引用本文： 趙少華, 菅炎鵬, 王一公, 徐勇, 劉偉杰, 邵欣慰, 樊駿, 徐松山. 具有抗炎作用的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架促進體內軟骨再生研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(1): 91-100. doi: 10.7507/1002-1892.202207114 復制
各種原因如先天性或外傷所致耳、鼻缺損或畸形，關節、氣管、喉等軟骨相關疾病或外傷等造成的軟骨缺損或損傷臨床常見[1]。但軟骨組織體內再生能力有限，臨床上又缺乏理想軟骨移植供體，因此軟骨缺損修復一直是臨床治療難題[2]。軟骨組織工程的迅速發展，為軟骨損傷治療帶來了希望[3-4]。然而，基于組織工程技術構建的軟骨組織植入體內后，會激活先天或后天免疫系統，不可避免地導致實驗動物出現一系列急、慢性免疫炎癥反應[5-6]。炎癥反應過程中產生的大量促炎因子會引起軟骨細胞代謝紊亂，導致軟骨細胞外基質分解，嚴重影響再生軟骨質量[7]。因此，如何有效減輕炎癥反應是促進體內軟骨再生亟待解決的難題[8]。
雙氯芬酸鈉是一種公認的、常用的非甾體類抗炎藥，具有止痛、抗炎和解熱作用，對各種急慢性疼痛和炎癥均具有良好治療效果[9]。雙氯芬酸鈉主要通過阻斷環氧化酶1（cyclooxygenase 1，COX-1）和COX-2抑制前列腺素的合成發揮抗炎作用，其他抗炎機制包括抑制血栓烷-前列腺素受體表達、減少花生四烯酸的釋放和攝取[10]、保護白細胞與內皮細胞相互作用、抑制脂氧合酶以及激活一氧化氮-環鳥苷單磷酸酯抗傷害感受通路等[11]。有研究表明，雙氯芬酸鈉能夠通過促進M2型巨噬細胞極化，來形成抗炎微環境，有助于減輕炎癥和延緩軟骨退化[12]。但口服雙氯芬酸鈉存在嚴重副作用，包括胃腸道、心血管和肝臟等并發癥[13-14]，所以局部使用是更好選擇[15]。
我們設想將雙氯芬酸鈉載入組織工程生物支架材料中植入動物體內，隨著生物材料逐步降解，有望達到局部釋放雙氯芬酸鈉，從而發揮其最佳抗炎功效并保護軟骨組織。鑒于此，本研究制備了載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架，評估其體內外抗炎效果和再生軟骨的可行性，為進一步研究和優化組織工程生物材料負載雙氯芬酸鈉的局部抗炎功效及促進體內軟骨再生能力提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
雌性2月齡新西蘭大白兔6只，體質量2.5～2.8 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供。
明膠（深圳Merck公司）；雙氯芬酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）；RAW264.7巨噬細胞（上海ATCC細胞庫）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、木瓜蛋白酶溶液（Sigma公司，美國）；1%青霉素-鏈霉素、10%FBS、0.15%（W/V）Ⅱ型膠原酶、RPMI 1640培養基（GIBCO公司，美國）；DMEM培養基（HyClone公司，美國）；舒泰TM50（維克公司，法國）；TRIzol裂解試劑和RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（EZbioscience公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、Ⅱ型膠原染色試劑盒、阿爾新藍（pH2.5）顯色試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）。
特制聚己內酯模具（直徑6 mm、厚度2 mm）；DGJ-7C凍干機（上海億倍實業有限公司）；JSM701F掃描電鏡（JEOL公司，日本）；力學測試儀（Instron公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（尼康公司，日本）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Bomem MB-Ⅱ傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，FTIR；斯派克公司，德國）；X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；島津公司，日本）； RT-PCR分析儀（Applied Bio-systems公司，美國）。
1.2 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架制備及表征
1.2.1 支架制備
首先在0.8%（W/V）明膠溶液中加入等體積5 mg/kg雙氯芬酸鈉形成混合溶液，注入模具中并在–20℃先冷凍12 h，隨后凍干72 h制備載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架，作為實驗組；將0.8%（W /V
1.2.2 支架微觀表征
① 孔徑和孔隙率測量：對兩組支架進行真空噴金處理，然后在10 kV加速電壓下，使用掃描電鏡分別觀察兩組支架微觀形貌，并通過Image J軟件對獲取的掃描電鏡圖像進行分析，測量支架孔徑大小。通過液體置換法檢測支架孔隙率（n≥3），具體方法：將干態支架稱重記為W0；將支架浸沒于無水乙醇，置于真空中2 h直至無氣泡產生后取出稱重，記為W1；按以下公式計算支架孔隙率：（W1?W0）/（ρ×V）×100%，其中ρ為無水乙醇在20℃時的密度（0.789 g/mL），V為支架體積。
② 支架的FTIR光譜測定：于Bomem MB-ⅡFTIR光譜儀上分別檢測單純雙氯芬酸鈉、單純明膠多孔支架和載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架的FTIR光譜。另外使用XRD在2θ衍射角（入射X射線的延長線與反射X射線的夾角）的10°～50° 范圍對3種材料進行XRD圖譜分析（工作條件為CuKα輻射，30 kV，20 mA，狹縫為0.3 mm）。
③ 復合支架中雙氯芬酸鈉緩釋曲線測定：將合成的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架加入透析袋（相對分子質量30×103）中。將透析袋置于50 mL PBS（pH7.4），加入1%（V/V）Tween-80，37℃以150 r/min速度攪拌；于0、3、7、11、15、21、30、40 d分別取出2 mL溶液，采用紫外分光光度計檢測波長425 nm下吸光度（A）值。
1.3 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體外性能觀測
1.3.1 支架體外抗炎性能檢測
