引用本文： 何樹坤, 秦廷武. 肩袖損傷修復的界面組織工程研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(10): 1341-1351. doi: 10.7507/1002-1892.202104064 復制
肩袖損傷是導致肩關節持續性疼痛和功能障礙的主要原因之一，其發病率為 5%～40%，50 歲以上人群高達 50%[1-2]。目前研究發現肩袖損傷有以下幾種發病機制：一是存在解剖異常（例如肩峰撞擊綜合征），岡上肌經常受到肩峰和喙肩韌帶擠壓，進而導致水腫斷裂等病理變化[3]；二是存在慢性炎癥，炎癥能使岡上肌腱的超微結構發生改變，進而導致肌腱鈣化斷裂等[4]；三是存在其他危險因素，包括吸煙[5]、基質金屬蛋白酶功能活躍[6]和基因表達改變[7]等。對于保守治療失敗和不適合保守治療的患者，手術修復是一種有效手段，然而系統評價結果顯示肩袖修復術后平均不愈合率為 26.6%，并且大型（3～5 cm）和巨大型（>5 cm）肩袖撕裂患者術后再斷裂率高達 79%[8-9]。研究發現影響術后肩袖是否再斷裂的因素有很多，包括年齡、肌腱質量、骨密度、肌肉萎縮程度、脂肪浸潤程度、撕裂大小和病程長短等[10-12]。
為了更好地了解肩袖損傷修復術后再斷裂原因，我們首先要了解肩袖的正常結構以及肩袖損傷部位特點。正常肩袖是由岡上肌、岡下肌、小圓肌和肩胛下肌組成，這些肌肉均起于肩胛骨，而肌腱則匯合成一個薄片即肩袖，最終止于肱骨大、小結節，其功能是維持肩關節穩定和協助完成肩關節的內、外旋和外展運動[13]。岡上肌腱因其特殊的解剖位置和止點處缺少血供的生理特點，是肩袖中最容易發生損傷的肌腱[14]，其最常斷裂部位是肌腱和骨之間的連接處即腱骨界面，并且肩袖修復術后腱骨界面不愈合是導致手術失敗的主要原因之一[15]。腱骨界面是一個包括肌腱、纖維軟骨、礦化纖維軟骨和骨 4 種不同類型組織的不均勻區域，是一個細胞、結構組成以及力學性能各異的部位[16]。其中，肌腱細胞分布在含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的肌腱組織內；纖維軟骨細胞則沿著膠原纖維的長軸排列，分布在含有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型和Ⅹ型膠原蛋白的非礦化纖維軟骨區域；而含有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的礦化纖維軟骨中可見肥大軟骨細胞，且呈柱狀排列；最后，含有Ⅰ型膠原蛋白的骨中可見成骨細胞、骨細胞和破骨細胞。除此之外，各個區域中礦物質含量和蛋白多糖種類也各有不同，而這種天然的異質性導致此界面組織的力學和生物學特性發生變化，有效降低了應力集中，允許載荷從肌腱或韌帶轉移到骨骼中[17-18]。
近年來，界面組織工程研究的出現給腱骨界面修復和再生帶來新的機遇，該研究旨在通過多種方法重建復雜的、層次分明的界面組織，修復或再生受損的不同組織連接部位[19]。界面組織工程主要由種子細胞、生長因子、生物材料三要素構成。種子細胞是源頭，即細胞通過遷移、黏附、增殖和分化等行為來實現缺損組織的再生；生長因子是調控，即因子通過作用于特定的信號通路來調控細胞的多種行為；生物材料是橋梁，即材料一方面可以為種子細胞提供適當的生長環境，另一方面可以為生長因子提供載體。除了上述三要素，適宜的氧濃度和力學刺激也會影響細胞的生物學行為和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積等[20-21]。見表 1。本文擬從上述方面對肩袖損傷修復的界面組織工程研究進展進行綜述。
表1
肩袖損傷修復的界面組織工程進展
Table1.
