引用本文： 曲彥隆, 關正瑞, 南飛, 劉思遙, 劉祿萌. 負載桑黃素的碳點紫外光交聯殼聚糖水凝膠對大鼠軟骨損傷的作用及其機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(12): 1524-1533. doi: 10.7507/1002-1892.202208121 復制
膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性關節退行性疾病，主要病理改變為關節軟骨損傷，而軟骨組織自我修復能力較差，一旦損傷難以自愈[1-2]。目前臨床治療軟骨損傷方式較多，但療效均不理想。抑制炎癥介質產生是治療KOA的重要環節。桑黃素是一種提取自桑科植物的天然黃酮類化合物[3]，本課題組前期基于軟骨細胞炎癥損傷相關通路的研究提示，12.5、25.0 μmol/L桑黃素可以緩解IL-1β誘導的炎癥反應，降低影響軟骨降解的關鍵物質基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達，減少軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ）和蛋白多糖的流失，通過激活NF-κB信號通路對抗OA抑制軟骨細胞外基質的降解，維持軟骨細胞表型，發揮延緩關節退變的作用[4-5]。
構建一種能在軟骨損傷局部持續釋放藥物因子，同時保持一定力學強度的緩釋載體是KOA治療的研究方向[6-7]。殼聚糖是一種天然高分子化合物，生物毒性低、易降解，在生物工程及藥物遞送等領域應用廣泛[8-9]。利用甲基丙烯酰酐改性獲得的殼聚糖水凝膠，具有副作用小、釋放動力學可控以及與殼聚糖相比生物相容性更高等優勢，可作為一種高效載體[10-11]。但是單純負載藥物的殼聚糖水凝膠在體內降解情況無法定量研究。
在人工合成材料研究中，碳點是一種碳源納米粒子，主要成分為sp3/sp2比例雜化的碳原子，具有抗氧化作用，可保護細胞減少氧化應激損傷，在運載藥物等方面有著良好表現[12-14]。而且將碳點熒光探針與紫外光（ultraviolet，UV）交聯殼聚糖水凝膠復合后，通過熒光圖像即可定量研究水凝膠在體內降解過程。本研究通過甲基丙烯酰酐對殼聚糖進行改性，引入碳點，制備負載桑黃素的碳點UV交聯殼聚糖（UV-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin，NMCM）水凝膠，探索其對大鼠關節軟骨損傷的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量65～80 g，平均73 g，由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心提供。
桑黃素標準品、DMEM-F12培養基（大連美侖生物技術有限公司）；殼聚糖（脫乙酰度91.4%；青島海匯生物工程有限公司）；FBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；北京北仁化學科技有限公司）；活性氧檢測試劑盒（MCE公司，美國）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；甲基丙烯酸酐（純度94%）、光引發劑I2959（Sigma-Aldrich公司，美國）；青-鏈霉素雙抗（HyClone公司，美國）；cDNA逆轉錄試劑盒（Roche公司，瑞士）；RNA提取試劑盒（QIAGEN公司，德國）；丙烯酰胺（上海聯邁生物工程有限公司）；過硫酸銨（Amresco公司，美國）。
高速離心機（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；恒溫細胞培養箱（Binder公司，德國）；500 Fast RT-PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；Odyssey紅外光掃描成像系統（LI-COR公司，美國）；Cytation5細胞成像微孔板檢測系統（Biotek公司，美國）；Quntum GX micro-CT儀（PerkinElmer公司，美國）。
1.2 NMCM水凝膠制備及檢測
1.2.1 UV交聯殼聚糖制備
按照1∶100比例將甲基丙烯酰酐滴入1%（W/V）殼聚糖乙酸溶液中，60℃下持續攪拌12 h；加入NaHCO3將溶液調至中性，在去離子水下透析4 d；冷凍干燥，獲得UV交聯殼聚糖。
1.2.2 碳點制備
將1 g殼聚糖和4 g丙烯酰胺加入30 mL去離子水中，隨后加入22.5 mg過硫酸銨，超聲下溶解；溶液轉移至50 mL反應釜中，反應溫度220℃，反應時間12 h；室溫下冷卻，以離心半徑6.3 cm，10 000 r/min離心5 min；0.22 μmol/L微孔過濾器過濾；50%乙醇水溶液透析6 h，去離子水透析6 h，每隔2 h換液；以離心半徑6.3 cm，10 000 r/min離心5 min，獲得碳點溶液。
1.2.3 NMCM水凝膠制備
將桑黃素用PBS稀釋至濃度10.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol/L。將制備的UV交聯殼聚糖、碳點以及光引發劑I2959（上述溶液濃度分別為2%、800 μg/mL、1.5‰），加入至不同濃度桑黃素溶液中，每100毫升桑黃素溶液中加入UV交聯殼聚糖2 g、碳點10 mL、光引發劑I2959 150 μg；震蕩攪拌1 h；在強度10 mW/cm2 UV下照射30 s，形成水凝膠。見圖1。
圖1
NMCM水凝膠制備
a. UV照射下交聯；b. 交聯后樣品
Figure1. Preparation of NMCM hydrogela. Crosslinking under UV irradiation; b. The cross-linked hydrogel sample
1.2.4 NMCM水凝膠緩釋性能檢測
首先測定桑黃素標準曲線。使用酶標儀于波長390 nm處測量上一步驟中制備的各濃度桑黃素溶液吸光度（A）值，繪制桑黃素標準曲線圖，擬合標準曲線方程為y=0.005 04x+0.047 6。
然后，取負載100.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠5 mg，置于50 mL離心管中，加入40 mL PBS；于恒溫水浴搖床進行緩釋測試，溫度設定為37℃、震蕩速度15 r/min。于震蕩后1、2、3、4、5、6、12、24、48、72、96 h，從管中各取出1 mL溶液，同時補充相同體積PBS。采用酶標儀測量各時間點溶液A值，利用桑黃素標準曲線方程計算桑黃素濃度，繪制累積釋放曲線。實驗重復3次。
1.3 體外細胞實驗
1.3.1 軟骨細胞分離、培養及鑒定
① 軟骨細胞分離及培養：軟骨組織均由2021年1月—6月于我院行關節置換患者自愿捐贈，包括20例因KOA手術者（KOA軟骨組織）以及20例因股骨頸頭下型骨折手術者（正常軟骨組織）。于超凈工作臺切取關節軟骨組織，置于含1%青-鏈霉素雙抗的DMEM-F12培養基保存。實驗前將軟骨組織切成體積為2～3 mm3的碎塊，沖洗干凈后置于培養瓶中；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，于恒溫培養箱中消化30 min，吸棄胰蛋白酶；加入5 mL配置的0.2%Ⅱ型膠原酶/DMEM-F12培養基，于37℃、5%CO2條件下消化12 h；經孔徑為100 μm的濾網過濾；以離心半徑12 cm、1 500 r/min離心5 min；將離心管底部沉淀用含10%FBS的DMEM-F12重懸，反復吹打均勻后置于培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養。每日倒置顯微鏡下觀察細胞形態并隔天換液。待細胞貼壁達80%～90%時進行傳代。取處于對數增長期的第3代細胞進行后續實驗。