先用1 μg/mL LPS對RAW264.7巨噬細胞給予炎癥誘導24 h，再將誘導后細胞分別接種于實驗組和對照組支架上，加入含10%FBS、1%抗生素的RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2培養。24 h后收集兩組支架，采用以下方法檢測支架體外抗炎性能：① RT-PCR法檢測RAW264.7巨噬細胞的炎癥相關因子IL-1β和TNF-α表達。使用TRIzol裂解試劑和RNA提取試劑盒分離、純化上述RNA，將獲取的炎癥基因RNA在酶標儀上進行定量檢測，然后按照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說明書，通過RT-PCR分析儀檢測基因表達情況，以GAPDH為內參。最后通過–?Ct法計算IL-1β、TNF-α mRNA相對表達量，所有檢測基因均基于GAPDH進行歸一化處理。引物序列見表1。② 采用ELISA試劑盒測定上清液中IL-1β和TNF-α的含量。③ Western blot檢測：將PMSF（1 mmol/L）與RIPA裂解緩沖液混合，提取兩組RAW264.7巨噬細胞總蛋白；然后用BCA蛋白定量試劑盒計算蛋白含量；利用聚偏氟乙烯膜和SDS-PAGE凝膠電泳，分別呈遞40 ng蛋白；阻斷2 h后，用5%脫脂牛奶與IL-1β（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗在4℃下孵育過夜；TBST洗膜，再用相應二抗室溫下孵化2 h，TBST洗滌后觀察蛋白條帶。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶強度，以與β-actin強度的比值作為目的蛋白相對表達量。
表1
RT-PCR檢測中各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes in RT-PCR detection（5′→3′）
1.3.2 支架細胞相容性檢測
軟骨細胞的獲取和培養：取6只新西蘭大白兔，用舒泰TM50（0.2 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，無菌手術取下兔耳廓軟骨。用含1%青霉素-鏈霉素的PBS沖洗3次后，將耳廓軟骨切成 1 mm×1 mm×1 mm左右的碎塊；然后將軟骨碎塊置于含0.15%Ⅱ型膠原酶的DMEM中，37℃下震蕩消化8 h后，收集消化液，過濾、離心（離心半徑18 cm、1 500 r/min、5 min）后，使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基重懸軟骨細胞，按照1∶3比例傳代至新的培養皿中，隔天換液，當細胞貼壁量接近85%皿底面積時進行傳代，共傳代2次。
將傳代2次的兔軟骨細胞重懸制備細胞懸液（5.0×105個/mL），并均勻接種于兩組支架上構建細胞-支架復合物（n=3），置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養，隔天換液。分別于培養1、4、7 d，通過活/死細胞染色法檢測軟骨細胞在支架中的存活情況，激光共聚焦顯微鏡觀察；采用CCK-8法檢測軟骨細胞活力，使用酶標儀檢測450 nm波長下A值。
1.3.3 體外軟骨再生評價
將兩組細胞-支架復合物在含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中體外培養4周，收集標本進行以下體外軟骨再生評價。① 大體觀察：觀察兩組標本大小、顏色、質地和形狀。② 組織學及免疫組織化學染色分析：將標本置于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，通過HE染色和番紅O染色評價再生軟骨組織和軟骨特異性細胞外基質的生成情況；通過Ⅱ型膠原免疫組織化學染色進一步檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原的表達情況。③ 生化成分分析：將標本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h后，采用阿爾新藍法定量檢測樣本中的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）含量，采用ELISA法測定樣本中Ⅱ型膠原含量。
1.4 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體內軟骨再生及炎癥評價
將6只新西蘭大白兔隨機分為對照組和實驗組（n=3），同1.3.2方法耳緣靜脈注射麻醉后，無菌條件下于背部作一1.5 cm長切口形成腔隙，將體外培養2周的軟骨細胞-支架復合物分別埋入對應組別腔隙，用5-0可吸收縫線縫合。術后動物飼養于清潔環境下，保證其自由活動及充足飲食。4周后通過耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物，收集標本，同上法行大體觀察、HE染色、番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色、ELISA法檢測，觀測支架體內軟骨再生情況；通過免疫組織化學染色法和RT-PCR法檢測炎癥相關基因CD3和CD68（分別是T細胞和巨噬細胞的特異性標志物）的表達（引物序列見表1），評價支架體內炎癥反應。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架制備及表征
實驗組和對照組支架均為白色多孔結構。掃描電鏡觀察示兩組支架均具有明顯的多孔微觀結構，且孔隙間相互連接，分布均勻。定量檢測示實驗組和對照組孔徑分別為（280.86±4.07）、（280.60±4.28）μm，孔隙率分別為87.00%±2.28%、87.80%±3.31%，差異均無統計學意義（t=0.556，P=0.594；t=0.398，P=0.701），雙氯芬酸鈉的引入并不影響支架孔徑和孔隙率。見圖1a～c。
圖1
支架形貌和表征
a. 對照組（左）和實驗組（右）支架大體觀察；b. 對照組（左）和實驗組（右）支架掃描電鏡觀察（×30）；c. 圖b中對照組（左）和實驗組（右）虛線框局部放大（×100）；d. FTIR光譜圖；e. XRD圖譜；f. 明膠支架中雙氯芬酸鈉緩釋曲線
Figure1. Morphology and characterizations of scaffoldsa. Gross observation of scaffolds in control group (left) and experimental group (right); b. Scanning electron microscope observation of scaffolds in control group (left) and experimental group (right) (×30); c. Local enlargement of the dotted box of the control group (left) and experimental group (right) in figure b (×100); d. FTIR spectra; e. XRD pattern; f. Sustained release curve of diclofenac sodium from gelatin scaffold