Research progress of interfacial tissue engineering in rotator cuff repair
1 種子細胞
目前用于界面組織工程的種子細胞類型包括干細胞和終末分化細胞，細胞培養策略則包括單獨培養和共培養，最佳的細胞來源以及共培養中合適的細胞比例仍在探索中。
1.1 單獨培養
單獨培養研究主要集中在干細胞方面，相對于終末分化細胞，干細胞具有自我復制能力以及向不同譜系細胞分化的能力，目前研究較多的是 BMSCs 和脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。
BMSCs 是目前研究最為廣泛的一種干細胞，來源于骨髓，參與肩袖腱骨界面的修復和再生。在動物實驗方面，Lim 等[22]用包含 BMSCs 的纖維蛋白膠包裹自體肌腱重建兔前交叉韌帶，術后實驗組可觀察到成熟的軟骨區存在，且力學性能顯著提高。Kida 等[23]通過轉孔的方法將肩袖止點的自體 BMSCs 應用于大鼠岡上肌腱止點修復，術后發現轉孔組腱骨界面力學性能更好。在臨床試驗方面，Hernigou 等[24]設計了病例對照研究，觀察注射 BMSCs 能否提高肩袖損傷修復效果，結果發現注射組患者術后 6 個月和 10 年的肩袖損傷愈合率均高于對照組。其他研究也同樣表明 BMSCs 的應用能改善腱骨界面的力學性能[25-26]。然而有學者發現在修復大鼠肩袖腱骨界面實驗中，單獨應用 BMSCs 并未促進腱骨界面的愈合或提高界面的力學強度[27]。因此在后續研究中，該團隊通過腺病毒轉染制備了 SCX（scleraxis）和膜型基質金屬蛋白酶 1（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）過表達的 BMSCs 用于腱骨界面修復，結果發現過表達組存在更多新生纖維軟骨組織和更高力學強度[28-29]。同時，其他學者通過編碼 shRNA 的腺病毒制備了 TOB1（transducer of ERBB2.1）缺陷的 BMSCs 用于大鼠肩袖損傷修復，結果發現實驗組存在更多纖維軟骨和Ⅱ型膠原，并且腱骨界面力學強度更好[30]。然而有學者發現，BMP-13 過表達的 BMSCs 未能促進腱骨界面愈合[31]。上述研究說明 BMSCs 可能需要特定的誘導才能發揮其促進肩袖腱骨界面損傷修復的作用。
盡管 ADSCs 未直接參與肩袖腱骨界面的修復，但其來源廣泛、相關并發癥少，并且也具有成骨、成軟骨和成肌腱等多向分化潛能，因此 ADSCs 也是有研究前景的干細胞之一[32-33]。在動物實驗方面，Oh 等[34]使用 ADSCs 修復兔肩胛下肌腱損傷，結果發現局部注射 ADSCs 能夠改善肩袖損傷后的肌肉功能和促進肌腱愈合，并減少脂肪浸潤。Kosaka 等[35]將 ADSCs 局部注射至兔前交叉韌帶重建模型中，同樣促進了肌腱-骨的整合。在臨床試驗方面，Kim 等[36]設計了隊列研究觀察注射含 ADSCs 的纖維蛋白膠能否提高關節鏡術后肩袖損傷修復效果，結果發現相比于對照組，注射組患者術后肩袖再斷裂率明顯降低。Jo 等[37]對比了不同注射濃度 ADSCs 的安全性和有效性，術后 2 年隨訪結果發現，注射高濃度（1×108 個）ADSCs 不會出現相關并發癥，并且能夠減輕疼痛，改善肩袖肌肉力量和提高肩關節臨床功能評分。其他研究也同樣表明 ADSCs 能促進腱骨界面損傷的修復再生[38-40]。
除了上述兩種干細胞，近年來學者們發現肌腱來源干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）[41]、韌帶來源干細胞[42]、滑膜來源干細胞[43]、骨膜來源干細胞[44]和尿源性干細胞[45]在腱骨界面修復中也顯示出巨大潛能。
1.2 共培養
