引用本文： 蔡武峰, 李箭, 李棋. 促進前交叉韌帶重建術后移植肌腱愈合的生物活性策略研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(10): 1292-1299. doi: 10.7507/1002-1892.202306088 復制
據統計，全球每年有超過40萬人因前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷需要接受治療[1]。研究表明，大多數ACL損傷是由非接觸性運動損傷造成[2]。ACL損傷可破壞膝關節前向穩定性，進而導致半月板損傷、關節退變加速[3]，保守治療通常無效，需要進行修復重建手術等更為積極的策略來恢復韌帶功能，以重建膝關節穩定性[4]。在我國，每年有約10萬人需要通過ACL重建術（ACL reconstruction，ACLR）恢復膝關節運動功能，手術體量僅次于美國，已列居全球第二[5]。目前，尚無研究能夠完全闡明ACLR的最佳時機[6]。
隨著微創技術的發展以及微創理念深入人心，在關節鏡下通過移植肌腱替代撕裂ACL的ACLR成為最主流術式[7]。然而行ACLR需要考慮的因素極為復雜，單束或雙束重建、移植肌腱選擇、移植肌腱固定方式、骨隧道定位等都是長期爭論的焦點[8]。因此，部分研究不再局限于臨床術式或康復手段來促進ACLR術后愈合，轉而進入生物醫學領域深耕以改善術后效果。目前，與ACLR術后移植肌腱愈合相關的生物活性材料主要可歸為以下幾類：生長因子、細胞、可降解植入物/組織衍生物[9]。相關生物材料策略的開發往往更注重于ACLR術后愈合進程關鍵機制的靶點及信號通路調控[10]。
基于此，本文將對促進ACLR術后移植肌腱愈合的生物活性策略及其信號通路和分子機制的相關研究進展作一綜述，以期為提升ACLR療效提供參考。
1 原生ACL形成及ACLR術后愈合
1.1 原生ACL形成的生理進程
大量研究表明，原生ACL主要成分是水，在干燥情況下，超過70%的組成成分為膠原纖維蛋白[11]。低血管性、低神經性、低細胞性是其自我再生能力弱的主要原因[12]。在原生ACL形成過程中，細胞和分子生物學機制發揮著重要作用。研究表明EGF和TGF-β等信號通路可以促進原生ACL的發育[13-14]。EGF通過促進細胞增殖和分化促進ACL形成；而TGF-β則可以促進肌腱細胞的增殖和分化，從而進一步促進ACL的發育。此外，其他信號通路如Wnt和BMP等也與ACL的發育相關[15]。
另一個影響原生ACL形成的因素是基因表達調節。在原生ACL發育過程中，基因調節對于維持組織結構和機能至關重要。如Sox9通過調節膠原蛋白和蛋白聚糖等基質成分的合成和分解，影響ACL的結構和機能[16]。具體來說，Sox9能夠激活基質合成相關基因的表達，如Ⅰ型膠原、Ⅻ型膠原、ⅩⅢ 型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白和凝血酶原等[17]。另外，Sox9還能抑制基質降解相關基因的表達，如基質金屬蛋白酶13和ADAMTS-5等[18]。這些調節作用能夠促進原生ACL細胞增殖和分化，同時維持基質的穩定性和機能。
除了信號通路和基因調節，細胞增殖和分化也對原生ACL的形成起著關鍵作用。在原生ACL的發育過程中，成纖維細胞和干細胞可以分化為肌腱細胞，從而促進原生ACL的形成[19]。此外，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在原生ACL形成中也起著重要作用。一些研究表明，ECM的剛度和構成也與原生ACL的發育和損傷有關[20]。
1.2 ACLR術后移植肌腱愈合的生理進程
研究表明，ACL的愈合過程和ACL發育之間存在密切關系[21-22]。ACLR術后移植肌腱的愈合過程主要包括炎癥反應、細胞增殖和分化、基質合成和重塑等階段[23]。組織內炎癥細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等被激活，開始進行增殖、分化和遷移，形成新的基質組織[17]。這一過程與ACL發育時的細胞增殖、分化和基質合成過程有相似之處，表明ACLR術后移植肌腱的愈合過程是在ACL發育過程的基礎上進行的。此外，愈合過程中的細胞和基質合成過程與ACL發育時的細胞和基質合成過程也有一定關聯。例如，愈合過程中的成纖維細胞和軟骨細胞能夠合成和分泌膠原蛋白、蛋白聚糖等ACL組織的主要成分，這些成分在ACL發育過程中也同樣由ACL細胞合成和分泌[24]。因此，愈合過程中的細胞和基質合成過程可以看作是ACL發育過程的一種延續和補充。
需要注意的是，移植肌腱愈合過程和ACL發育過程并非完全相同，某些方面存在的差異可能造成ACLR術后愈合不良。首先，移植肌腱中的細胞類型（如脂肪細胞、骨細胞等）和基質成分可能與原生ACL組織存在差異，對移植肌腱的基質合成和愈合過程可能產生一定影響[25–27]。其次，ACLR術后移植肌腱需要與ACL殘端愈合，并在ACL殘端附近采用錨釘或其他方式固定，這些固定方式可能會對移植肌腱和ACL殘端之間的力學特性產生影響[28]。例如，在移植肌腱和ACL殘端之間形成的結合界面可能存在不連續和不規則結構，這些結構可能會影響移植肌腱和ACL殘端之間的力學傳遞及負荷分配[29]。再者，移植肌腱和原生ACL組織之間的愈合過程可能存在一些特殊的調節機制和信號通路。例如，ACLR術后移植肌腱和ACL殘端之間的愈合過程也可能受到炎癥反應的影響[30]，炎癥反應通過激活炎癥細胞、介導細胞因子、調節基質合成等方式促進愈合過程，但過度的炎癥反應也可能導致組織損傷和瘢痕形成[31]。
