，P組和PV組的血管壁明顯厚于C組，細胞增生活躍，細胞外基質表達增加） ? ?圖 4 術后14 d IL-1免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，IL-1陽性呈棕色） ? ?圖 5 術后14 d IL-6免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，IL-6陽性呈棕色） ? ?圖 6 術后MMP-2免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，MMP-2陽性呈棕色） ? ?圖 7 術后MMP-9免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，SM22α陽性呈棕色） ? ?圖 8 術后14 d SM22α免疫組織化學染色結果 ×400（注：細胞核呈深藍色，彈力蛋白層呈淺藍色，MMP-2陽性呈棕色）；A為C組；B為P組；C為PV組
圖4
術后IL-1蛋白定量分析
注：IL-1蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖5
術后IL-6蛋白定量分析
注：IL-6蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖6
術后MMP-2蛋白定量分析
注：MMP-2蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖7
術后MMP-9蛋白定量分析
注：MMP-9蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
圖8
術后SM22α蛋白定量分析
注：SM22α蛋白表達量：*表示蛋白表達P組與C組比較，
3 討論
動脈瘤的大體病理改變主要表現為中層變性，彈力層、細胞外基質的破壞以及平滑肌細胞的凋亡[15]。目前已發現的與動脈瘤相關的基因包括FBN1[16]，TGFBR1[17]，SMAD3[18]，ACTA2[19]，MYH11[20]等。Kuivaniemi等發現自身免疫也參與了主動脈瘤的發生發展過程[21]。炎癥反應同樣也是動脈瘤發生發展過程中的一個重要因素，炎癥細胞可以分泌多種炎癥因子，如細胞因子、趨化因子、白三烯、活性氧自由基及免疫球蛋白等。這些炎癥因子可以侵入血管壁及壁內血栓，持續的炎癥反應可打破管壁內蛋白水解平衡，進而加重基質成分的降解。Schonbeck等認為主動脈瘤是一種Th2介導的疾病，主要表現為：Th2相關細胞因子IL-4，IL-5和IL-10的高表達以及Th1相關γ-干擾素的少量表達[22]。但是Xiong [23]和Galle等[24]發現在人體及動物動脈瘤只與Th1相關。Lindeman在對動脈瘤炎癥指紋圖譜進行全面研究之后發現動脈瘤可以被表述為IL-6和IL-8高表達的促炎過程[25]。所以動脈瘤形成是多基因調控多種通道控制的復雜病理過程。
本項研究是首次應用外膜浸泡豬胰彈性蛋白酶的方法制作大鼠胸主動脈瘤模型，形成機理主要是PPE浸泡后血管炎性細胞浸潤，對彈性蛋白層的破壞以及MMPs的高表達。實驗中我們發現經PPE浸泡過的血管，管壁增厚程度、炎癥侵襲程度及平滑肌細胞變異均高于C組。在較小的人體動脈瘤病理檢查中也發現了相似的結果[26]，同時也支持了平滑肌細胞、成纖維細胞參與了動脈瘤自我修復的過程。實驗中的動脈瘤模型均成梭形擴張，與人體動脈瘤形態相似，故在病理及形態學上能夠模擬人體動脈瘤形成過程。
HDAC正在成為腫瘤和其他疾病治療方面的重要靶點[27]，HDACI可以抑制腫瘤細胞的生長，VPA屬于Ⅰ類HDACI，目前對它的研究側重于血液病和癲癇領域，與血管相關的研究側重于血管管腔狹窄及內膜損傷修復，針對動脈瘤方面的研究目前尚無文獻報道。在血管的損傷與修復過程中，巨噬細胞與平滑肌細胞都起著重要作用，巨噬細胞對炎性介質的吞噬及平滑肌細胞的增殖、遷移、分泌等功能，過度增殖及MMPs所致的炎癥反應，可導致血管纖維化[27]，進而喪失血管本來的彈性舒縮功能，容易導致動脈瘤的形成和瘤體破裂。超聲結果提示應用VPA后血管管徑有減小趨勢，說明VPA可以抑制大鼠胸主動脈瘤生長。
組織標本HE染色及免疫組織化學染色結果提示P組和PV組的血管壁明顯厚于C組，細胞增生活躍，細胞外基質表達增加，與人體動脈瘤病理標本類似[28]，通過標本染色我們發現，在修復過程中伴隨著MMP-9、MMP-2的高表達，基質金屬蛋白酶可以破壞細胞外基質，導致血管抵抗張力能力下降。免疫組織化學結果與HE染色結果基本一致：P組和PV組SM22α、IL-1、IL-6高表達，說明炎性細胞及平滑肌細胞增生活躍，同時進一步證實了動脈瘤組織中MMP-2、MMP-9高表達。說明VPA可以抑制基質金屬蛋白酶的表達。
在動脈瘤形成過程中，可導致血管壁產生過度的炎癥反應，基質金屬蛋白酶高表達，細胞外基質破壞加重，進而破壞血管壁的完整性，降低血管壁抵抗張力的能力，所以在高壓狀態下，容易進一步擴張、形成夾層或破裂。
綜上，本研究表明動脈瘤形成早期，IL-1、IL-6表達明顯增加，基質金屬蛋白酶高表達。VPA通過抑制炎癥因子及血管壁內基質金屬蛋白酶的產生，增加細胞外基質合成的方式，抑制大鼠胸主動脈瘤進展。