由于腱骨界面包含細胞種類較多，相對于單一細胞研究，研究細胞間的共培養能夠了解腱骨界面的發育和修復過程，因此共培養策略的研究與應用尤為重要。目前，界面組織工程中共培養策略分為直接接觸共培養和間接接觸或非接觸共培養，所選細胞則分為終末分化細胞間的共培養和終末分化細胞與干細胞間的共培養[46]。直接接觸共培養存在細胞與細胞間相互作用、旁分泌因子對細胞的作用以及細胞與 ECM 間的作用，機制研究較為困難。而間接接觸或非接觸共培養的細胞由多孔膜分離，可以單獨研究旁分泌因子對細胞的作用或 ECM 對細胞的作用[46]。對于終末分化細胞間的共培養，Wang 等[47]利用直接接觸共培養模型研究了成骨細胞和成纖維細胞之間的相互作用，在培養過程中兩種細胞能夠遷移并相互作用形成 3 個不同區域：成纖維細胞區、成纖維細胞+成骨細胞區和成骨細胞區。該研究發現成纖維細胞的 ALP 活性和礦化可能受到成骨細胞的影響；此外，相對于兩側區域細胞，中間區域細胞的Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）和軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）基因表達水平上調。Cooper 等[48]通過調整培養基的組成成分共培養了 NIH-3T3 成纖維細胞系和 MC-3T3 成骨細胞系，從而制備出具有 3 個不同區域的支架來模擬腱骨界面的天然結構。對于終末分化細胞與干細胞間的共培養，He 等[49]在絲素蛋白-羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架上共培養兔成纖維細胞、BMSCs 和成骨細胞，將支架分為 4 個不同區域：成纖維細胞區、成纖維細胞+BMSCs 區、成骨細胞+BMSCs 區、成骨細胞區，結果發現 BMSCs 與成骨細胞和成纖維細胞共培養時向纖維軟骨細胞系分化。Calejo 等[50]發現基礎培養基和成骨誘導培養基不同混合比例會影響人肌腱來源細胞和前成骨細胞共培養時的基因表達，成骨誘導培養基比例提高能夠顯著增強共培養細胞的 ALP 表達、礦物沉積以及成軟骨相關標志物（ACAN 和 COMP）表達，同時使人肌腱來源細胞表型發生成骨轉化。Lyu 等[51]設計了一種樹形微流體裝置，該裝置可以將普通培養基和成骨誘導培養基合并成具有梯度濃度比例的混合液，從而誘導接種于脫細胞肌腱片上的 BMSCs 和 TDSCs 向成骨、成軟骨及成肌腱方向分化，最終在材料表面形成 3 個不同區域，大鼠跟腱缺損修復研究結果表明，該裝置所制備的新型材料能夠促進腱骨界面愈合。
盡管前期研究已揭示出肌腱和骨組織中的細胞類型，但位于腱骨界面的細胞呈現出與上述兩種細胞不同的特征。既往研究通過轉錄組學和蛋白質組學結果揭示出腱骨界面細胞表達軟骨相關標記物（包括 ACAN、軟骨黏附素、Ⅱ型膠原等）以及終末分化的肥大樣軟骨細胞標記物 ［例如 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2），整合素結合唾液蛋白和基質金屬蛋白酶 13（matrix metal proteinase 13，MMP-13）等］，從而提示該類型細胞屬于軟骨細胞樣表型[52]。然而迄今為止，由于缺少針對腱骨界面細胞亞群的單細胞測序研究，我們對于腱骨界面發育和再生的機制仍缺乏了解，而共培養是研究體外細胞相互作用的重要方法，因此下一步應通過模擬腱骨界面處的微環境，研究多個細胞間的相互作用，相比于直接接觸共培養，使用間接接觸共培養或非接觸共培養可能是一種比較好的研究方法。
2 生長因子
生長因子是細胞增殖、遷移、分化和 ECM 沉積的調節因子，在組織修復和再生中發揮著重要作用[53]。在腱骨界面愈合過程中，不同區域生長因子類型和表達也各有不同，因此為了與種子細胞和生物材料相配合增強修復效果，生長因子的正確組合、有效濃度和釋放時間均需要進行深入研究。
2.1 單一組分應用