2 生長因子促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
有望應用于ACLR的生長因子種類繁多，如BMP、EGF、TGF-β、VEGF、粒細胞集落刺激因子、bFGF、肝細胞生長因子、護骨素、富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）、血小板衍生生長因子BB（platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB）、Runt相關轉錄因子2、纖維蛋白凝塊以及自體條件性血清等[9，32-33]。生長因子對于愈合過程中的細胞募集、增殖、分化以及ECM合成至關重要。然而，生長因子需要合適載體才能發揮更好作用。
一般來說，不同生長因子之間的功能、靶點、最佳作用時機并不相同。研究表明[34]，多種生長因子遞送相較單一生長因子遞送能夠產生更佳修復效果。此外，生長因子的調控需要一定時間持續有效的刺激。故而構建生長因子促進ACLR術后愈合的策略需要考慮到生長因子的組合形式、遞送載體、釋放體系等。在這種情況下，生長因子常與水凝膠、纖維蛋白膠、納米顆粒、納米纖維等組合成體系的形式進行作用，以適應組織再生所需要的地形線索。Phillips等[35]將表達Runt相關轉錄因子2的逆轉錄病毒載體偶聯到膠原支架上，與成纖維細胞共培養并成功上調其成骨基因表達。Madhurakkat Perikamana等[36]通過聚多巴胺將PDGF-BB以化學鍵和的形式結合到納米纖維上，誘導脂肪來源干細胞成肌腱分化，從而實現移植肌腱-骨組織復雜界面的仿生。Wang等[37]通過制備高分子聚合物支架并在其上接枝生長轉化因子7（growth and differentiation factor 7，GDF-7）實現持續誘導組織再生，促進肩袖組織再生。
因此，研究者需依據組織再生所需的地形線索進行合理設計，盡可能實現多種生長因子有合理的空間分布，這對于組織再生尤其是復雜界面再生至關重要。Chen等[38]通過膠原蛋白結合肽結合BMP-2、TGF-β3或GDF-7，并將其特異性地接枝至“書形”脫細胞附著點基質，從而制備具有地形線索的仿生支架。Zhu等[39]將TGF-β、IGF-1、甲狀旁腺激素進行整合，從而制備具有礦化及抗炎效應的生長因子新體系。
為了實現生長因子在ACLR中的有效遞送，需要考慮到生長因子的穩定性、釋放動力學、劑量效應、協同作用等因素。一種常用方法是將生長因子與載體材料結合，形成復合支架或凝膠，以保護生長因子免受降解，延緩其釋放速率，增加局部濃度，提高生物活性。載體材料可以是天然或合成的高分子材料，也可以是無機或金屬材料，甚至可以是細胞或基因載體。載體材料應具有良好的生物相容性、力學性能、降解性能、孔隙結構等特性，以適應ACLR的需求[40]。目前已有許多研究報道了不同類型載體材料與生長因子組合的應用。Lyu等[41]報道了一種利用微流控芯片產生生長因子梯度的方法，將BMP-2和TGF-β分別包裹在聚乳酸和明膠微球中，然后與去細胞化肌腱支架復合形成三層結構，用于肌腱-骨界面的愈合。該方法能夠引導BMSCs和肌腱干細胞在不同區域分化為骨細胞、軟骨細胞和肌腱細胞，并重建移植肌腱-骨組織的梯度結構。
除了生長因子與載體材料的組合外，還有一些其他策略也被用于ACLR中。基因治療是一種利用基因載體將生長因子的基因轉染到目標細胞或組織中，從而實現持續和高效生長因子表達的方法。基因治療可以避免生長因子外源性遞送帶來的不穩定性、高成本、劑量控制等問題，同時也可以利用細胞自身調控機制，實現生長因子的時空特異性表達[42]。Murray 等[43]將BMP-2的逆轉錄病毒載體注射到ACL切斷處，并使用橋接增強支架填充切口，從而實現了ACL自身修復，并在體內實驗中表現出與ACLR相當的效果。
綜上，生長因子是一類能夠刺激細胞增殖、分化和遷移的蛋白質，對于組織修復和再生有重要作用。ACLR中應用生長因子可以促進移植物與骨隧道早期愈合，加快新生血管形成，提高移植物抗張強度和剛度，減少移植物萎縮和退化；還可改善關節軟骨、半月板和滑膜修復，抑制炎癥反應，延緩或防止術后退行性關節炎發生。但生長因子通常具有較低穩定性和較短半衰期，容易受到環境因素和蛋白酶影響而失活或降解；且生長因子往往難以有效到達目標細胞或組織，導致使用劑量大但生物利用度低。
3 細胞促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
近年來，隨著對干細胞研究的深入，大量研究表明干細胞的自我更新及多向分化潛能可應用于組織再生，并顯示出廣闊應用前景。目前已報道的應用于ACLR的干細胞有BMSCs、滑膜來源MSCs（synovial MSCs，SMSTs）及ACL來源MSCs（ACL MSCs，AMSCs）[44]。
3.1 BMSCs