② 軟骨細胞鑒定：將KOA軟骨細胞接種至6孔板，每孔1×105個，于37℃、5%CO2條件下培養8 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；待細胞貼壁后換液，此后隔天換液，繼續培養至孔內80%細胞貼壁后進行甲苯胺藍染色。
棄原培養基，PBS洗滌1 min×3次，注意輕柔操作避免細胞脫落；加入4%多聚甲醛，室溫下固定10 min；棄多聚甲醛，加入甲苯胺藍染色液，每孔2 mL；室溫下染色5 min；每孔加入2 mL蒸餾水，輕柔振蕩培養板，混合均勻后繼續染色15 min；吸棄全部染色液，加蒸餾水清洗30 s×2次。每孔加入3 mL蒸餾水以完全浸沒孔底，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
1.3.2 桑黃素細胞毒性檢測
采用CCK-8法檢測桑黃素細胞毒性。取KOA軟骨細胞，采用DMEM-F12培養基制成細胞懸液，接種至96孔板，每孔1×104個細胞。于37℃、5%CO2條件下采用DMEM-F12培養基培養，待軟骨細胞完全貼壁后，吸棄培養基并分為4組，包括對照組以及12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素組，每組3個復孔。其中，對照組加入無血清DMEM-F12培養基，其余組分別加入含對應濃度桑黃素的無血清DMEM-F12培養基。繼續培養24 h后吸棄上清，避光條件下加入CCK-8溶液，每孔100 μL，孵育4 h；于酶標儀波長450 nm處檢測各孔A值。
1.3.3 NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響檢測
取KOA軟骨細胞同上法制成細胞懸液并接種至96孔板，每孔5×103個細胞；將其分為4組，分別為對照組以及負載12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組，每組3個復孔。其中，對照組加入含10%FBS的DMEM-F12培養基，其余組在此基礎上加入負載對應濃度桑黃素的NMCM水凝膠50 μg。于37℃、5%CO2條件下培養24、48、72、96 h后行CCK-8法檢測。
1.3.4 COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察
實驗分為3組，正常軟骨細胞組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+負載50 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組（KOA軟骨細胞+水凝膠組），每組3個復孔。取正常及KOA軟骨細胞，同上法制成細胞懸液后接種至96孔板，每孔1×104個細胞，待細胞貼壁后孵育24 h；KOA軟骨細胞+水凝膠組每孔置入50 μg 水凝膠，其余兩組不作處理；繼續培養24 h后棄上清液及水凝膠，PBS洗滌。室溫下，加入4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗滌5 min×3次；加入0.5%Triton X-100 10 min；吸棄上清液后再次洗滌，37℃封閉1 h；加1 μg/mL COL-Ⅱ一抗，每孔100 μL，置于4℃冰箱過夜；避光條件下加入熒光二抗100 μL，孵育1 h；吸棄二抗后洗滌3次；每孔加入DAPI 100 μL，染色5 min；熒光顯微鏡下觀察染色情況，陽性染色細胞核呈藍色、COL-Ⅱ呈綠色。每組取3個視野，使用熒光酶標儀測算熒光強度值。
1.3.5 活性氧檢測
實驗分為4組，正常對照組、陽性對照組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+負載50 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組（KOA軟骨細胞+水凝膠組），每組3個復孔。取正常及KOA軟骨細胞，同上法制成細胞懸液后接種至6孔板，每孔1×105個細胞。前兩組接種正常軟骨細胞，后兩組接種KOA軟骨細胞，且KOA軟骨細胞+水凝膠組同時加入對應的NMCM水凝膠150 μg。隔天換液，繼續培養。
按照活性氧檢測試劑盒說明書操作。配置2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）溶液，以無血清培養基為溶劑，溶液濃度為10 μmol/L；以同樣比例配置Rosup（活性氧陽性對照）溶液。待細胞長滿孔內80%時原位裝載熒光探針。除陽性對照組每孔加入1.5 mL Rosup溶液外，其余各組每孔加入1.5 mL DCFH-DA溶液。于37℃孵育20 min后洗去多余探針3 min×3次。裝載完成后，將培養板置于熒光酶標儀檢測，選取FITC參數設置進行圖像收集，計算熒光強度值。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 構建大鼠膝關節軟骨損傷模型
將20只大鼠隨機分為實驗組及對照組，每組各10只。兩組腹腔內注射2%戊巴比妥鈉（2.5 mL/kg）麻醉后，固定于手術臺。取右后肢膝關節，于髕韌帶內側縱向弧形切開約1.5 cm，分離各層組織，打開關節囊。將髕骨推向外側滑脫，暴露股骨髁滑車負重區域。用鉆頭在負重區鉆一直徑1 mm、深至軟骨下骨的圓形缺損。實驗組軟骨缺損處注射含25 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠，UV照射30 s 進行交聯；對照組缺損處曠置處理。生理鹽水反復沖洗術區，注意避免水凝膠脫落，逐層縫合關閉切口。
術后傷肢不固定，3 d內每天肌肉注射青霉素1次（10萬U/次）。造模4周后處死全部大鼠進行觀測。
1.4.2 觀測指標
① micro-CT檢測：完整切取大鼠右后肢，置于4%多聚甲醛固定72 h后行micro-CT檢查，條件設定為體素尺寸18 pm、電壓80 kV、電流100 μA、暴露時間15 min。
② 大體及組織學觀察：micro-CT檢測后，以原手術切口入路暴露膝關節，伸直下肢并向外側輕推髕骨，暴露關節面。鈍性分離關節周圍軟組織，剪斷前、后交叉韌帶及內、外側副韌帶，去除軟組織，獲得股骨髁軟骨標本。大體觀察軟骨修復情況，并根據國際軟骨修復協會（ICRS）制定的軟骨修復大體評分系統[15]進行大體評分并分級。
大體觀察后，取兩組部分股骨髁軟骨標本置于4%多聚甲醛固定72 h，10%EDTA溶液脫鈣，當針頭刺入無阻力時結束脫鈣。石蠟包埋、切片，片厚6 μm。取部分切片行番紅-O固綠染色，光鏡下觀察軟骨與軟骨下骨，并根據ICRS軟骨修復組織學評價量表[15]進行組織學評分。取部分切片行COL-Ⅱ免疫組織化學染色，倒置顯微鏡下觀察軟骨組織與軟骨下骨。
③ 實時熒光定量PCR檢測：取兩組部分股骨髁軟骨標本，采用實時熒光定量PCR檢測TNF-α、NF-κB、MMP-13、COL-Ⅱ（COL-2a1）、GAPDH的mRNA表達。按照RNA提取試劑盒說明書提取標本總RNA，以逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。使用Primer5.0軟件選擇引物序列（表1）。反應條件：預變性95℃、30 s，變性60℃、5 s，退火60℃、30 s。以GAPDH為內參，采用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR
④ Western blot檢測：取兩組部分股骨髁軟骨標本，加入RIPA裂解液，4℃條件下裂解1 h，酶標儀測量蛋白濃度。根據BCA蛋白測定結果，向齒槽中加入適量蛋白進行電泳。電泳完成后轉移至聚偏二氟乙烯膜，在搖床上封閉1～2 h，加入TNF-α（1∶500）、NF-κB（1∶500）、MMP-13（1∶500）、COL-Ⅱ（1∶500）一抗，4℃孵育12 h。吸棄一抗，靜置1 h后TBST洗滌10 min×3 次；加入二抗（1∶3 000），4℃孵育2 h。洗滌后置于成像分析儀中成像，Image J軟件分析上述KOA相關標志蛋白及軟骨細胞表型相關蛋白表達情況，以β-actin作為內參，計算目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料進行正態性檢驗，如符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NMCM水凝膠緩釋性能檢測
NMCM水凝膠中桑黃素在早期釋放速度較快，1 h時累積釋放率為12%；24 h開始釋放變緩，96 h時釋放量接近于0，提示藥物釋放達平衡點，此時累積釋放率為88%。累積釋放曲線見圖2。
圖2
NMCM水凝膠累積釋放曲線
Figure2.
Drug release curve of NMCM hydrogel
2.2 體外細胞實驗
2.2.1 軟骨細胞形態觀察及鑒定
培養的KOA軟骨細胞大小均一，呈圓球形；24 h后細胞完全貼壁，狀態良好；4 d后細胞增多，呈不規則排列；8 d后細胞進一步增多，密度增大且分布緊密，貼壁狀態穩定。傳代后軟骨細胞無明顯纖維化，細胞仍呈圓球形。見圖3a～e。甲苯胺藍染色后KOA軟骨細胞形態正常，呈圓球形；細胞質呈紫紅色，細胞核大而圓、染色后呈藍紫色，其中可見正在分裂的細胞，生長情況良好。鑒定結果提示分離培養細胞為軟骨細胞。見圖3f。
圖3
倒置顯微鏡下KOA軟骨細胞形態觀察及鑒定
a～e. 原代細胞培養2 h、8 h、4 d、8 d以及第3代軟骨細胞形態（×100）； f. 甲苯胺藍染色（×40）
Figure3. Morphological observation and identification of KOA chondrocytes under inverted microscopea-e. Morphology observation of primary cells cultured for 2 hours, 8 hours, 4 days, and 8 days and the 3rd generation (×100); f. Toluidine blue staining (×40)
2.2.2 桑黃素細胞毒性檢測
與對照組比較，各濃度桑黃素組A值均增加，提示濃度≤50.0 μmol/L的桑黃素溶液對軟骨細胞無毒性作用。其中12.5、25.0 μmol/L桑黃素組與對照組差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
CCK-8法檢測桑黃素細胞毒性
*與對照組比較
*Compared with the control group,
2.2.3 NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響檢測
培養后各時間點，NMCM水凝膠組A值均較對照組增加（圖5）。其中，24、96 h時各NMCM水凝膠組與對照組差異均有統計學意義（P<0.05）；48、72 h時負載12.5、25.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組與對照組差異有統計學意義（P<0.05）。
圖5
CCK-8法檢測負載不同濃度桑黃素的NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響
Figure5.
Effect of the NMCM hydrogel loaded with different concentrations of morin on chondrocyte proliferation detected by CCK-8 assay
2.2.4 COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下見各組均呈陽性染色（圖6）。 KOA軟骨細胞組及KOA軟骨細胞+水凝膠組COL-Ⅱ熒光強度值分別為0.06±0.04、0.92±0.03，均低于正常軟骨細胞組（1.00±0.02）；KOA軟骨細胞+水凝膠組高于KOA軟骨細胞組；組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖6
COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
a. 正常軟骨細胞組；b. KOA軟骨細胞組；c. KOA軟骨細胞+水凝膠組
Figure6. Observation of COL-Ⅱ immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)a. Normal chondrocyte group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group
2.2.5 活性氧檢測
正常對照組、陽性對照組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+水凝膠組熒光強度值分別為1.00±0.01、2.20±0.05、2.04±0.09、1.71±0.06。其中，KOA軟骨細胞組熒光強度值高于正常對照組及KOA軟骨細胞+水凝膠組，KOA軟骨細胞+水凝膠組高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
DCFH-DA探針檢測軟骨細胞活性氧水平（熒光顯微鏡×60）
a. 正常對照組；b. KOA軟骨細胞組；c. KOA軟骨細胞+水凝膠組；d. 陽性對照組
Figure7. The level of ROS in chondrocytes detected by DCFH-DA probe (Fluorescence microscope×60）a. Normal control group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group; d. Positive control group
2.3 動物體內實驗
2.3.1 micro-CT觀察
術后每組各有1只動物造模處感染，排除實驗，兩組各9只納入觀測。術后4周micro-CT觀察示，實驗組關節面粗糙，軟骨缺損仍可見，但關節間隙正常；對照組關節軟骨變薄，關節面與實驗組相比更粗糙，軟骨缺損無修復跡象，關節間隙變窄。見圖8。
圖8
術后4周兩組micro-CT觀察
箭頭示軟骨缺損處 a、b. 實驗組正側位；c、d. 對照組正側位
Figure8. Micro-CT observation of two groups at 4 weeks after operationArrow for the cartilage injury a, b. Anteroposterior and lateral views of the experimental group; c, d. Anteroposterior and lateral views of the control group
2.3.2 大體觀察
術后4周實驗組股骨髁關節面粗糙，NMCM水凝膠已降解，軟骨缺損仍可見，其周圍有組織修復，以纖維組織為主；對照組關節面更粗糙，軟骨缺損未見修復組織。見圖9。實驗組ICRS大體評分為（3.7±0.7）分，高于對照組的（0.9±0.6）分，差異有統計學意義（t=?8.980，P<0.001）。根據ICRS大體評分，實驗組軟骨修復達Ⅲ級5只、Ⅳ級4只；對照組均為Ⅳ級。