目前研究中的生長因子包括 BMP（如 BMP-2、BMP-4 和 BMP-7）、TGF（如 TGF-β1 和 TGF-β3）、PDGF（如 PDGF-BB）、FGF（如 FGF-2）和集落刺激因子［如粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）］等。
Hirakawa 等[54]使用復合 BMP-2 的磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）支架修復兔岡下肌腱損傷，結果發現 BMP-2 能夠促進纖維軟骨生成、腱骨界面愈合并提高力學強度。Lee‐Barthel 等[55]發現 BMP-4 能夠通過改變腱骨界面處的細胞表型（肌腱/韌帶轉變為纖維軟骨），提高腱骨界面的極限斷裂載荷。Kabuto 等[56]發現與單純注射 BMP-7 相比，BMP-7 緩釋更有利于軟骨基質生成和肌腱取向排列，并且緩釋組具有更高的腱骨成熟評分和更大的力學強度。其他學者同樣發現 TGF-β1 或 TGF-β3 的緩釋能夠促進修復部位更好的膠原排列和新的纖維軟骨形成，從而促進腱骨界面愈合，提高力學強度[57-58]。Tokunaga 等[59]使用含有 PDGF?BB 的膜狀水凝膠修復大鼠岡上肌腱損傷，結果發現 PDGF?BB 能夠增加增殖細胞核抗原陽性細胞數目，改善膠原排列取向，進而增強腱骨界面的力學強度。Yonemitsu 等[60]同樣發現 FGF-2 能夠促進干細胞增殖，即增加腱骨界面處 SCX 和腱調蛋白（tenomodulin，TNMD）陽性細胞數目，從而提高腱骨界面力學強度。Kobayashi 等[61]發現大鼠皮下注射 G-CSF 能夠動員 BMSCs 從骨髓通過外周血遷移至岡上肌腱損傷部位參與修復，提高軟骨基質沉積和腱骨界面力學強度。
2.2 兩種組分應用
除了單一生長因子的使用，近年來出現了兩種生長因子聯合應用。Min 等[62]設計了具有雙重反向生長因子濃度梯度（PDGF-BB 梯度從膜的左側到右側和 BMP-2 梯度從膜的右側到左側）的多孔膜支架，將 ADSCs 接種在支架材料表面進行培養，結果發現細胞會根據材料上生長因子的濃度梯度向成肌腱和成骨方向進行特定分化。
2.3 混合組分應用
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）富含大量血小板和多種生長因子，包括 VEGF、PDGF、TGF-β 和 IGF-1 等，這些因子能夠促進肌腱、韌帶、肌肉和骨骼的愈合[63]。Kesikburun 等[64]采用雙盲隨機對照試驗比較了 PRP 和安慰劑對于部分或完全肩袖撕裂患者的治療效果，術后 1 年隨訪結果顯示，PRP 組和安慰劑組患者在疼痛緩解和肩關節功能改善上無明顯差異。Shams 等[65]采用隨機對照試驗比較了 PRP 和類固醇激素對于有癥狀的部分肩袖撕裂患者的治療效果，結果顯示 PRP 組患者在術后 12 周臨床評分改善更明顯，但在術后 6 個月時兩組間評分相似。最新的一項納入 16 個隨機對照試驗的系統評價結果顯示，PRP 的應用不僅能夠降低小型和中型肩袖撕裂患者術后再撕裂率，還能改善大型和巨大型肩袖撕裂患者手術失敗率[66]。然而 PRP 對肩袖損傷修復的作用仍然存在爭議，并且 PRP 中各種生物活性物質的作用機制或注射濃度尚未明確，仍需要進一步研究。
外泌體是直徑為 30～100 nm 的囊泡樣小體，可由內皮細胞、免疫細胞和骨骼肌細胞等多種細胞釋放[67]。不同細胞產生包含各自獨特信息的外泌體，通過自分泌或旁分泌方式傳遞各自信息，包括調控蛋白、生長因子、mRNA 和 miRNA 等[68]。前期研究發現外泌體中的 miRNA 能夠改變細胞表型和功能，參與免疫反應，影響細胞增殖和遷移以及血管生成等生物學過程[69]。Sevivas 等[70]發現 BMSCs 來源外泌體能在體外促進肌腱細胞增殖，體內促進肌腱成熟，提高腱骨界面力學強度，從而促進大鼠慢性肩袖損傷修復。