BMSCs作為多能MSCs，在其增殖過程中具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞的潛力。BMSCs可以通過旁分泌作用促進移植肌腱血管化、成熟和功能恢復。Yu等[45]通過BMSCs來源外泌體（BMSCs-exosomes，BMSCs-exos）的旁分泌信號傳導作用促進肌腱干/祖細胞的增殖和遷移。BMSCs還可以通過直接分化作用參與移植肌腱的重建和修復，增加其力學強度和彈性[46]。Lim等[47]的研究顯示，與空白腘繩肌腱相比，通過BMSCs修飾腘繩肌腱行ACLR在止點處顯示出更為成熟的纖維軟骨分化。此外有研究表明，BMSCs可以通過免疫調節作用抑制炎癥反應和免疫排斥反應，減少移植肌腱的退化和壞死。Shi等48]的研究顯示BMSCs-exos可以通過增加移植肌腱-骨組織愈合過程中M2型巨噬細胞極化來促進纖維軟骨形成，從而改善生物力學性能。單純BMSCs的潛力似乎存在局限性，而使用基因轉染技術有望增強BMSCs分化能力和骨再生能力。Dong等[49]通過載荷BMP-2慢病毒轉染BMSCs，從而提升了移植肌腱-骨組織結合處的骨整合能力，進而提升手術療效。Li等[50]通過PDGF-BB轉染BMSCs，加速移植肌腱重塑，促進血管生成和膠原沉積，進而提升ACLR療效。
3.2 SMSTs
SMSTs可能來自骨髓、血液、滑膜細胞、血管周細胞或胚胎關節間區等不同組織。在ACLR相關研究中，Ju等[51]在大鼠模型上使用骨-髕骨-骨肌腱重建ACL，將SMSTs植入移植肌腱和骨隧道的界面處，結果顯示SMSTs能夠加速移植肌腱-骨組織界面的早期重塑，表明SMSTs可能通過分化為成纖維細胞和分泌促進膠原纖維合成的細胞因子來促進移植肌腱-骨組織愈合。
盡管SMSTs顯示出優異的應用潛能，但不同來源的SMSTs功能特征差異較大。Mochizuki等[52]的研究表明與來自皮下脂肪的SMSTs相比，來自纖維滑膜和脂肪滑膜的SMSTs表達更高水平的STRO-1（MSCs蛋白質標志物的基因）和CD106，而CD10水平較低。Mizuno等[53]將滑膜分為3個區域，并比較了從3個區域分離的SMSTs在增殖、表面標記物表達、軟骨分化、鈣化和脂肪分化方面的差異，發現外周血管區域的SMSTs具有最高增殖和軟骨分化潛能，而表面和基質區域的SMSTs則具有相似但較低的潛能。目前尚無研究報道SMSTs的細胞特異表面標志物或轉錄因子，以區分不同來源SMSTs之間的分化潛能，距SMSTs臨床應用仍有較大突破空間。
3.3 AMSCs
AMSCs來源于ACL并具有促進移植肌腱修復和再生的能力。Steinert等[54]發現從損傷ACL中遷移的細胞具有MSCs的特征，能夠分化為多種組織細胞，并且在體外能夠形成類似韌帶的結構；此外還發現ACL中本身就存在大量MSCs，它們可能參與韌帶的生理功能和修復過程。Matsumoto等[55]的研究表明，ACL中存在CD34和CD146表達陽性血管細胞，它們具有多向分化潛能，并且在ACL損傷后被招募到斷裂部位參與ACL的自身修復。然而部分研究顯示，AMSCs的愈合潛力可能與患者年齡及傷后時間相關。Nakano等[56]的研究將不與年齡患者的ACL來源CD39+ 細胞注入大鼠ACLR模型中，發現年輕患者來源的細胞具有更佳骨整合能力。而Inokuchi等[57]的研究表明，從受傷時間>3個月及<3個月的患者分別收集ACL衍生的CD34+干細胞，發現受傷時間<3個月患者ACL衍生的CD34+ 干細胞具有更高的肌腱-骨愈合潛力。此外，同BMSCs相關研究相似，部分研究對AMSCs進行修飾以拓展其促進組織再生能力。Kawakami等[58]通過BMP-2轉染AMSCs后，以細胞片形式應用于大鼠ACLR，能加速及改善移植肌腱成熟及骨整合。
3.4 小結
干細胞具有自我更新和多向分化能力，并且來源廣泛，獲取方式相對簡單和安全，在組織再生領域具有廣闊應用前景。通過旁分泌作用、直接分化作用和免疫調節作用等作用機制，干細胞能夠增強移植肌腱的血管化、成熟和功能恢復。通過基因轉染技術或與其他生物材料的結合等，能進一步提高干細胞分化能力和再生能力，是促進ACLR療效的潛在優勢對象。
4 可降解植入物促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
近年來，界面組織工程技術飛速發展，其深入探究了軟組織重建修復機制，為借助先進生物材料打造仿生支架模擬原生組織結構再生所需微環境，最終實現原位再生類似天然組織結構并獲得相應生物學特性提供了可能[59]。選擇安全可靠、具有一定機械強度的材料打造基底支架，并對其進行修飾，利用不同生物材料的特性，在不同層次調控移植肌腱與骨隧道之間的梯度分化以及移植肌腱中央實質部的韌帶化，是構建積極影響ACLR遠期療效的潛在有效手段。理想的可應用于支架構建的生物活性材料應滿足生物力學及生物相容性相應要求。膠原、絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）］、聚（脫氨基酪氨酰酪氨酸十二烷基酯）［poly（desaminotyrosyl-tyrosine dodecyl dodecanedioate），P（DTD DD）］、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、 聚二氧嘧啶酮（polydioxanone，PDS）、聚左乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）等材料相繼被研究報道[56，60]。
由于原生ACL基質的主要成分是Ⅰ型膠原[61]，多種膠原基質物被嘗試用于支架構建。膠原支架的力學性能不及原生組織，并且隨時間推移其力學強度明顯下降[62]。故交聯劑如甲醛、羧二亞胺等被相繼開發用于延緩支架降解，但交聯劑可能存在生理毒性[63]。基于此，膠原-血小板復合材料、雙相膠原復合材料、膠原蛋白-絲素蛋白復合材料等被開發，在保有膠原支架原有特性的同時，進一步提升支架的生物力學性能[64-66]。