圖9
兩組軟骨缺損大體觀察
箭頭示軟骨缺損處 a. 股骨髁軟骨缺損模型；b. 實驗組NMCM水凝膠修復后；c. 術后4周對照組；d. 術后4周實驗組
Figure9. Gross observation of cartilage injury in the two groupsArrow for the cartilage injury a. Femoral condylar cartilage injury model; b. The cartilage injury was repaired with NMCM hydrogel in the experimental group; c. Control group at 4 weeks after operation; d. Experimental group at 4 weeks after operation
2.3.3 組織學觀察
① 番紅-O固綠染色：兩組軟骨與軟骨下骨分界清晰。實驗組軟骨細胞較多，軟骨組織較厚，關節面粗糙；對照組與實驗組相比，關節軟骨變薄，軟骨細胞少，關節面更粗糙，可見軟骨缺損。實驗組ICRS組織學評分為（3.4±0.9）分，高于對照組的（1.8±1.1）分，差異有統計學意義（t=–3.560，P=0.026）。② COL-Ⅱ免疫組織化學染色：兩組染色均呈陽性，但實驗組染色較對照組深。見圖10。
圖10
術后4周兩組組織學觀察（倒置顯微鏡×40）
箭頭示軟骨缺損處 a、b. 實驗組及對照組番紅-O固綠染色；c、d. 實驗組及對照組COL-Ⅱ免疫組織化學染色
Figure10. Histological observation of the two groups at 4 weeks after operation (Inverted microscope×40）Arrow for the cartilage injury a, b. Safranine-O-fast green staining of the experimental and control groups; c, d. COL-Ⅱ immunohistochemistry staining of the experimental and control groups
2.3.4 Western blot及實時定量 PCR檢測
實驗組MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相對表達量均較對照組降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11。
圖11
兩組軟骨組織目的蛋白及基因表達觀測
a. 蛋白電泳圖 1：對照組 2：實驗組 Mr：相對分子質量；b. 目的蛋白相對表達量 *與對照組比較
a. Electrophoregram 1: Control group 2: Experimental group Mr: Relative molecular mass; b. Relative expressions of the targeted proteins *Compared with the control group,
3 討論
KOA最主要的病理改變為軟骨損傷進行性加重，如果能修復填充軟骨缺損，抑制炎癥介質持續破壞軟骨，就能延緩疾病進展。目前，負載治療藥物的緩釋材料為軟骨修復提供了可能[16-18]。
殼聚糖是一種優秀緩釋載體，并且可以通過引入基團進行改性，以改進性能或改變交聯方式[19]。本研究中通過加入甲基丙烯酰酐對殼聚糖進行改性并引入碳點，以降低殼聚糖的分子間作用力，使其具有中性pH環境下的高溶解性。不同于既往研究中復雜的交聯條件或較長的交聯時間，UV交聯殼聚糖能夠在短時間的UV照射下快速交聯，且在負載桑黃素后表現出良好的緩釋性能。我們前期研究表明桑黃素在諸如降低氧化應激水平、抑制炎癥細胞增殖、減輕炎癥反應等方面均有良好表現[4]。但既往關于桑黃素的細胞毒性研究未采用人軟骨細胞，因此未能確定其對于人來源軟骨細胞的毒性，而且桑黃素作用于軟骨細胞的最適濃度缺乏定量實驗支持。本研究結果表明，12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素溶液均對人軟骨細胞無毒性，而且可促進軟骨細胞增殖。而在細胞增殖實驗中，當桑黃素溶液濃度增加至50 μmol/L時，軟骨細胞增殖速度無顯著增高，提示軟骨細胞增殖能力對較高濃度的桑黃素無濃度依賴性。因此，在進行復合藥物緩釋時，可以選擇濃度較低的桑黃素溶液即可達到理想藥理作用。
在KOA軟骨細胞中活性氧表達水平往往異常升高[20]，其通過多種通路參與軟骨損傷發生，是誘發KOA的重要因素。本研究在殼聚糖加入的碳點中摻有氮元素，其作為電子供體賦予碳點良好的抗氧化功能[21]，配合桑黃素的抗氧化作用，有效降低了KOA軟骨細胞中的活性氧水平，提示桑黃素及碳點具有抗氧化作用，可共同保護軟骨細胞，減少氧化應激損傷。NF-κB是一種與軟骨細胞凋亡緊密相關的信號通路，在KOA發病過程中具有重要作用。TNF-α同時作為NF-κB的上、下游因子，與其構成正反饋環路，放大了促進細胞凋亡的作用。本研究中，桑黃素下調了NF-κB、TNF-α表達水平，且其下游炎癥因子MMP-13水平也下降。COL-Ⅱ作為細胞外基質的重要組成成分，在KOA發生時表達水平顯著降低。本研究結果提示，桑黃素可降低細胞中MMP-13水平，進而減少細胞外基質分解，提高細胞中COL-Ⅱ水平。在細胞免疫熒光染色檢測中同樣發現，負載桑黃素的NMCM水凝膠對軟骨細胞中COL-Ⅱ的正常合成代謝有著積極影響。而在動物體內實驗中，實驗組大鼠膝關節面形態更接近正常，大體評分及組織學評分更高、修復評估分級更高，與上述體外實驗結果一致。
綜上述，碳點UV交聯殼聚糖水凝膠具有優秀的緩釋性能，負載桑黃素后能夠起到保護軟骨細胞的作用。作為一種理想的治療軟骨損傷載藥體系， NMCM水凝膠具有在UV照射下快速交聯、長期緩釋的特點，臨床有望聯合膝關節鏡技術，于微創條件下進行關節內UV照射交聯，為KOA軟骨損傷提供修復基質和緩釋藥物。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院臨床試驗倫理委員會批準（2020HX031），哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物使用與福利倫理審查委員會批準（2022099）；實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2021-004
作者貢獻聲明 曲彥隆：研究設計、修改論文；關正瑞：研究實施、論文撰寫；南飛、劉思遙：數據收集及統計學分析；劉祿萌：文獻整理、行政支持
膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性關節退行性疾病，主要病理改變為關節軟骨損傷，而軟骨組織自我修復能力較差，一旦損傷難以自愈[1-2]。目前臨床治療軟骨損傷方式較多，但療效均不理想。抑制炎癥介質產生是治療KOA的重要環節。桑黃素是一種提取自桑科植物的天然黃酮類化合物[3]，本課題組前期基于軟骨細胞炎癥損傷相關通路的研究提示，12.5、25.0 μmol/L桑黃素可以緩解IL-1β誘導的炎癥反應，降低影響軟骨降解的關鍵物質基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達，減少軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ）和蛋白多糖的流失，通過激活NF-κB信號通路對抗OA抑制軟骨細胞外基質的降解，維持軟骨細胞表型，發揮延緩關節退變的作用[4-5]。