FTIR紅外光譜顯示雙氯芬酸鈉在1 167 cm?1和682 cm?1處具有芳香-C-C基團的特征峰，在600～800 cm?1的連續區間也可觀察到-C-C基團的存在；而出現1 600～1800 cm?1區域的強峰表明-C=O基團的存在；此外，在1 250、1 283、1 044 cm?1區域出現的峰也證實了-C-O-基團群；在1 603、1 507、869～716 cm?1的特征峰證實了芳香環的存在。以上特征峰提示雙氯芬酸鈉被成功負載至明膠支架上。XRD可明顯展示雙氯芬酸鈉的特征峰，而這些特征峰在載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架的XRD圖譜中明顯減弱或消失，提示雙氯芬酸鈉作為藥物分子成功分散于明膠支架中。見圖1d、e。
體外緩釋實驗顯示雙氯芬酸鈉緩緩從明膠支架中釋放，并且在40 d完全釋放。見圖1f。
2.2 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體外性能觀測
2.2.1 支架體外抗炎性能檢測
RT-PCR檢測示實驗組IL-1β和TNF-α mRNA相對表達量分別為1.953±0.076和2.943±0.125，遠低于對照組的5.230±0.180和8.447±0.176，差異有統計學意義（t=23.760，P<0.001；t=36.110，P<0.001）。
ELISA檢測示IL-1β和TNF-α表達量分別為（3.067±0.818）和（3.033±0.929）pg/mL，遠低于對照組的（6.733±0.464）和（8.200±0.616）pg/mL，差異有統計學意義（t=5.514，P=0.005；t=6.556，P=0.003）。
Western blot檢測示，IL-1β和TNF-α蛋白相對表達量分別為0.447±0.025和0.210±0.016，遠低于對照組的0.730±0.041和0.337±0.012，差異有統計學意義（t=8.375，P=0.001；t=8.718，P=0.001）。見圖2。
圖2
Western blot檢測支架IL-1β、TNF-α蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：對照組 2：實驗組
Figure2. IL-1β and TNF-α proteins expression detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Control group 2: Experimental group
2.2.2 支架細胞相容性檢測
軟骨細胞植入兩組支架材料體外培養1、4、7 d后，活/死細胞染色法檢測示，兩組支架中的軟骨細胞均存活良好（綠色），無明顯細胞死亡情況（紅色）。各時間點兩組支架的活細胞數量接近，且隨培養時間延長，軟骨細胞數量有所增加。CCK-8法檢測示，隨培養時間延長，兩組A值均顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）；各時間點兩組A值差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
支架體外細胞相容性檢測
a、b. 對照組和實驗組活/死細胞染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） 從左至右分別為培養1、4、7 d；c. CCK-8法檢測軟骨細胞體外增殖情況
Figure3. In vitro cytocompatibility evaluation of scaffoldsa, b. Living/dead cells staining observation in control and experimental groups (Laser confocal microscope×40) From left to right for 1, 4, and 7 days after culture, respectively; c. Chondrocyte proliferation detection
2.2.3 體外軟骨再生評價
軟骨細胞種植于支架上體外培養4周后，大體觀察示兩組樣本均能維持圓柱形外觀，且均呈現典型透明果凍樣軟骨組織形貌。HE和番紅O染色示，兩組標本均出現明顯的軟骨陷窩結構和特異性軟骨細胞外基質。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色進一步提示樣本中存在軟骨特異性Ⅱ型膠原沉積。生化定量檢測示，對照組GAG和Ⅱ型膠原含量分別為13.000±0.535、0.147±0.017，實驗組分別為13.200±0.245、0.163±0.021，差異無統計學意義（t=0.480，P=0.656；t=0.884，P=0.427）。見圖4。
圖4
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體外培養4周后軟骨再生評價
a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure4. Cartilage regeneration evaluation after 4 weeks of in vitro culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin-O staining (×40); d. Immunohistochemical collagen typeⅡ staining (×40)
2.3 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體內軟骨再生及炎癥評價
2.3.1 體內軟骨再生評價
軟骨細胞-支架復合物植入兔體內培養4周，大體觀察示兩組樣本均能維持圓柱形外觀，對照組呈淡紅色纖維樣形貌，實驗組呈瓷白色軟骨樣形貌。HE染色和番紅O染色示，對照組標本呈纖維樣組織結構，無典型特異性軟骨組織生成，且出現明顯的炎癥細胞浸潤；實驗組標本顯示明顯的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，且未出現明顯炎癥細胞浸潤。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，對照組樣本中未檢測到軟骨特異性Ⅱ型膠原生成，而實驗組標本顯示明顯的軟骨特異性Ⅱ型膠原成分。生化定量檢測示，實驗組GAG和Ⅱ型膠原含量分別為20.567±0.330、1.370±0.102，明顯高于對照組的7.167±0.464、0.090±0.016，差異有統計學意義（t=33.270，P<0.001；t=17.470，P<0.001）。見圖5。
圖5
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體內培養4周后軟骨再生評價
a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure5. Cartilage regeneration evaluation after 4 weeks of in vivo culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin-O staining (×40); d. Immunohistochemical collagen typeⅡ staining (×40)
2.3.2 炎癥反應檢測