另一種天然聚合物絲素蛋白[67]可從家蠶絲獲取；家蠶絲主要由絲素蛋白及絲膠組成，其表面的絲膠會引起機體免疫反應，需通過加工去除[68]。絲素蛋白在保持天然聚合物優異的生物相容性和降解性能同時，還擁有優秀的機械性能[69]。然而其細胞募集性能較差。基于此，最常見的改性策略是通過化學改性方式調整絲素蛋白的物理化學性質或者引入活性基團，從而產生新的材料性能[70]。具體而言，可以利用點擊化學[71]、雙酪氨酸交聯[72]、超分子交聯[73]等方法，對絲素蛋白的羥基、羧基、氨基和硫醇基等不同官能團進行修飾[68]。在生物材料與組織工程領域，除了上述改性策略，還可通過增材定制方式制備具有復雜結構的支架，滿足組織的特異性需求[74-75]。也有研究通過對蠶絲改性，實現藥物可控的輸出及釋放[73]。上述方案在賦能蠶絲以更優生物學性能同時，為復雜界面組織工程支架的構建提供了靈感及廣泛的備選基礎。
合成材料方面，PLGA、P（DTD DD）、PGA、PDS、PLLA等材料被相繼開發并應用于骨骼、肌腱及韌帶組織工程。這些材料都具有優異的機械性能、生物可降解性、易于加工，但通常降解產物呈酸性，容易引發炎癥反應，需要進一步加工修飾改善性能[76]。
鑒于移植肌腱到骨組織的分級組成和結構，研究者通常傾向于通過雙相/多相支架、梯度礦化支架的形式來構建復雜分層界面，使得界面異型細胞群和基質的階段特異性變化成為可能，并表現出分級的機械性能。Sun等[77]制備了PLGA-聚已內酯的共靜電紡雙納米支架，還將膠原蛋白和納米羥基磷灰石分別摻入其中，以提高生物相容性。Kim等[78]開發了一種具有不同成分的4層膠原蛋白支架，包括肌腱層（膠原蛋白）、纖維軟骨層（膠原蛋白和硫酸軟骨素）、礦化纖維軟骨層（膠原蛋白和低度礦化透明質酸）和骨層（膠原蛋白和高度礦化透明質酸）；Lausch等[79]使用in-well礦化系統制造了多相膠原支架，以提升移植肌腱-骨組織愈合；Chen等[80]通過靜電紡絲裝置制備了納米纖維絲膜，然后將絲膜垂直放置在10×模擬體液中，從底部產生空間層面從下到上的礦化梯度，成功制造了梯度礦化電紡絲附著點支架。
綜上，可降解植入物可以提供額外的穩定性，保護移植肌腱，促進其愈合和成熟，是促進ACLR術后移植肌腱愈合的重要策略。可降解植入物能夠以模擬原生ACL復雜界面的結構、基質等形式或者載藥遞送生物活性物質的形式增加生物誘導性，促進細胞遷移、增殖和分化，抑制炎癥反應和纖維化等。盡管制備技術不斷進步，能夠有效模仿原生ACL微環境，但目前大多數研究仍停留于微觀尺度的模仿，在納米尺度上的突破仍存在巨大挑戰。
5 應用于ACLR的動物實驗模型和臨床初步嘗試
動物模型是臨床前研究的最主要研究對象，旨在證明生物材料進入臨床試驗前的可行性、安全性和有效性。通常小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、豬等均可用于建立ACLR模型。其中，小鼠、大鼠因成本較低和易獲取性受到研究者青睞，廣泛應用于ACLR愈合相關機制通路的探索。兔在生物材料研究中的應用也較為廣泛，然而有研究表明，兔膝關節功能位呈屈曲位，與大型動物特別是人體存在差別[81]。山羊和豬是更為優勢的動物模型[82]，一般需要扎實的前期研究基礎。
然而，動物模型往往只能模擬人ACLR的病理變化、生物力學特性或功能恢復等部分方面，不能全面反映人ACLR的復雜性和多樣性，且往往缺乏標準化的建立方法、評價指標和實驗設計，導致不同研究之間難以比較和整合。再者，動物模型往往受到種間差異、個體差異、實驗條件和技術水平等因素的影響，導致實驗結果難以推廣到人體研究。
盡管如此，部分研究已經開始嘗試將生物材料應用于人體研究中，并取得了一定進展。Alentorn-Geli等[83]的研究嘗試了脂肪源再生干細胞（adipose-derived regenerative cells，ADRCs）在ACLR的應用，并表明其有可能促進組織再生以改善移植肌腱愈合過程，然而并未發現與未接受ADRCs治療的患者在臨床結果方面存在顯著差異。Jang等[44]則嘗試通過同種異體人臍帶血來源MSCs改善組織再生，但需要進一步研究來驗證其有效性。Yang等[84]一項關于PRP應用于ACLR的回顧性研究表明，PRP能及早改善膝關節功能；然而Gong等[85]的研究則表明PRP對減少骨隧道增寬或改善膝關節功能并無顯著作用。Mutsuzaki等[86]通過鈣磷雜化肌腱移植物增強移植物與骨隧道的整合來促進ACLR術后移植肌腱愈合。Wang等[87]通過體外沖擊波治療刺激血流和細胞增殖來促進ACLR術后移植肌腱愈合，結果顯示該方法減少了骨隧道擴大，但需要進一步研究確定其有效性。
6 總結及展望
關節鏡下ACLR術后效果不佳，部分患者存在需要翻修的問題。臨床上報道了多種改良術式，但因證據質量良莠不齊、臨床試驗方案設計差異性大、不同人種之間存在解剖變異等，目前尚無公認的最佳臨床術式。近年來，隨著對ACL微觀結構的進一步了解以及生物醫學領域相關技術的突飛猛進，大量研究旨在通過組織工程技術促進ACLR術后療效。盡管部分研究已顯著提升了療效，然而大部分研究仍局限于早期動物實驗階段，離真正臨床推廣應用仍有較遠距離。此外，受限于當下制備技術，對界面的仿生仍多停留于微米、毫米級，并且偏向于形態學仿生，在信號機制通路上的研究依舊不足。未來隨著ACL解剖學、發育學相關報道的深入以及制備技術的改進，該領域在促進ACLR方面有望得到進一步提升。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和報道