構建一種能在軟骨損傷局部持續釋放藥物因子，同時保持一定力學強度的緩釋載體是KOA治療的研究方向[6-7]。殼聚糖是一種天然高分子化合物，生物毒性低、易降解，在生物工程及藥物遞送等領域應用廣泛[8-9]。利用甲基丙烯酰酐改性獲得的殼聚糖水凝膠，具有副作用小、釋放動力學可控以及與殼聚糖相比生物相容性更高等優勢，可作為一種高效載體[10-11]。但是單純負載藥物的殼聚糖水凝膠在體內降解情況無法定量研究。
在人工合成材料研究中，碳點是一種碳源納米粒子，主要成分為sp3/sp2比例雜化的碳原子，具有抗氧化作用，可保護細胞減少氧化應激損傷，在運載藥物等方面有著良好表現[12-14]。而且將碳點熒光探針與紫外光（ultraviolet，UV）交聯殼聚糖水凝膠復合后，通過熒光圖像即可定量研究水凝膠在體內降解過程。本研究通過甲基丙烯酰酐對殼聚糖進行改性，引入碳點，制備負載桑黃素的碳點UV交聯殼聚糖（UV-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin，NMCM）水凝膠，探索其對大鼠關節軟骨損傷的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量65～80 g，平均73 g，由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心提供。
桑黃素標準品、DMEM-F12培養基（大連美侖生物技術有限公司）；殼聚糖（脫乙酰度91.4%；青島海匯生物工程有限公司）；FBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；北京北仁化學科技有限公司）；活性氧檢測試劑盒（MCE公司，美國）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；甲基丙烯酸酐（純度94%）、光引發劑I2959（Sigma-Aldrich公司，美國）；青-鏈霉素雙抗（HyClone公司，美國）；cDNA逆轉錄試劑盒（Roche公司，瑞士）；RNA提取試劑盒（QIAGEN公司，德國）；丙烯酰胺（上海聯邁生物工程有限公司）；過硫酸銨（Amresco公司，美國）。
高速離心機（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；恒溫細胞培養箱（Binder公司，德國）；500 Fast RT-PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；Odyssey紅外光掃描成像系統（LI-COR公司，美國）；Cytation5細胞成像微孔板檢測系統（Biotek公司，美國）；Quntum GX micro-CT儀（PerkinElmer公司，美國）。
1.2 NMCM水凝膠制備及檢測
1.2.1 UV交聯殼聚糖制備
按照1∶100比例將甲基丙烯酰酐滴入1%（W/V）殼聚糖乙酸溶液中，60℃下持續攪拌12 h；加入NaHCO3將溶液調至中性，在去離子水下透析4 d；冷凍干燥，獲得UV交聯殼聚糖。
1.2.2 碳點制備
將1 g殼聚糖和4 g丙烯酰胺加入30 mL去離子水中，隨后加入22.5 mg過硫酸銨，超聲下溶解；溶液轉移至50 mL反應釜中，反應溫度220℃，反應時間12 h；室溫下冷卻，以離心半徑6.3 cm，10 000 r/min離心5 min；0.22 μmol/L微孔過濾器過濾；50%乙醇水溶液透析6 h，去離子水透析6 h，每隔2 h換液；以離心半徑6.3 cm，10 000 r/min離心5 min，獲得碳點溶液。
1.2.3 NMCM水凝膠制備
將桑黃素用PBS稀釋至濃度10.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol/L。將制備的UV交聯殼聚糖、碳點以及光引發劑I2959（上述溶液濃度分別為2%、800 μg/mL、1.5‰），加入至不同濃度桑黃素溶液中，每100毫升桑黃素溶液中加入UV交聯殼聚糖2 g、碳點10 mL、光引發劑I2959 150 μg；震蕩攪拌1 h；在強度10 mW/cm2 UV下照射30 s，形成水凝膠。見圖1。
圖1
NMCM水凝膠制備
a. UV照射下交聯；b. 交聯后樣品
Figure1. Preparation of NMCM hydrogela. Crosslinking under UV irradiation; b. The cross-linked hydrogel sample
1.2.4 NMCM水凝膠緩釋性能檢測
首先測定桑黃素標準曲線。使用酶標儀于波長390 nm處測量上一步驟中制備的各濃度桑黃素溶液吸光度（A）值，繪制桑黃素標準曲線圖，擬合標準曲線方程為y=0.005 04x+0.047 6。
然后，取負載100.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠5 mg，置于50 mL離心管中，加入40 mL PBS；于恒溫水浴搖床進行緩釋測試，溫度設定為37℃、震蕩速度15 r/min。于震蕩后1、2、3、4、5、6、12、24、48、72、96 h，從管中各取出1 mL溶液，同時補充相同體積PBS。采用酶標儀測量各時間點溶液A值，利用桑黃素標準曲線方程計算桑黃素濃度，繪制累積釋放曲線。實驗重復3次。
1.3 體外細胞實驗
1.3.1 軟骨細胞分離、培養及鑒定
① 軟骨細胞分離及培養：軟骨組織均由2021年1月—6月于我院行關節置換患者自愿捐贈，包括20例因KOA手術者（KOA軟骨組織）以及20例因股骨頸頭下型骨折手術者（正常軟骨組織）。于超凈工作臺切取關節軟骨組織，置于含1%青-鏈霉素雙抗的DMEM-F12培養基保存。實驗前將軟骨組織切成體積為2～3 mm3的碎塊，沖洗干凈后置于培養瓶中；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，于恒溫培養箱中消化30 min，吸棄胰蛋白酶；加入5 mL配置的0.2%Ⅱ型膠原酶/DMEM-F12培養基，于37℃、5%CO2條件下消化12 h；經孔徑為100 μm的濾網過濾；以離心半徑12 cm、1 500 r/min離心5 min；將離心管底部沉淀用含10%FBS的DMEM-F12重懸，反復吹打均勻后置于培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養。每日倒置顯微鏡下觀察細胞形態并隔天換液。待細胞貼壁達80%～90%時進行傳代。取處于對數增長期的第3代細胞進行后續實驗。
② 軟骨細胞鑒定：將KOA軟骨細胞接種至6孔板，每孔1×105個，于37℃、5%CO2條件下培養8 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；待細胞貼壁后換液，此后隔天換液，繼續培養至孔內80%細胞貼壁后進行甲苯胺藍染色。
棄原培養基，PBS洗滌1 min×3次，注意輕柔操作避免細胞脫落；加入4%多聚甲醛，室溫下固定10 min；棄多聚甲醛，加入甲苯胺藍染色液，每孔2 mL；室溫下染色5 min；每孔加入2 mL蒸餾水，輕柔振蕩培養板，混合均勻后繼續染色15 min；吸棄全部染色液，加蒸餾水清洗30 s×2次。每孔加入3 mL蒸餾水以完全浸沒孔底，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
1.3.2 桑黃素細胞毒性檢測