軟骨細胞-支架復合物植入兔體內培養4周，CD3和CD68免疫組織化學染色示，對照組觀察到大量CD3+ 和CD68+ 細胞浸潤，而實驗組只出現少量CD3+ 和CD68+ 細胞。RT-PCR檢測示實驗組CD3和CD68 mRNA相對表達量分別為2.633±0.903、0.967±0.464，明顯低于對照組的10.667±1.700、6.667±1.700，差異有統計學意義（t=5.903，P=0.004；t=4.575，P=0.010）。見圖6。
圖6
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體內培養4周CD3和CD68免疫組織化學染色觀察（×40）
a. CD3；b. CD68
Figure6. CD3 and CD68 immunohistochemical staining observation after 4 weeks of in vivo culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)(×40)a. CD3; b. CD68
3 討論
軟骨組織工程技術的發展為治療軟骨損傷帶來了新的希望。目前組織工程技術通過整合種子細胞、生物支架材料和活性成分，已經能夠在體外和無免疫動物（裸鼠）體內再生出較為理想的軟骨組織[16-17]。然而體外再生的軟骨組織植入具有完善免疫系統的動物（如兔、狗、豬、羊等）體內，往往會引起免疫炎癥反應，導致軟骨細胞凋亡和軟骨特異性細胞外基質吸收[18-19]。主要原因如下：① 軟骨組織植入手術造成的創傷會導致機體應激，引發炎癥反應。② 由于機體與生物材料支架或支架降解產物間的相互作用，會在支架表面形成臨時基質層，進而吸引大量巨噬細胞并釋放一系列炎癥因子，從而引起急性和慢性炎癥反應[20]。③ 體外培養的自體細胞由于傳代次數增加出現不同程度去分化，導致自體免疫錯誤識別為異體細胞而引發排斥反應，從而加劇炎癥細胞浸潤[21]。這種不良炎癥反應嚴重阻礙了組織工程軟骨的進一步臨床轉化，因此如何緩解再生軟骨的體內炎癥反應具有重要臨床意義。
為了緩解再生軟骨的體內炎癥反應，學者們嘗試了一系列方法，比如Shen等[7]通過制備殼核結構的靜電紡絲，利用殼層材料降解的堿性產物中和核層材料降解產生的酸性產物，以調節局部pH值，從而緩解炎癥反應。Liu等[22]通過延長體外培養時間，一方面使軟骨細胞外基質更加成熟來阻隔炎癥因子入侵，另一方面可以使支架材料在體外降解更多，并通過更換培養液排出體外，從而更好地緩解再生軟骨體內炎癥反應。Xu等[23]認為通過電紡膜的致密結構形成物理屏障，可以一定程度阻隔炎癥細胞入侵，從而保護體內再生軟骨組織。另外，Cao等[24]還通過制備去除免疫原性的去端肽膠原來減輕再生軟骨在體內的炎癥反應，以實現促進軟骨缺損修復的作用。上述方法雖然一定程度緩解了體內炎癥反應，但是均未能解決由于手術本身創傷和細胞等原因引起的炎癥反應問題，并不能真正意義上對體內再生軟骨組織形成保護作用。因此，需要研究一種更加通用有效的策略來緩解再生軟骨的體內炎癥反應。
大量研究表明負載生物活性因子或者藥物有望賦予生物支架材料特定功能。徐能[25]將TGF-β1與甲基丙烯酰化明膠水凝膠相結合，成功制備了TGF-β1梯度濃度水凝膠支架，具有良好的細胞相容性，有效促進了細胞增殖；喬永杰等[26]將β-磷酸三鈣填充載藥微球與多孔β-磷酸三鈣支架相結合，成功制備了能夠治療兔感染性骨缺損的生物支架。通過負載抗炎藥物，有望賦予生物支架材料抗炎功能。雙氯芬酸鈉作為一種親水性非甾體類抗炎藥物，在水中溶解度高，與可溶性聚合物的配伍性好，是組織工程支架負載藥物的最佳選擇之一[27]。雙氯芬酸鈉還可以通過抑制白三烯的合成、抑制磷脂酶A2、調節花生四烯酸水平以及刺激外周一氧化氮-環鳥苷單磷酸酯-鉀離子通道等途徑進行抗炎[28-30]。作為臨床常用的經典抗炎藥物，雙氯芬酸鈉具有廣泛而確切的抗炎作用，將其負載于軟骨組織工程支架，有望賦予支架良好抗炎性能。軟骨組織工程支架作為局部植入物，雙氯芬酸鈉混入支架材料中能夠減輕其全身副作用；并且隨著支架材料的逐漸降解，雙氯酚酸鈉可以緩慢釋放，實現局部抗炎作用[31]。
本研究使用明膠作為載體，將雙氯芬酸鈉與明膠均勻混合，采用凍干法制備載藥明膠支架，在保留單純明膠支架優良性能的基礎上，額外賦予了支架抗炎功效。本研究結果表明凍干法制備的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架中，明膠與雙氯芬酸鈉能夠充分混合，這是因為明膠作為常用藥物載體，能夠與其他材料均勻混合且保持性質穩定[32]；而且在明膠支架中加入雙氯芬酸鈉后，并不影響支架的大體形貌、孔徑和孔隙率以及細胞相容性。與LPS預激活的RAW264.7巨噬細胞體外共培養結果顯示，載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架可以明顯抑制巨噬細胞中炎癥相關因子TNF-α和IL-1β的表達。載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架表現出良好的抗炎性能，主要原因在于：① 凍干后的明膠結構穩定，理化性質不會因雙氯芬酸鈉的加入發生明顯變化；② 雙氯芬酸鈉即使在凍干條件下，藥物的化學構型也不會發生改變，抗炎性能不會明顯下降[33]。另外本研究結果表明，載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架在體外具有與單純明膠多孔支架相仿的促軟骨再生能力，說明雙氯芬酸鈉對軟骨再生無明顯抑制作用。
在免疫健全動物體內再生出滿意的軟骨組織一直是研究的難點。本研究動物體內實驗結果顯示，單純明膠多孔支架中CD3和CD68等炎癥細胞表達增加，大體觀察表現為纖維化形貌，說明炎癥反應是造成軟骨破壞的重要因素。雙氯芬酸鈉具有多種抗炎機制[34]，且作為局部抗炎藥物，其安全性已在臨床應用中得到充分驗證[35]。本研究結果顯示，實驗組動物體內軟骨再生效果明顯優于對照組，大體觀察表現為典型的軟骨樣組織，組織學觀察進一步驗證了其良好的軟骨再生效果。更為重要的是，實驗組炎癥反應得到明顯緩解，CD3和CD68表達量顯著低于對照組。以上結果表明雙氯芬酸鈉的載入賦予了明膠支架顯著抗炎效果，為軟骨再生提供了良好的炎癥隔離微環境，可以促進體內軟骨組織再生。
雖然本研究結果表明載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架有良好抗炎作用，能夠有效保證體內軟骨再生，但是在未來的臨床轉化道路上仍有許多困難需要克服。例如，該支架在更大的動物（如羊、狗、豬等）體內是否有同樣的炎癥抑制效果，該載藥明膠支架的載藥劑量需要進一步優化，聯合材料學技術制備良好的藥物緩釋系統有望發揮更加優異和持久的抗炎效果，以及該再生軟骨組織在體內是否能長期穩定維持并最終用于軟骨缺損修復等問題，均需要進一步探索。
綜上述，本研究將雙氯芬酸鈉與明膠相結合，通過凍干法制備的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架具有合適的孔徑、孔隙率、細胞相容性和良好抗炎性能，為軟骨組織工程仿生支架的構建、體內軟骨再生以及最終實現軟骨缺損修復提供了新的思路，具有較大的臨床應用潛能。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 本研究經河南科技大學附屬許昌市中心醫院醫學倫理委員會批準（2020-10-018）；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）-2019-0002