作者貢獻聲明 蔡武峰：文獻檢索，原文撰寫；李棋：文章撰寫，質量控制；李箭：文章撰寫及審校
據統計，全球每年有超過40萬人因前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷需要接受治療[1]。研究表明，大多數ACL損傷是由非接觸性運動損傷造成[2]。ACL損傷可破壞膝關節前向穩定性，進而導致半月板損傷、關節退變加速[3]，保守治療通常無效，需要進行修復重建手術等更為積極的策略來恢復韌帶功能，以重建膝關節穩定性[4]。在我國，每年有約10萬人需要通過ACL重建術（ACL reconstruction，ACLR）恢復膝關節運動功能，手術體量僅次于美國，已列居全球第二[5]。目前，尚無研究能夠完全闡明ACLR的最佳時機[6]。
隨著微創技術的發展以及微創理念深入人心，在關節鏡下通過移植肌腱替代撕裂ACL的ACLR成為最主流術式[7]。然而行ACLR需要考慮的因素極為復雜，單束或雙束重建、移植肌腱選擇、移植肌腱固定方式、骨隧道定位等都是長期爭論的焦點[8]。因此，部分研究不再局限于臨床術式或康復手段來促進ACLR術后愈合，轉而進入生物醫學領域深耕以改善術后效果。目前，與ACLR術后移植肌腱愈合相關的生物活性材料主要可歸為以下幾類：生長因子、細胞、可降解植入物/組織衍生物[9]。相關生物材料策略的開發往往更注重于ACLR術后愈合進程關鍵機制的靶點及信號通路調控[10]。
基于此，本文將對促進ACLR術后移植肌腱愈合的生物活性策略及其信號通路和分子機制的相關研究進展作一綜述，以期為提升ACLR療效提供參考。
1 原生ACL形成及ACLR術后愈合
1.1 原生ACL形成的生理進程
大量研究表明，原生ACL主要成分是水，在干燥情況下，超過70%的組成成分為膠原纖維蛋白[11]。低血管性、低神經性、低細胞性是其自我再生能力弱的主要原因[12]。在原生ACL形成過程中，細胞和分子生物學機制發揮著重要作用。研究表明EGF和TGF-β等信號通路可以促進原生ACL的發育[13-14]。EGF通過促進細胞增殖和分化促進ACL形成；而TGF-β則可以促進肌腱細胞的增殖和分化，從而進一步促進ACL的發育。此外，其他信號通路如Wnt和BMP等也與ACL的發育相關[15]。
另一個影響原生ACL形成的因素是基因表達調節。在原生ACL發育過程中，基因調節對于維持組織結構和機能至關重要。如Sox9通過調節膠原蛋白和蛋白聚糖等基質成分的合成和分解，影響ACL的結構和機能[16]。具體來說，Sox9能夠激活基質合成相關基因的表達，如Ⅰ型膠原、Ⅻ型膠原、ⅩⅢ 型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白和凝血酶原等[17]。另外，Sox9還能抑制基質降解相關基因的表達，如基質金屬蛋白酶13和ADAMTS-5等[18]。這些調節作用能夠促進原生ACL細胞增殖和分化，同時維持基質的穩定性和機能。
除了信號通路和基因調節，細胞增殖和分化也對原生ACL的形成起著關鍵作用。在原生ACL的發育過程中，成纖維細胞和干細胞可以分化為肌腱細胞，從而促進原生ACL的形成[19]。此外，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在原生ACL形成中也起著重要作用。一些研究表明，ECM的剛度和構成也與原生ACL的發育和損傷有關[20]。
1.2 ACLR術后移植肌腱愈合的生理進程
研究表明，ACL的愈合過程和ACL發育之間存在密切關系[21-22]。ACLR術后移植肌腱的愈合過程主要包括炎癥反應、細胞增殖和分化、基質合成和重塑等階段[23]。組織內炎癥細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等被激活，開始進行增殖、分化和遷移，形成新的基質組織[17]。這一過程與ACL發育時的細胞增殖、分化和基質合成過程有相似之處，表明ACLR術后移植肌腱的愈合過程是在ACL發育過程的基礎上進行的。此外，愈合過程中的細胞和基質合成過程與ACL發育時的細胞和基質合成過程也有一定關聯。例如，愈合過程中的成纖維細胞和軟骨細胞能夠合成和分泌膠原蛋白、蛋白聚糖等ACL組織的主要成分，這些成分在ACL發育過程中也同樣由ACL細胞合成和分泌[24]。因此，愈合過程中的細胞和基質合成過程可以看作是ACL發育過程的一種延續和補充。
需要注意的是，移植肌腱愈合過程和ACL發育過程并非完全相同，某些方面存在的差異可能造成ACLR術后愈合不良。首先，移植肌腱中的細胞類型（如脂肪細胞、骨細胞等）和基質成分可能與原生ACL組織存在差異，對移植肌腱的基質合成和愈合過程可能產生一定影響[25–27]。其次，ACLR術后移植肌腱需要與ACL殘端愈合，并在ACL殘端附近采用錨釘或其他方式固定，這些固定方式可能會對移植肌腱和ACL殘端之間的力學特性產生影響[28]。例如，在移植肌腱和ACL殘端之間形成的結合界面可能存在不連續和不規則結構，這些結構可能會影響移植肌腱和ACL殘端之間的力學傳遞及負荷分配[29]。再者，移植肌腱和原生ACL組織之間的愈合過程可能存在一些特殊的調節機制和信號通路。例如，ACLR術后移植肌腱和ACL殘端之間的愈合過程也可能受到炎癥反應的影響[30]，炎癥反應通過激活炎癥細胞、介導細胞因子、調節基質合成等方式促進愈合過程，但過度的炎癥反應也可能導致組織損傷和瘢痕形成[31]。