采用CCK-8法檢測桑黃素細胞毒性。取KOA軟骨細胞，采用DMEM-F12培養基制成細胞懸液，接種至96孔板，每孔1×104個細胞。于37℃、5%CO2條件下采用DMEM-F12培養基培養，待軟骨細胞完全貼壁后，吸棄培養基并分為4組，包括對照組以及12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素組，每組3個復孔。其中，對照組加入無血清DMEM-F12培養基，其余組分別加入含對應濃度桑黃素的無血清DMEM-F12培養基。繼續培養24 h后吸棄上清，避光條件下加入CCK-8溶液，每孔100 μL，孵育4 h；于酶標儀波長450 nm處檢測各孔A值。
1.3.3 NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響檢測
取KOA軟骨細胞同上法制成細胞懸液并接種至96孔板，每孔5×103個細胞；將其分為4組，分別為對照組以及負載12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組，每組3個復孔。其中，對照組加入含10%FBS的DMEM-F12培養基，其余組在此基礎上加入負載對應濃度桑黃素的NMCM水凝膠50 μg。于37℃、5%CO2條件下培養24、48、72、96 h后行CCK-8法檢測。
1.3.4 COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察
實驗分為3組，正常軟骨細胞組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+負載50 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組（KOA軟骨細胞+水凝膠組），每組3個復孔。取正常及KOA軟骨細胞，同上法制成細胞懸液后接種至96孔板，每孔1×104個細胞，待細胞貼壁后孵育24 h；KOA軟骨細胞+水凝膠組每孔置入50 μg 水凝膠，其余兩組不作處理；繼續培養24 h后棄上清液及水凝膠，PBS洗滌。室溫下，加入4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗滌5 min×3次；加入0.5%Triton X-100 10 min；吸棄上清液后再次洗滌，37℃封閉1 h；加1 μg/mL COL-Ⅱ一抗，每孔100 μL，置于4℃冰箱過夜；避光條件下加入熒光二抗100 μL，孵育1 h；吸棄二抗后洗滌3次；每孔加入DAPI 100 μL，染色5 min；熒光顯微鏡下觀察染色情況，陽性染色細胞核呈藍色、COL-Ⅱ呈綠色。每組取3個視野，使用熒光酶標儀測算熒光強度值。
1.3.5 活性氧檢測
實驗分為4組，正常對照組、陽性對照組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+負載50 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組（KOA軟骨細胞+水凝膠組），每組3個復孔。取正常及KOA軟骨細胞，同上法制成細胞懸液后接種至6孔板，每孔1×105個細胞。前兩組接種正常軟骨細胞，后兩組接種KOA軟骨細胞，且KOA軟骨細胞+水凝膠組同時加入對應的NMCM水凝膠150 μg。隔天換液，繼續培養。
按照活性氧檢測試劑盒說明書操作。配置2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）溶液，以無血清培養基為溶劑，溶液濃度為10 μmol/L；以同樣比例配置Rosup（活性氧陽性對照）溶液。待細胞長滿孔內80%時原位裝載熒光探針。除陽性對照組每孔加入1.5 mL Rosup溶液外，其余各組每孔加入1.5 mL DCFH-DA溶液。于37℃孵育20 min后洗去多余探針3 min×3次。裝載完成后，將培養板置于熒光酶標儀檢測，選取FITC參數設置進行圖像收集，計算熒光強度值。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 構建大鼠膝關節軟骨損傷模型
將20只大鼠隨機分為實驗組及對照組，每組各10只。兩組腹腔內注射2%戊巴比妥鈉（2.5 mL/kg）麻醉后，固定于手術臺。取右后肢膝關節，于髕韌帶內側縱向弧形切開約1.5 cm，分離各層組織，打開關節囊。將髕骨推向外側滑脫，暴露股骨髁滑車負重區域。用鉆頭在負重區鉆一直徑1 mm、深至軟骨下骨的圓形缺損。實驗組軟骨缺損處注射含25 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠，UV照射30 s 進行交聯；對照組缺損處曠置處理。生理鹽水反復沖洗術區，注意避免水凝膠脫落，逐層縫合關閉切口。
術后傷肢不固定，3 d內每天肌肉注射青霉素1次（10萬U/次）。造模4周后處死全部大鼠進行觀測。
1.4.2 觀測指標
① micro-CT檢測：完整切取大鼠右后肢，置于4%多聚甲醛固定72 h后行micro-CT檢查，條件設定為體素尺寸18 pm、電壓80 kV、電流100 μA、暴露時間15 min。
② 大體及組織學觀察：micro-CT檢測后，以原手術切口入路暴露膝關節，伸直下肢并向外側輕推髕骨，暴露關節面。鈍性分離關節周圍軟組織，剪斷前、后交叉韌帶及內、外側副韌帶，去除軟組織，獲得股骨髁軟骨標本。大體觀察軟骨修復情況，并根據國際軟骨修復協會（ICRS）制定的軟骨修復大體評分系統[15]進行大體評分并分級。
大體觀察后，取兩組部分股骨髁軟骨標本置于4%多聚甲醛固定72 h，10%EDTA溶液脫鈣，當針頭刺入無阻力時結束脫鈣。石蠟包埋、切片，片厚6 μm。取部分切片行番紅-O固綠染色，光鏡下觀察軟骨與軟骨下骨，并根據ICRS軟骨修復組織學評價量表[15]進行組織學評分。取部分切片行COL-Ⅱ免疫組織化學染色，倒置顯微鏡下觀察軟骨組織與軟骨下骨。
③ 實時熒光定量PCR檢測：取兩組部分股骨髁軟骨標本，采用實時熒光定量PCR檢測TNF-α、NF-κB、MMP-13、COL-Ⅱ（COL-2a1）、GAPDH的mRNA表達。按照RNA提取試劑盒說明書提取標本總RNA，以逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。使用Primer5.0軟件選擇引物序列（表1）。反應條件：預變性95℃、30 s，變性60℃、5 s，退火60℃、30 s。以GAPDH為內參，采用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR
④ Western blot檢測：取兩組部分股骨髁軟骨標本，加入RIPA裂解液，4℃條件下裂解1 h，酶標儀測量蛋白濃度。根據BCA蛋白測定結果，向齒槽中加入適量蛋白進行電泳。電泳完成后轉移至聚偏二氟乙烯膜，在搖床上封閉1～2 h，加入TNF-α（1∶500）、NF-κB（1∶500）、MMP-13（1∶500）、COL-Ⅱ（1∶500）一抗，4℃孵育12 h。吸棄一抗，靜置1 h后TBST洗滌10 min×3 次；加入二抗（1∶3 000），4℃孵育2 h。洗滌后置于成像分析儀中成像，Image J軟件分析上述KOA相關標志蛋白及軟骨細胞表型相關蛋白表達情況，以β-actin作為內參，計算目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料進行正態性檢驗，如符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NMCM水凝膠緩釋性能檢測
NMCM水凝膠中桑黃素在早期釋放速度較快，1 h時累積釋放率為12%；24 h開始釋放變緩，96 h時釋放量接近于0，提示藥物釋放達平衡點，此時累積釋放率為88%。累積釋放曲線見圖2。
圖2
NMCM水凝膠累積釋放曲線
Figure2.