作者貢獻聲明 王一公：研究設計；趙少華、菅炎鵬：研究實施；徐勇、劉偉杰：數據收集整理及統計分析；趙少華：文章撰寫；邵欣慰、樊駿：行政支持；徐松山：經費支持
各種原因如先天性或外傷所致耳、鼻缺損或畸形，關節、氣管、喉等軟骨相關疾病或外傷等造成的軟骨缺損或損傷臨床常見[1]。但軟骨組織體內再生能力有限，臨床上又缺乏理想軟骨移植供體，因此軟骨缺損修復一直是臨床治療難題[2]。軟骨組織工程的迅速發展，為軟骨損傷治療帶來了希望[3-4]。然而，基于組織工程技術構建的軟骨組織植入體內后，會激活先天或后天免疫系統，不可避免地導致實驗動物出現一系列急、慢性免疫炎癥反應[5-6]。炎癥反應過程中產生的大量促炎因子會引起軟骨細胞代謝紊亂，導致軟骨細胞外基質分解，嚴重影響再生軟骨質量[7]。因此，如何有效減輕炎癥反應是促進體內軟骨再生亟待解決的難題[8]。
雙氯芬酸鈉是一種公認的、常用的非甾體類抗炎藥，具有止痛、抗炎和解熱作用，對各種急慢性疼痛和炎癥均具有良好治療效果[9]。雙氯芬酸鈉主要通過阻斷環氧化酶1（cyclooxygenase 1，COX-1）和COX-2抑制前列腺素的合成發揮抗炎作用，其他抗炎機制包括抑制血栓烷-前列腺素受體表達、減少花生四烯酸的釋放和攝取[10]、保護白細胞與內皮細胞相互作用、抑制脂氧合酶以及激活一氧化氮-環鳥苷單磷酸酯抗傷害感受通路等[11]。有研究表明，雙氯芬酸鈉能夠通過促進M2型巨噬細胞極化，來形成抗炎微環境，有助于減輕炎癥和延緩軟骨退化[12]。但口服雙氯芬酸鈉存在嚴重副作用，包括胃腸道、心血管和肝臟等并發癥[13-14]，所以局部使用是更好選擇[15]。
我們設想將雙氯芬酸鈉載入組織工程生物支架材料中植入動物體內，隨著生物材料逐步降解，有望達到局部釋放雙氯芬酸鈉，從而發揮其最佳抗炎功效并保護軟骨組織。鑒于此，本研究制備了載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架，評估其體內外抗炎效果和再生軟骨的可行性，為進一步研究和優化組織工程生物材料負載雙氯芬酸鈉的局部抗炎功效及促進體內軟骨再生能力提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
雌性2月齡新西蘭大白兔6只，體質量2.5～2.8 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供。
明膠（深圳Merck公司）；雙氯芬酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）；RAW264.7巨噬細胞（上海ATCC細胞庫）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、木瓜蛋白酶溶液（Sigma公司，美國）；1%青霉素-鏈霉素、10%FBS、0.15%（W/V）Ⅱ型膠原酶、RPMI 1640培養基（GIBCO公司，美國）；DMEM培養基（HyClone公司，美國）；舒泰TM50（維克公司，法國）；TRIzol裂解試劑和RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（EZbioscience公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、Ⅱ型膠原染色試劑盒、阿爾新藍（pH2.5）顯色試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）。
特制聚己內酯模具（直徑6 mm、厚度2 mm）；DGJ-7C凍干機（上海億倍實業有限公司）；JSM701F掃描電鏡（JEOL公司，日本）；力學測試儀（Instron公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（尼康公司，日本）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Bomem MB-Ⅱ傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，FTIR；斯派克公司，德國）；X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；島津公司，日本）； RT-PCR分析儀（Applied Bio-systems公司，美國）。
1.2 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架制備及表征
1.2.1 支架制備
首先在0.8%（W/V）明膠溶液中加入等體積5 mg/kg雙氯芬酸鈉形成混合溶液，注入模具中并在–20℃先冷凍12 h，隨后凍干72 h制備載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架，作為實驗組；將0.8%（W /V
1.2.2 支架微觀表征
① 孔徑和孔隙率測量：對兩組支架進行真空噴金處理，然后在10 kV加速電壓下，使用掃描電鏡分別觀察兩組支架微觀形貌，并通過Image J軟件對獲取的掃描電鏡圖像進行分析，測量支架孔徑大小。通過液體置換法檢測支架孔隙率（n≥3），具體方法：將干態支架稱重記為W0；將支架浸沒于無水乙醇，置于真空中2 h直至無氣泡產生后取出稱重，記為W1；按以下公式計算支架孔隙率：（W1?W0）/（ρ×V）×100%，其中ρ為無水乙醇在20℃時的密度（0.789 g/mL），V為支架體積。
② 支架的FTIR光譜測定：于Bomem MB-ⅡFTIR光譜儀上分別檢測單純雙氯芬酸鈉、單純明膠多孔支架和載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架的FTIR光譜。另外使用XRD在2θ衍射角（入射X射線的延長線與反射X射線的夾角）的10°～50° 范圍對3種材料進行XRD圖譜分析（工作條件為CuKα輻射，30 kV，20 mA，狹縫為0.3 mm）。
③ 復合支架中雙氯芬酸鈉緩釋曲線測定：將合成的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架加入透析袋（相對分子質量30×103）中。將透析袋置于50 mL PBS（pH7.4），加入1%（V/V）Tween-80，37℃以150 r/min速度攪拌；于0、3、7、11、15、21、30、40 d分別取出2 mL溶液，采用紫外分光光度計檢測波長425 nm下吸光度（A）值。
1.3 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體外性能觀測
1.3.1 支架體外抗炎性能檢測