2 生長因子促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
有望應用于ACLR的生長因子種類繁多，如BMP、EGF、TGF-β、VEGF、粒細胞集落刺激因子、bFGF、肝細胞生長因子、護骨素、富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）、血小板衍生生長因子BB（platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB）、Runt相關轉錄因子2、纖維蛋白凝塊以及自體條件性血清等[9，32-33]。生長因子對于愈合過程中的細胞募集、增殖、分化以及ECM合成至關重要。然而，生長因子需要合適載體才能發揮更好作用。
一般來說，不同生長因子之間的功能、靶點、最佳作用時機并不相同。研究表明[34]，多種生長因子遞送相較單一生長因子遞送能夠產生更佳修復效果。此外，生長因子的調控需要一定時間持續有效的刺激。故而構建生長因子促進ACLR術后愈合的策略需要考慮到生長因子的組合形式、遞送載體、釋放體系等。在這種情況下，生長因子常與水凝膠、纖維蛋白膠、納米顆粒、納米纖維等組合成體系的形式進行作用，以適應組織再生所需要的地形線索。Phillips等[35]將表達Runt相關轉錄因子2的逆轉錄病毒載體偶聯到膠原支架上，與成纖維細胞共培養并成功上調其成骨基因表達。Madhurakkat Perikamana等[36]通過聚多巴胺將PDGF-BB以化學鍵和的形式結合到納米纖維上，誘導脂肪來源干細胞成肌腱分化，從而實現移植肌腱-骨組織復雜界面的仿生。Wang等[37]通過制備高分子聚合物支架并在其上接枝生長轉化因子7（growth and differentiation factor 7，GDF-7）實現持續誘導組織再生，促進肩袖組織再生。
因此，研究者需依據組織再生所需的地形線索進行合理設計，盡可能實現多種生長因子有合理的空間分布，這對于組織再生尤其是復雜界面再生至關重要。Chen等[38]通過膠原蛋白結合肽結合BMP-2、TGF-β3或GDF-7，并將其特異性地接枝至“書形”脫細胞附著點基質，從而制備具有地形線索的仿生支架。Zhu等[39]將TGF-β、IGF-1、甲狀旁腺激素進行整合，從而制備具有礦化及抗炎效應的生長因子新體系。
為了實現生長因子在ACLR中的有效遞送，需要考慮到生長因子的穩定性、釋放動力學、劑量效應、協同作用等因素。一種常用方法是將生長因子與載體材料結合，形成復合支架或凝膠，以保護生長因子免受降解，延緩其釋放速率，增加局部濃度，提高生物活性。載體材料可以是天然或合成的高分子材料，也可以是無機或金屬材料，甚至可以是細胞或基因載體。載體材料應具有良好的生物相容性、力學性能、降解性能、孔隙結構等特性，以適應ACLR的需求[40]。目前已有許多研究報道了不同類型載體材料與生長因子組合的應用。Lyu等[41]報道了一種利用微流控芯片產生生長因子梯度的方法，將BMP-2和TGF-β分別包裹在聚乳酸和明膠微球中，然后與去細胞化肌腱支架復合形成三層結構，用于肌腱-骨界面的愈合。該方法能夠引導BMSCs和肌腱干細胞在不同區域分化為骨細胞、軟骨細胞和肌腱細胞，并重建移植肌腱-骨組織的梯度結構。
除了生長因子與載體材料的組合外，還有一些其他策略也被用于ACLR中。基因治療是一種利用基因載體將生長因子的基因轉染到目標細胞或組織中，從而實現持續和高效生長因子表達的方法。基因治療可以避免生長因子外源性遞送帶來的不穩定性、高成本、劑量控制等問題，同時也可以利用細胞自身調控機制，實現生長因子的時空特異性表達[42]。Murray 等[43]將BMP-2的逆轉錄病毒載體注射到ACL切斷處，并使用橋接增強支架填充切口，從而實現了ACL自身修復，并在體內實驗中表現出與ACLR相當的效果。
綜上，生長因子是一類能夠刺激細胞增殖、分化和遷移的蛋白質，對于組織修復和再生有重要作用。ACLR中應用生長因子可以促進移植物與骨隧道早期愈合，加快新生血管形成，提高移植物抗張強度和剛度，減少移植物萎縮和退化；還可改善關節軟骨、半月板和滑膜修復，抑制炎癥反應，延緩或防止術后退行性關節炎發生。但生長因子通常具有較低穩定性和較短半衰期，容易受到環境因素和蛋白酶影響而失活或降解；且生長因子往往難以有效到達目標細胞或組織，導致使用劑量大但生物利用度低。
3 細胞促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
近年來，隨著對干細胞研究的深入，大量研究表明干細胞的自我更新及多向分化潛能可應用于組織再生，并顯示出廣闊應用前景。目前已報道的應用于ACLR的干細胞有BMSCs、滑膜來源MSCs（synovial MSCs，SMSTs）及ACL來源MSCs（ACL MSCs，AMSCs）[44]。
3.1 BMSCs