Drug release curve of NMCM hydrogel
2.2 體外細胞實驗
2.2.1 軟骨細胞形態觀察及鑒定
培養的KOA軟骨細胞大小均一，呈圓球形；24 h后細胞完全貼壁，狀態良好；4 d后細胞增多，呈不規則排列；8 d后細胞進一步增多，密度增大且分布緊密，貼壁狀態穩定。傳代后軟骨細胞無明顯纖維化，細胞仍呈圓球形。見圖3a～e。甲苯胺藍染色后KOA軟骨細胞形態正常，呈圓球形；細胞質呈紫紅色，細胞核大而圓、染色后呈藍紫色，其中可見正在分裂的細胞，生長情況良好。鑒定結果提示分離培養細胞為軟骨細胞。見圖3f。
圖3
倒置顯微鏡下KOA軟骨細胞形態觀察及鑒定
a～e. 原代細胞培養2 h、8 h、4 d、8 d以及第3代軟骨細胞形態（×100）； f. 甲苯胺藍染色（×40）
Figure3. Morphological observation and identification of KOA chondrocytes under inverted microscopea-e. Morphology observation of primary cells cultured for 2 hours, 8 hours, 4 days, and 8 days and the 3rd generation (×100); f. Toluidine blue staining (×40)
2.2.2 桑黃素細胞毒性檢測
與對照組比較，各濃度桑黃素組A值均增加，提示濃度≤50.0 μmol/L的桑黃素溶液對軟骨細胞無毒性作用。其中12.5、25.0 μmol/L桑黃素組與對照組差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
CCK-8法檢測桑黃素細胞毒性
*與對照組比較
*Compared with the control group,
2.2.3 NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響檢測
培養后各時間點，NMCM水凝膠組A值均較對照組增加（圖5）。其中，24、96 h時各NMCM水凝膠組與對照組差異均有統計學意義（P<0.05）；48、72 h時負載12.5、25.0 μmol/L桑黃素的NMCM水凝膠組與對照組差異有統計學意義（P<0.05）。
圖5
CCK-8法檢測負載不同濃度桑黃素的NMCM水凝膠對軟骨細胞增殖影響
Figure5.
Effect of the NMCM hydrogel loaded with different concentrations of morin on chondrocyte proliferation detected by CCK-8 assay
2.2.4 COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下見各組均呈陽性染色（圖6）。 KOA軟骨細胞組及KOA軟骨細胞+水凝膠組COL-Ⅱ熒光強度值分別為0.06±0.04、0.92±0.03，均低于正常軟骨細胞組（1.00±0.02）；KOA軟骨細胞+水凝膠組高于KOA軟骨細胞組；組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖6
COL-Ⅱ免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
a. 正常軟骨細胞組；b. KOA軟骨細胞組；c. KOA軟骨細胞+水凝膠組
Figure6. Observation of COL-Ⅱ immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)a. Normal chondrocyte group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group
2.2.5 活性氧檢測
正常對照組、陽性對照組、KOA軟骨細胞組、KOA軟骨細胞+水凝膠組熒光強度值分別為1.00±0.01、2.20±0.05、2.04±0.09、1.71±0.06。其中，KOA軟骨細胞組熒光強度值高于正常對照組及KOA軟骨細胞+水凝膠組，KOA軟骨細胞+水凝膠組高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
DCFH-DA探針檢測軟骨細胞活性氧水平（熒光顯微鏡×60）
a. 正常對照組；b. KOA軟骨細胞組；c. KOA軟骨細胞+水凝膠組；d. 陽性對照組
Figure7. The level of ROS in chondrocytes detected by DCFH-DA probe (Fluorescence microscope×60）a. Normal control group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group; d. Positive control group
2.3 動物體內實驗
2.3.1 micro-CT觀察
術后每組各有1只動物造模處感染，排除實驗，兩組各9只納入觀測。術后4周micro-CT觀察示，實驗組關節面粗糙，軟骨缺損仍可見，但關節間隙正常；對照組關節軟骨變薄，關節面與實驗組相比更粗糙，軟骨缺損無修復跡象，關節間隙變窄。見圖8。
圖8
術后4周兩組micro-CT觀察
箭頭示軟骨缺損處 a、b. 實驗組正側位；c、d. 對照組正側位
Figure8. Micro-CT observation of two groups at 4 weeks after operationArrow for the cartilage injury a, b. Anteroposterior and lateral views of the experimental group; c, d. Anteroposterior and lateral views of the control group
2.3.2 大體觀察
術后4周實驗組股骨髁關節面粗糙，NMCM水凝膠已降解，軟骨缺損仍可見，其周圍有組織修復，以纖維組織為主；對照組關節面更粗糙，軟骨缺損未見修復組織。見圖9。實驗組ICRS大體評分為（3.7±0.7）分，高于對照組的（0.9±0.6）分，差異有統計學意義（t=?8.980，P<0.001）。根據ICRS大體評分，實驗組軟骨修復達Ⅲ級5只、Ⅳ級4只；對照組均為Ⅳ級。
圖9
兩組軟骨缺損大體觀察