先用1 μg/mL LPS對RAW264.7巨噬細胞給予炎癥誘導24 h，再將誘導后細胞分別接種于實驗組和對照組支架上，加入含10%FBS、1%抗生素的RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2培養。24 h后收集兩組支架，采用以下方法檢測支架體外抗炎性能：① RT-PCR法檢測RAW264.7巨噬細胞的炎癥相關因子IL-1β和TNF-α表達。使用TRIzol裂解試劑和RNA提取試劑盒分離、純化上述RNA，將獲取的炎癥基因RNA在酶標儀上進行定量檢測，然后按照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說明書，通過RT-PCR分析儀檢測基因表達情況，以GAPDH為內參。最后通過–?Ct法計算IL-1β、TNF-α mRNA相對表達量，所有檢測基因均基于GAPDH進行歸一化處理。引物序列見表1。② 采用ELISA試劑盒測定上清液中IL-1β和TNF-α的含量。③ Western blot檢測：將PMSF（1 mmol/L）與RIPA裂解緩沖液混合，提取兩組RAW264.7巨噬細胞總蛋白；然后用BCA蛋白定量試劑盒計算蛋白含量；利用聚偏氟乙烯膜和SDS-PAGE凝膠電泳，分別呈遞40 ng蛋白；阻斷2 h后，用5%脫脂牛奶與IL-1β（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗在4℃下孵育過夜；TBST洗膜，再用相應二抗室溫下孵化2 h，TBST洗滌后觀察蛋白條帶。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶強度，以與β-actin強度的比值作為目的蛋白相對表達量。
表1
RT-PCR檢測中各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes in RT-PCR detection（5′→3′）
1.3.2 支架細胞相容性檢測
軟骨細胞的獲取和培養：取6只新西蘭大白兔，用舒泰TM50（0.2 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，無菌手術取下兔耳廓軟骨。用含1%青霉素-鏈霉素的PBS沖洗3次后，將耳廓軟骨切成 1 mm×1 mm×1 mm左右的碎塊；然后將軟骨碎塊置于含0.15%Ⅱ型膠原酶的DMEM中，37℃下震蕩消化8 h后，收集消化液，過濾、離心（離心半徑18 cm、1 500 r/min、5 min）后，使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基重懸軟骨細胞，按照1∶3比例傳代至新的培養皿中，隔天換液，當細胞貼壁量接近85%皿底面積時進行傳代，共傳代2次。
將傳代2次的兔軟骨細胞重懸制備細胞懸液（5.0×105個/mL），并均勻接種于兩組支架上構建細胞-支架復合物（n=3），置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養，隔天換液。分別于培養1、4、7 d，通過活/死細胞染色法檢測軟骨細胞在支架中的存活情況，激光共聚焦顯微鏡觀察；采用CCK-8法檢測軟骨細胞活力，使用酶標儀檢測450 nm波長下A值。
1.3.3 體外軟骨再生評價
將兩組細胞-支架復合物在含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中體外培養4周，收集標本進行以下體外軟骨再生評價。① 大體觀察：觀察兩組標本大小、顏色、質地和形狀。② 組織學及免疫組織化學染色分析：將標本置于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，通過HE染色和番紅O染色評價再生軟骨組織和軟骨特異性細胞外基質的生成情況；通過Ⅱ型膠原免疫組織化學染色進一步檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原的表達情況。③ 生化成分分析：將標本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h后，采用阿爾新藍法定量檢測樣本中的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）含量，采用ELISA法測定樣本中Ⅱ型膠原含量。
1.4 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體內軟骨再生及炎癥評價
將6只新西蘭大白兔隨機分為對照組和實驗組（n=3），同1.3.2方法耳緣靜脈注射麻醉后，無菌條件下于背部作一1.5 cm長切口形成腔隙，將體外培養2周的軟骨細胞-支架復合物分別埋入對應組別腔隙，用5-0可吸收縫線縫合。術后動物飼養于清潔環境下，保證其自由活動及充足飲食。4周后通過耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物，收集標本，同上法行大體觀察、HE染色、番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色、ELISA法檢測，觀測支架體內軟骨再生情況；通過免疫組織化學染色法和RT-PCR法檢測炎癥相關基因CD3和CD68（分別是T細胞和巨噬細胞的特異性標志物）的表達（引物序列見表1），評價支架體內炎癥反應。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架制備及表征
實驗組和對照組支架均為白色多孔結構。掃描電鏡觀察示兩組支架均具有明顯的多孔微觀結構，且孔隙間相互連接，分布均勻。定量檢測示實驗組和對照組孔徑分別為（280.86±4.07）、（280.60±4.28）μm，孔隙率分別為87.00%±2.28%、87.80%±3.31%，差異均無統計學意義（t=0.556，P=0.594；t=0.398，P=0.701），雙氯芬酸鈉的引入并不影響支架孔徑和孔隙率。見圖1a～c。
圖1
支架形貌和表征
a. 對照組（左）和實驗組（右）支架大體觀察；b. 對照組（左）和實驗組（右）支架掃描電鏡觀察（×30）；c. 圖b中對照組（左）和實驗組（右）虛線框局部放大（×100）；d. FTIR光譜圖；e. XRD圖譜；f. 明膠支架中雙氯芬酸鈉緩釋曲線
Figure1. Morphology and characterizations of scaffoldsa. Gross observation of scaffolds in control group (left) and experimental group (right); b. Scanning electron microscope observation of scaffolds in control group (left) and experimental group (right) (×30); c. Local enlargement of the dotted box of the control group (left) and experimental group (right) in figure b (×100); d. FTIR spectra; e. XRD pattern; f. Sustained release curve of diclofenac sodium from gelatin scaffold
FTIR紅外光譜顯示雙氯芬酸鈉在1 167 cm?1和682 cm?1處具有芳香-C-C基團的特征峰，在600～800 cm?1的連續區間也可觀察到-C-C基團的存在；而出現1 600～1800 cm?1區域的強峰表明-C=O基團的存在；此外，在1 250、1 283、1 044 cm?1區域出現的峰也證實了-C-O-基團群；在1 603、1 507、869～716 cm?1的特征峰證實了芳香環的存在。以上特征峰提示雙氯芬酸鈉被成功負載至明膠支架上。XRD可明顯展示雙氯芬酸鈉的特征峰，而這些特征峰在載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架的XRD圖譜中明顯減弱或消失，提示雙氯芬酸鈉作為藥物分子成功分散于明膠支架中。見圖1d、e。