BMSCs作為多能MSCs，在其增殖過程中具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞的潛力。BMSCs可以通過旁分泌作用促進移植肌腱血管化、成熟和功能恢復。Yu等[45]通過BMSCs來源外泌體（BMSCs-exosomes，BMSCs-exos）的旁分泌信號傳導作用促進肌腱干/祖細胞的增殖和遷移。BMSCs還可以通過直接分化作用參與移植肌腱的重建和修復，增加其力學強度和彈性[46]。Lim等[47]的研究顯示，與空白腘繩肌腱相比，通過BMSCs修飾腘繩肌腱行ACLR在止點處顯示出更為成熟的纖維軟骨分化。此外有研究表明，BMSCs可以通過免疫調節作用抑制炎癥反應和免疫排斥反應，減少移植肌腱的退化和壞死。Shi等48]的研究顯示BMSCs-exos可以通過增加移植肌腱-骨組織愈合過程中M2型巨噬細胞極化來促進纖維軟骨形成，從而改善生物力學性能。單純BMSCs的潛力似乎存在局限性，而使用基因轉染技術有望增強BMSCs分化能力和骨再生能力。Dong等[49]通過載荷BMP-2慢病毒轉染BMSCs，從而提升了移植肌腱-骨組織結合處的骨整合能力，進而提升手術療效。Li等[50]通過PDGF-BB轉染BMSCs，加速移植肌腱重塑，促進血管生成和膠原沉積，進而提升ACLR療效。
3.2 SMSTs
SMSTs可能來自骨髓、血液、滑膜細胞、血管周細胞或胚胎關節間區等不同組織。在ACLR相關研究中，Ju等[51]在大鼠模型上使用骨-髕骨-骨肌腱重建ACL，將SMSTs植入移植肌腱和骨隧道的界面處，結果顯示SMSTs能夠加速移植肌腱-骨組織界面的早期重塑，表明SMSTs可能通過分化為成纖維細胞和分泌促進膠原纖維合成的細胞因子來促進移植肌腱-骨組織愈合。
盡管SMSTs顯示出優異的應用潛能，但不同來源的SMSTs功能特征差異較大。Mochizuki等[52]的研究表明與來自皮下脂肪的SMSTs相比，來自纖維滑膜和脂肪滑膜的SMSTs表達更高水平的STRO-1（MSCs蛋白質標志物的基因）和CD106，而CD10水平較低。Mizuno等[53]將滑膜分為3個區域，并比較了從3個區域分離的SMSTs在增殖、表面標記物表達、軟骨分化、鈣化和脂肪分化方面的差異，發現外周血管區域的SMSTs具有最高增殖和軟骨分化潛能，而表面和基質區域的SMSTs則具有相似但較低的潛能。目前尚無研究報道SMSTs的細胞特異表面標志物或轉錄因子，以區分不同來源SMSTs之間的分化潛能，距SMSTs臨床應用仍有較大突破空間。
3.3 AMSCs
AMSCs來源于ACL并具有促進移植肌腱修復和再生的能力。Steinert等[54]發現從損傷ACL中遷移的細胞具有MSCs的特征，能夠分化為多種組織細胞，并且在體外能夠形成類似韌帶的結構；此外還發現ACL中本身就存在大量MSCs，它們可能參與韌帶的生理功能和修復過程。Matsumoto等[55]的研究表明，ACL中存在CD34和CD146表達陽性血管細胞，它們具有多向分化潛能，并且在ACL損傷后被招募到斷裂部位參與ACL的自身修復。然而部分研究顯示，AMSCs的愈合潛力可能與患者年齡及傷后時間相關。Nakano等[56]的研究將不與年齡患者的ACL來源CD39+ 細胞注入大鼠ACLR模型中，發現年輕患者來源的細胞具有更佳骨整合能力。而Inokuchi等[57]的研究表明，從受傷時間>3個月及<3個月的患者分別收集ACL衍生的CD34+干細胞，發現受傷時間<3個月患者ACL衍生的CD34+ 干細胞具有更高的肌腱-骨愈合潛力。此外，同BMSCs相關研究相似，部分研究對AMSCs進行修飾以拓展其促進組織再生能力。Kawakami等[58]通過BMP-2轉染AMSCs后，以細胞片形式應用于大鼠ACLR，能加速及改善移植肌腱成熟及骨整合。
3.4 小結
干細胞具有自我更新和多向分化能力，并且來源廣泛，獲取方式相對簡單和安全，在組織再生領域具有廣闊應用前景。通過旁分泌作用、直接分化作用和免疫調節作用等作用機制，干細胞能夠增強移植肌腱的血管化、成熟和功能恢復。通過基因轉染技術或與其他生物材料的結合等，能進一步提高干細胞分化能力和再生能力，是促進ACLR療效的潛在優勢對象。
4 可降解植入物促進ACLR術后移植肌腱愈合的策略
近年來，界面組織工程技術飛速發展，其深入探究了軟組織重建修復機制，為借助先進生物材料打造仿生支架模擬原生組織結構再生所需微環境，最終實現原位再生類似天然組織結構并獲得相應生物學特性提供了可能[59]。選擇安全可靠、具有一定機械強度的材料打造基底支架，并對其進行修飾，利用不同生物材料的特性，在不同層次調控移植肌腱與骨隧道之間的梯度分化以及移植肌腱中央實質部的韌帶化，是構建積極影響ACLR遠期療效的潛在有效手段。理想的可應用于支架構建的生物活性材料應滿足生物力學及生物相容性相應要求。膠原、絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）］、聚（脫氨基酪氨酰酪氨酸十二烷基酯）［poly（desaminotyrosyl-tyrosine dodecyl dodecanedioate），P（DTD DD）］、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、 聚二氧嘧啶酮（polydioxanone，PDS）、聚左乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）等材料相繼被研究報道[56，60]。
由于原生ACL基質的主要成分是Ⅰ型膠原[61]，多種膠原基質物被嘗試用于支架構建。膠原支架的力學性能不及原生組織，并且隨時間推移其力學強度明顯下降[62]。故交聯劑如甲醛、羧二亞胺等被相繼開發用于延緩支架降解，但交聯劑可能存在生理毒性[63]。基于此，膠原-血小板復合材料、雙相膠原復合材料、膠原蛋白-絲素蛋白復合材料等被開發，在保有膠原支架原有特性的同時，進一步提升支架的生物力學性能[64-66]。