箭頭示軟骨缺損處 a. 股骨髁軟骨缺損模型；b. 實驗組NMCM水凝膠修復后；c. 術后4周對照組；d. 術后4周實驗組
Figure9. Gross observation of cartilage injury in the two groupsArrow for the cartilage injury a. Femoral condylar cartilage injury model; b. The cartilage injury was repaired with NMCM hydrogel in the experimental group; c. Control group at 4 weeks after operation; d. Experimental group at 4 weeks after operation
2.3.3 組織學觀察
① 番紅-O固綠染色：兩組軟骨與軟骨下骨分界清晰。實驗組軟骨細胞較多，軟骨組織較厚，關節面粗糙；對照組與實驗組相比，關節軟骨變薄，軟骨細胞少，關節面更粗糙，可見軟骨缺損。實驗組ICRS組織學評分為（3.4±0.9）分，高于對照組的（1.8±1.1）分，差異有統計學意義（t=–3.560，P=0.026）。② COL-Ⅱ免疫組織化學染色：兩組染色均呈陽性，但實驗組染色較對照組深。見圖10。
圖10
術后4周兩組組織學觀察（倒置顯微鏡×40）
箭頭示軟骨缺損處 a、b. 實驗組及對照組番紅-O固綠染色；c、d. 實驗組及對照組COL-Ⅱ免疫組織化學染色
Figure10. Histological observation of the two groups at 4 weeks after operation (Inverted microscope×40）Arrow for the cartilage injury a, b. Safranine-O-fast green staining of the experimental and control groups; c, d. COL-Ⅱ immunohistochemistry staining of the experimental and control groups
2.3.4 Western blot及實時定量 PCR檢測
實驗組MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相對表達量均較對照組降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11。
圖11
兩組軟骨組織目的蛋白及基因表達觀測
a. 蛋白電泳圖 1：對照組 2：實驗組 Mr：相對分子質量；b. 目的蛋白相對表達量 *與對照組比較
a. Electrophoregram 1: Control group 2: Experimental group Mr: Relative molecular mass; b. Relative expressions of the targeted proteins *Compared with the control group,
3 討論
KOA最主要的病理改變為軟骨損傷進行性加重，如果能修復填充軟骨缺損，抑制炎癥介質持續破壞軟骨，就能延緩疾病進展。目前，負載治療藥物的緩釋材料為軟骨修復提供了可能[16-18]。
殼聚糖是一種優秀緩釋載體，并且可以通過引入基團進行改性，以改進性能或改變交聯方式[19]。本研究中通過加入甲基丙烯酰酐對殼聚糖進行改性并引入碳點，以降低殼聚糖的分子間作用力，使其具有中性pH環境下的高溶解性。不同于既往研究中復雜的交聯條件或較長的交聯時間，UV交聯殼聚糖能夠在短時間的UV照射下快速交聯，且在負載桑黃素后表現出良好的緩釋性能。我們前期研究表明桑黃素在諸如降低氧化應激水平、抑制炎癥細胞增殖、減輕炎癥反應等方面均有良好表現[4]。但既往關于桑黃素的細胞毒性研究未采用人軟骨細胞，因此未能確定其對于人來源軟骨細胞的毒性，而且桑黃素作用于軟骨細胞的最適濃度缺乏定量實驗支持。本研究結果表明，12.5、25.0、50.0 μmol/L桑黃素溶液均對人軟骨細胞無毒性，而且可促進軟骨細胞增殖。而在細胞增殖實驗中，當桑黃素溶液濃度增加至50 μmol/L時，軟骨細胞增殖速度無顯著增高，提示軟骨細胞增殖能力對較高濃度的桑黃素無濃度依賴性。因此，在進行復合藥物緩釋時，可以選擇濃度較低的桑黃素溶液即可達到理想藥理作用。
在KOA軟骨細胞中活性氧表達水平往往異常升高[20]，其通過多種通路參與軟骨損傷發生，是誘發KOA的重要因素。本研究在殼聚糖加入的碳點中摻有氮元素，其作為電子供體賦予碳點良好的抗氧化功能[21]，配合桑黃素的抗氧化作用，有效降低了KOA軟骨細胞中的活性氧水平，提示桑黃素及碳點具有抗氧化作用，可共同保護軟骨細胞，減少氧化應激損傷。NF-κB是一種與軟骨細胞凋亡緊密相關的信號通路，在KOA發病過程中具有重要作用。TNF-α同時作為NF-κB的上、下游因子，與其構成正反饋環路，放大了促進細胞凋亡的作用。本研究中，桑黃素下調了NF-κB、TNF-α表達水平，且其下游炎癥因子MMP-13水平也下降。COL-Ⅱ作為細胞外基質的重要組成成分，在KOA發生時表達水平顯著降低。本研究結果提示，桑黃素可降低細胞中MMP-13水平，進而減少細胞外基質分解，提高細胞中COL-Ⅱ水平。在細胞免疫熒光染色檢測中同樣發現，負載桑黃素的NMCM水凝膠對軟骨細胞中COL-Ⅱ的正常合成代謝有著積極影響。而在動物體內實驗中，實驗組大鼠膝關節面形態更接近正常，大體評分及組織學評分更高、修復評估分級更高，與上述體外實驗結果一致。
綜上述，碳點UV交聯殼聚糖水凝膠具有優秀的緩釋性能，負載桑黃素后能夠起到保護軟骨細胞的作用。作為一種理想的治療軟骨損傷載藥體系， NMCM水凝膠具有在UV照射下快速交聯、長期緩釋的特點，臨床有望聯合膝關節鏡技術，于微創條件下進行關節內UV照射交聯，為KOA軟骨損傷提供修復基質和緩釋藥物。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院臨床試驗倫理委員會批準（2020HX031），哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物使用與福利倫理審查委員會批準（2022099）；實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2021-004
作者貢獻聲明 曲彥隆：研究設計、修改論文；關正瑞：研究實施、論文撰寫；南飛、劉思遙：數據收集及統計學分析；劉祿萌：文獻整理、行政支持