Huang 等[71]通過尾靜脈注射 BMSCs 來源外泌體觀察大鼠肩袖損傷修復情況，結果發現 BMSCs 來源外泌體通過促進血管生成和抑制炎癥，從而促進腱骨界面愈合。Wang 等[72]發現局部注射 ADSCs 來源外泌體能夠阻止脂肪浸潤進展，促進腱骨愈合，改善肩袖生物力學性能。Chen 等[73]使用包含 BMSCs 條件培養基 ［含有 BMSCs 分泌產物（如外泌體等）的培養基］ 的明膠水凝膠修復大鼠岡上肌腱損傷，結果發現 BMSCs 條件培養基能通過 Smad2/3 信號通路調控巨噬細胞的激化，促進 M1 型巨噬細胞向 M2 型巨噬細胞轉化，從而加速腱骨界面愈合。Li 等[74]發現 TDSCs 來源外泌體中富含大量 TGF-β，能夠激活 TGF-β/Smad2/3 和細胞外調節激酶 1/2（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信號通路，從而促進 TDSCs 增殖和遷移。Zhang 等[75]同樣發現 TDSCs 來源外泌體通過磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2 信號通路促進肌腱細胞增殖和遷移，并且體內研究發現 TDSCs 來源外泌體早期能夠抑制炎癥和細胞凋亡，晚期能夠通過改善纖維排列方向提高再生肌腱的質量。
目前研究顯示應用單一或多種生長因子、PRP 或外泌體均能提高腱骨界面修復組織的質量。然而考慮到腱骨界面的復雜性，組織再生修復過程中很可能存在多種生長因子在不同時間和位置協同作用[76-77]。因此，為了能夠重建腱骨界面，研究多種生長因子的組合或探究 PRP 和外泌體促進修復的作用機制尤為重要。
3 生物材料
為了能夠促進或再生肌腱與骨之間的界面，理想的界面組織工程再生策略對支架材料提出以下要求：第一，盡可能重現組織界面的多區域結構，包括基質組成、微觀結構以及力學特點等；第二，支架能夠支持不同種類干細胞或祖細胞的黏附、增殖和特定表型的分化；第三，支架應具有可降解性，且降解速率與組織再生速率相當，能夠繼續維持生理負荷；第四，支架的設計還需考慮臨床可操作性，與相應的修復重建手術匹配[78]。目前已有多種技術用于設計復合支架材料，包括電紡絲技術、紡織技術（例如針織或編織）、3D 打印技術、冷凍干燥技術和其他技術（例如擠壓鹽浸技術或熔壓技術）等。
3.1 電紡絲技術
Li 等[79]使用電紡絲技術制備聚左旋乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］/HA 雙層支架來模擬腱骨界面的非礦化區和礦化區，體內實驗證實該支架能夠促進界面不同組織再生。Li 等[80]使用電紡絲技術制備出聚乙丙交酯 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］纖維支架，通過改變材料在模擬體液的浸泡時間，進一步制備礦物含量呈梯度變化的 PLGA 支架；Liu 等[81]發現礦物含量梯度變化的支架能夠在空間上調控 ADSCs 成骨分化程度。Samavedi 等[82]同樣通過混電紡絲技術制備出具有梯度的納米羥基磷灰石/聚己內酯/聚氨酯（nano hydroxyapatite/polycaprolactone/polyurethane，nHA-PCL/PU）混合支架來模擬韌帶與骨之間的界面。Lipner 等[83]為了提高支架修復效果，進一步將包含 ADSCs 的纖維蛋白水凝膠置于具有礦物含量梯度變化的 3 層 PLGA 支架中構建多層復合支架。Calejo 等[84]證實了 ADSCs 在濕紡絲技術制備的 PCL/明膠/HA 梯度膜的肌腱區域呈現伸長的細胞骨架和膠原沉積，而在梯度膜的骨區域呈現成骨分化和礦化沉積。
3.2 紡織技術