另一種天然聚合物絲素蛋白[67]可從家蠶絲獲取；家蠶絲主要由絲素蛋白及絲膠組成，其表面的絲膠會引起機體免疫反應，需通過加工去除[68]。絲素蛋白在保持天然聚合物優異的生物相容性和降解性能同時，還擁有優秀的機械性能[69]。然而其細胞募集性能較差。基于此，最常見的改性策略是通過化學改性方式調整絲素蛋白的物理化學性質或者引入活性基團，從而產生新的材料性能[70]。具體而言，可以利用點擊化學[71]、雙酪氨酸交聯[72]、超分子交聯[73]等方法，對絲素蛋白的羥基、羧基、氨基和硫醇基等不同官能團進行修飾[68]。在生物材料與組織工程領域，除了上述改性策略，還可通過增材定制方式制備具有復雜結構的支架，滿足組織的特異性需求[74-75]。也有研究通過對蠶絲改性，實現藥物可控的輸出及釋放[73]。上述方案在賦能蠶絲以更優生物學性能同時，為復雜界面組織工程支架的構建提供了靈感及廣泛的備選基礎。
合成材料方面，PLGA、P（DTD DD）、PGA、PDS、PLLA等材料被相繼開發并應用于骨骼、肌腱及韌帶組織工程。這些材料都具有優異的機械性能、生物可降解性、易于加工，但通常降解產物呈酸性，容易引發炎癥反應，需要進一步加工修飾改善性能[76]。
鑒于移植肌腱到骨組織的分級組成和結構，研究者通常傾向于通過雙相/多相支架、梯度礦化支架的形式來構建復雜分層界面，使得界面異型細胞群和基質的階段特異性變化成為可能，并表現出分級的機械性能。Sun等[77]制備了PLGA-聚已內酯的共靜電紡雙納米支架，還將膠原蛋白和納米羥基磷灰石分別摻入其中，以提高生物相容性。Kim等[78]開發了一種具有不同成分的4層膠原蛋白支架，包括肌腱層（膠原蛋白）、纖維軟骨層（膠原蛋白和硫酸軟骨素）、礦化纖維軟骨層（膠原蛋白和低度礦化透明質酸）和骨層（膠原蛋白和高度礦化透明質酸）；Lausch等[79]使用in-well礦化系統制造了多相膠原支架，以提升移植肌腱-骨組織愈合；Chen等[80]通過靜電紡絲裝置制備了納米纖維絲膜，然后將絲膜垂直放置在10×模擬體液中，從底部產生空間層面從下到上的礦化梯度，成功制造了梯度礦化電紡絲附著點支架。
綜上，可降解植入物可以提供額外的穩定性，保護移植肌腱，促進其愈合和成熟，是促進ACLR術后移植肌腱愈合的重要策略。可降解植入物能夠以模擬原生ACL復雜界面的結構、基質等形式或者載藥遞送生物活性物質的形式增加生物誘導性，促進細胞遷移、增殖和分化，抑制炎癥反應和纖維化等。盡管制備技術不斷進步，能夠有效模仿原生ACL微環境，但目前大多數研究仍停留于微觀尺度的模仿，在納米尺度上的突破仍存在巨大挑戰。
5 應用于ACLR的動物實驗模型和臨床初步嘗試
動物模型是臨床前研究的最主要研究對象，旨在證明生物材料進入臨床試驗前的可行性、安全性和有效性。通常小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、豬等均可用于建立ACLR模型。其中，小鼠、大鼠因成本較低和易獲取性受到研究者青睞，廣泛應用于ACLR愈合相關機制通路的探索。兔在生物材料研究中的應用也較為廣泛，然而有研究表明，兔膝關節功能位呈屈曲位，與大型動物特別是人體存在差別[81]。山羊和豬是更為優勢的動物模型[82]，一般需要扎實的前期研究基礎。
然而，動物模型往往只能模擬人ACLR的病理變化、生物力學特性或功能恢復等部分方面，不能全面反映人ACLR的復雜性和多樣性，且往往缺乏標準化的建立方法、評價指標和實驗設計，導致不同研究之間難以比較和整合。再者，動物模型往往受到種間差異、個體差異、實驗條件和技術水平等因素的影響，導致實驗結果難以推廣到人體研究。
盡管如此，部分研究已經開始嘗試將生物材料應用于人體研究中，并取得了一定進展。Alentorn-Geli等[83]的研究嘗試了脂肪源再生干細胞（adipose-derived regenerative cells，ADRCs）在ACLR的應用，并表明其有可能促進組織再生以改善移植肌腱愈合過程，然而并未發現與未接受ADRCs治療的患者在臨床結果方面存在顯著差異。Jang等[44]則嘗試通過同種異體人臍帶血來源MSCs改善組織再生，但需要進一步研究來驗證其有效性。Yang等[84]一項關于PRP應用于ACLR的回顧性研究表明，PRP能及早改善膝關節功能；然而Gong等[85]的研究則表明PRP對減少骨隧道增寬或改善膝關節功能并無顯著作用。Mutsuzaki等[86]通過鈣磷雜化肌腱移植物增強移植物與骨隧道的整合來促進ACLR術后移植肌腱愈合。Wang等[87]通過體外沖擊波治療刺激血流和細胞增殖來促進ACLR術后移植肌腱愈合，結果顯示該方法減少了骨隧道擴大，但需要進一步研究確定其有效性。
6 總結及展望
關節鏡下ACLR術后效果不佳，部分患者存在需要翻修的問題。臨床上報道了多種改良術式，但因證據質量良莠不齊、臨床試驗方案設計差異性大、不同人種之間存在解剖變異等，目前尚無公認的最佳臨床術式。近年來，隨著對ACL微觀結構的進一步了解以及生物醫學領域相關技術的突飛猛進，大量研究旨在通過組織工程技術促進ACLR術后療效。盡管部分研究已顯著提升了療效，然而大部分研究仍局限于早期動物實驗階段，離真正臨床推廣應用仍有較遠距離。此外，受限于當下制備技術，對界面的仿生仍多停留于微米、毫米級，并且偏向于形態學仿生，在信號機制通路上的研究依舊不足。未來隨著ACL解剖學、發育學相關報道的深入以及制備技術的改進，該領域在促進ACLR方面有望得到進一步提升。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和報道
作者貢獻聲明 蔡武峰：文獻檢索，原文撰寫；李棋：文章撰寫，質量控制；李箭：文章撰寫及審校