體外緩釋實驗顯示雙氯芬酸鈉緩緩從明膠支架中釋放，并且在40 d完全釋放。見圖1f。
2.2 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體外性能觀測
2.2.1 支架體外抗炎性能檢測
RT-PCR檢測示實驗組IL-1β和TNF-α mRNA相對表達量分別為1.953±0.076和2.943±0.125，遠低于對照組的5.230±0.180和8.447±0.176，差異有統計學意義（t=23.760，P<0.001；t=36.110，P<0.001）。
ELISA檢測示IL-1β和TNF-α表達量分別為（3.067±0.818）和（3.033±0.929）pg/mL，遠低于對照組的（6.733±0.464）和（8.200±0.616）pg/mL，差異有統計學意義（t=5.514，P=0.005；t=6.556，P=0.003）。
Western blot檢測示，IL-1β和TNF-α蛋白相對表達量分別為0.447±0.025和0.210±0.016，遠低于對照組的0.730±0.041和0.337±0.012，差異有統計學意義（t=8.375，P=0.001；t=8.718，P=0.001）。見圖2。
圖2
Western blot檢測支架IL-1β、TNF-α蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：對照組 2：實驗組
Figure2. IL-1β and TNF-α proteins expression detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Control group 2: Experimental group
2.2.2 支架細胞相容性檢測
軟骨細胞植入兩組支架材料體外培養1、4、7 d后，活/死細胞染色法檢測示，兩組支架中的軟骨細胞均存活良好（綠色），無明顯細胞死亡情況（紅色）。各時間點兩組支架的活細胞數量接近，且隨培養時間延長，軟骨細胞數量有所增加。CCK-8法檢測示，隨培養時間延長，兩組A值均顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）；各時間點兩組A值差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
支架體外細胞相容性檢測
a、b. 對照組和實驗組活/死細胞染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） 從左至右分別為培養1、4、7 d；c. CCK-8法檢測軟骨細胞體外增殖情況
Figure3. In vitro cytocompatibility evaluation of scaffoldsa, b. Living/dead cells staining observation in control and experimental groups (Laser confocal microscope×40) From left to right for 1, 4, and 7 days after culture, respectively; c. Chondrocyte proliferation detection
2.2.3 體外軟骨再生評價
軟骨細胞種植于支架上體外培養4周后，大體觀察示兩組樣本均能維持圓柱形外觀，且均呈現典型透明果凍樣軟骨組織形貌。HE和番紅O染色示，兩組標本均出現明顯的軟骨陷窩結構和特異性軟骨細胞外基質。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色進一步提示樣本中存在軟骨特異性Ⅱ型膠原沉積。生化定量檢測示，對照組GAG和Ⅱ型膠原含量分別為13.000±0.535、0.147±0.017，實驗組分別為13.200±0.245、0.163±0.021，差異無統計學意義（t=0.480，P=0.656；t=0.884，P=0.427）。見圖4。
圖4
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體外培養4周后軟骨再生評價
a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure4. Cartilage regeneration evaluation after 4 weeks of in vitro culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin-O staining (×40); d. Immunohistochemical collagen typeⅡ staining (×40)
2.3 載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架體內軟骨再生及炎癥評價
2.3.1 體內軟骨再生評價
軟骨細胞-支架復合物植入兔體內培養4周，大體觀察示兩組樣本均能維持圓柱形外觀，對照組呈淡紅色纖維樣形貌，實驗組呈瓷白色軟骨樣形貌。HE染色和番紅O染色示，對照組標本呈纖維樣組織結構，無典型特異性軟骨組織生成，且出現明顯的炎癥細胞浸潤；實驗組標本顯示明顯的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，且未出現明顯炎癥細胞浸潤。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，對照組樣本中未檢測到軟骨特異性Ⅱ型膠原生成，而實驗組標本顯示明顯的軟骨特異性Ⅱ型膠原成分。生化定量檢測示，實驗組GAG和Ⅱ型膠原含量分別為20.567±0.330、1.370±0.102，明顯高于對照組的7.167±0.464、0.090±0.016，差異有統計學意義（t=33.270，P<0.001；t=17.470，P<0.001）。見圖5。
圖5
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體內培養4周后軟骨再生評價
a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure5. Cartilage regeneration evaluation after 4 weeks of in vivo culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin-O staining (×40); d. Immunohistochemical collagen typeⅡ staining (×40)
2.3.2 炎癥反應檢測
軟骨細胞-支架復合物植入兔體內培養4周，CD3和CD68免疫組織化學染色示，對照組觀察到大量CD3+ 和CD68+ 細胞浸潤，而實驗組只出現少量CD3+ 和CD68+ 細胞。RT-PCR檢測示實驗組CD3和CD68 mRNA相對表達量分別為2.633±0.903、0.967±0.464，明顯低于對照組的10.667±1.700、6.667±1.700，差異有統計學意義（t=5.903，P=0.004；t=4.575，P=0.010）。見圖6。
圖6
對照組（上）和實驗組（下）軟骨細胞-支架復合物體內培養4周CD3和CD68免疫組織化學染色觀察（×40）
a. CD3；b. CD68
Figure6. CD3 and CD68 immunohistochemical staining observation after 4 weeks of in vivo culture of chondrocyte-scaffold composites in control group (upper) and experimental group (lower)(×40)a. CD3; b. CD68
3 討論
軟骨組織工程技術的發展為治療軟骨損傷帶來了新的希望。目前組織工程技術通過整合種子細胞、生物支架材料和活性成分，已經能夠在體外和無免疫動物（裸鼠）體內再生出較為理想的軟骨組織[16-17]。然而體外再生的軟骨組織植入具有完善免疫系統的動物（如兔、狗、豬、羊等）體內，往往會引起免疫炎癥反應，導致軟骨細胞凋亡和軟骨特異性細胞外基質吸收[18-19]。主要原因如下：① 軟骨組織植入手術造成的創傷會導致機體應激，引發炎癥反應。② 由于機體與生物材料支架或支架降解產物間的相互作用，會在支架表面形成臨時基質層，進而吸引大量巨噬細胞并釋放一系列炎癥因子，從而引起急性和慢性炎癥反應[20]。③ 體外培養的自體細胞由于傳代次數增加出現不同程度去分化，導致自體免疫錯誤識別為異體細胞而引發排斥反應，從而加劇炎癥細胞浸潤[21]。這種不良炎癥反應嚴重阻礙了組織工程軟骨的進一步臨床轉化，因此如何緩解再生軟骨的體內炎癥反應具有重要臨床意義。
為了緩解再生軟骨的體內炎癥反應，學者們嘗試了一系列方法，比如Shen等[7]通過制備殼核結構的靜電紡絲，利用殼層材料降解的堿性產物中和核層材料降解產生的酸性產物，以調節局部pH值，從而緩解炎癥反應。Liu等[22]通過延長體外培養時間，一方面使軟骨細胞外基質更加成熟來阻隔炎癥因子入侵，另一方面可以使支架材料在體外降解更多，并通過更換培養液排出體外，從而更好地緩解再生軟骨體內炎癥反應。Xu等[23]認為通過電紡膜的致密結構形成物理屏障，可以一定程度阻隔炎癥細胞入侵，從而保護體內再生軟骨組織。另外，Cao等[24]還通過制備去除免疫原性的去端肽膠原來減輕再生軟骨在體內的炎癥反應，以實現促進軟骨缺損修復的作用。上述方法雖然一定程度緩解了體內炎癥反應，但是均未能解決由于手術本身創傷和細胞等原因引起的炎癥反應問題，并不能真正意義上對體內再生軟骨組織形成保護作用。因此，需要研究一種更加通用有效的策略來緩解再生軟骨的體內炎癥反應。
大量研究表明負載生物活性因子或者藥物有望賦予生物支架材料特定功能。徐能[25]將TGF-β1與甲基丙烯酰化明膠水凝膠相結合，成功制備了TGF-β1梯度濃度水凝膠支架，具有良好的細胞相容性，有效促進了細胞增殖；喬永杰等[26]將β-磷酸三鈣填充載藥微球與多孔β-磷酸三鈣支架相結合，成功制備了能夠治療兔感染性骨缺損的生物支架。通過負載抗炎藥物，有望賦予生物支架材料抗炎功能。雙氯芬酸鈉作為一種親水性非甾體類抗炎藥物，在水中溶解度高，與可溶性聚合物的配伍性好，是組織工程支架負載藥物的最佳選擇之一[27]。雙氯芬酸鈉還可以通過抑制白三烯的合成、抑制磷脂酶A2、調節花生四烯酸水平以及刺激外周一氧化氮-環鳥苷單磷酸酯-鉀離子通道等途徑進行抗炎[28-30]。作為臨床常用的經典抗炎藥物，雙氯芬酸鈉具有廣泛而確切的抗炎作用，將其負載于軟骨組織工程支架，有望賦予支架良好抗炎性能。軟骨組織工程支架作為局部植入物，雙氯芬酸鈉混入支架材料中能夠減輕其全身副作用；并且隨著支架材料的逐漸降解，雙氯酚酸鈉可以緩慢釋放，實現局部抗炎作用[31]。
本研究使用明膠作為載體，將雙氯芬酸鈉與明膠均勻混合，采用凍干法制備載藥明膠支架，在保留單純明膠支架優良性能的基礎上，額外賦予了支架抗炎功效。本研究結果表明凍干法制備的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架中，明膠與雙氯芬酸鈉能夠充分混合，這是因為明膠作為常用藥物載體，能夠與其他材料均勻混合且保持性質穩定[32]；而且在明膠支架中加入雙氯芬酸鈉后，并不影響支架的大體形貌、孔徑和孔隙率以及細胞相容性。與LPS預激活的RAW264.7巨噬細胞體外共培養結果顯示，載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架可以明顯抑制巨噬細胞中炎癥相關因子TNF-α和IL-1β的表達。載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架表現出良好的抗炎性能，主要原因在于：① 凍干后的明膠結構穩定，理化性質不會因雙氯芬酸鈉的加入發生明顯變化；② 雙氯芬酸鈉即使在凍干條件下，藥物的化學構型也不會發生改變，抗炎性能不會明顯下降[33]。另外本研究結果表明，載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架在體外具有與單純明膠多孔支架相仿的促軟骨再生能力，說明雙氯芬酸鈉對軟骨再生無明顯抑制作用。
在免疫健全動物體內再生出滿意的軟骨組織一直是研究的難點。本研究動物體內實驗結果顯示，單純明膠多孔支架中CD3和CD68等炎癥細胞表達增加，大體觀察表現為纖維化形貌，說明炎癥反應是造成軟骨破壞的重要因素。雙氯芬酸鈉具有多種抗炎機制[34]，且作為局部抗炎藥物，其安全性已在臨床應用中得到充分驗證[35]。本研究結果顯示，實驗組動物體內軟骨再生效果明顯優于對照組，大體觀察表現為典型的軟骨樣組織，組織學觀察進一步驗證了其良好的軟骨再生效果。更為重要的是，實驗組炎癥反應得到明顯緩解，CD3和CD68表達量顯著低于對照組。以上結果表明雙氯芬酸鈉的載入賦予了明膠支架顯著抗炎效果，為軟骨再生提供了良好的炎癥隔離微環境，可以促進體內軟骨組織再生。
雖然本研究結果表明載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架有良好抗炎作用，能夠有效保證體內軟骨再生，但是在未來的臨床轉化道路上仍有許多困難需要克服。例如，該支架在更大的動物（如羊、狗、豬等）體內是否有同樣的炎癥抑制效果，該載藥明膠支架的載藥劑量需要進一步優化，聯合材料學技術制備良好的藥物緩釋系統有望發揮更加優異和持久的抗炎效果，以及該再生軟骨組織在體內是否能長期穩定維持并最終用于軟骨缺損修復等問題，均需要進一步探索。
綜上述，本研究將雙氯芬酸鈉與明膠相結合，通過凍干法制備的載雙氯芬酸鈉明膠多孔支架具有合適的孔徑、孔隙率、細胞相容性和良好抗炎性能，為軟骨組織工程仿生支架的構建、體內軟骨再生以及最終實現軟骨缺損修復提供了新的思路，具有較大的臨床應用潛能。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 本研究經河南科技大學附屬許昌市中心醫院醫學倫理委員會批準（2020-10-018）；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）-2019-0002
作者貢獻聲明 王一公：研究設計；趙少華、菅炎鵬：研究實施；徐勇、劉偉杰：數據收集整理及統計分析；趙少華：文章撰寫；邵欣慰、樊駿：行政支持；徐松山：經費支持