Nishimoto 等[85]通過手工編織方法制備了 PLLA 支架材料，用于修復兔內側副韌帶損傷，結果發現該支架材料能夠通過促進Ⅰ型膠原沉積和纖維軟骨再生，提高腱骨界面力學強度。Mengsteab 等[86]通過將聚對苯二甲酸乙二醇酯紗線和 PLLA 紗線混合編織出力學性能優越的材料用于兔前交叉韌帶修復，結果證實該支架增強了材料與骨之間的整合以及腱骨界面的再生。Kimura 等[87]進一步將 PLLA 和含有 FGF-2 的明膠水凝膠編織成混合支架并用膠原膜包裹，用于修復兔前交叉韌帶，結果發現 FGF-2 的釋放提高了編織支架的修復效果，促進了組織再生，提高了腱骨界面力學強度。Gwiazda 等[88]采用熔解電紡絲取向纖維制備技術設計了不同取向排列的 PCL 纖維膜，并將細胞接種在纖維膜表面進行培養，構成細胞-支架復合物，進一步通過編織方法制備出具有骨-韌帶-骨結構的支架，韌帶部分是由 3 束包含細胞的纖維膜編織而成，骨部分是由包含細胞的相互垂直纖維排列的膜構成。
3.3 3D 打印技術
近年來 3D 打印技術的出現給界面組織工程注入新的活力。Park 等[89]使用 3D 打印技術制備出 PCL/PLGA/β-TCP 復合支架，動物實驗證實該支架促進了腱骨界面纖維軟骨再生以及Ⅱ型膠原生成。Tarafder 等[90]進一步將含有生長因子的微球載體復合在薄膜狀 3D 打印支架上，通過多種生長因子的釋放募集宿主 TDSCs 參與腱骨界面的再生，提高支架修復效果。Jiang 等[91]則將含有 ADSCs 的水凝膠注射于 3D 打印 PLGA 3 層支架中構建復合支架，研究證實該復合支架能夠促進 ADSCs 增殖和腱向分化，同時也具有良好的組織相容性。Cao 等[92]進一步將含有成纖維細胞、BMSCs 和成骨細胞的甲基丙烯酸明膠負載于 3D 打印 PCL/TCP 三相支架的相應區域，構建細胞-支架復合物，小鼠皮下埋植實驗結果表明復合支架內部有纖維軟骨組織形成。為了模擬韌帶、骨和纖維軟骨界面組織，Criscenti 等[93]聯合 3D 打印和電紡絲技術制備出物理和力學性能梯度變化的 PLGA/PCL 三相支架，該支架包括取向的 PLGA 電紡絲區域、PCL 3D 打印區域以及電紡絲-3D 打印混合區域。
3.4 其他技術
除此之外，Kim 等[94]使用冷凍干燥技術制備出 4 層膠原復合支架，包括肌腱膠原層、含有膠原和硫酸軟骨素的未礦化纖維軟骨層、含有少量 HA 的礦化纖維軟骨層以及含有膠原和大量 HA 的骨層，該支架在微環境和力學性能上呈現漸變趨勢，并支持多種細胞的黏附和增殖。Font Tellado 等[95]通過聯合定向冷凍、冷凍干燥和鹽浸技術制備出具有雙孔隙率的雙相絲素蛋白支架，該支架在肌腱/韌帶側具有取向的孔排列，而在骨側具有隨機的孔排列，體外實驗證實其具有良好的細胞相容性。Lee 等[96]采用擠壓-鹽浸法制備多孔柱狀聚乳酸-共聚己內酯支架，并通過肝素水凝膠將成纖維細胞負載在支架的韌帶部分，以及將纖維軟骨細胞和 BMP-2 結合在支架的纖維軟骨部分，動物實驗證實該支架促進纖維軟骨區域鈣和糖胺聚糖沉積，同時促進韌帶區域膠原沉積。Guo 等[97]采用熔壓技術制備了含有磷酸鈣硅酸鹽（calcium phosphate silicate ceramic，CPS）的 PLLA 復合膜用于兔岡上肌腱損傷修復，結果發現體積比為 5∶1 的 PLLA/CPS 復合膜不僅具有良好生物相容性、生物降解性和力學性能，還促進了膠原的取向排列以及軟骨和骨的再生。
目前電紡絲技術常與紡織或編織方式聯合應用，其原因可能是該技術可以模仿不同腱骨組織的納米纖維結構；3D 打印技術可以通過生物墨水和纖維聯合設計多種支架，然而該技術還需要進一步研究來提高支架的力學性能和微觀結構；冷凍干燥技術雖然可以獲得高孔隙率支架，但與其他方法相比，支架力學性能較差，需要與其他方法相結合。
4 氧濃度
在人體中，氧是多種組織器官發育和維持的重要因素。肌腱與骨組織之間的界面存在一個逐漸過渡的血管組織結構，相應的軟組織和硬組織之間也出現氧濃度變化，骨組織因血供比較豐富，故氧濃度為 5.5%～15%，而肌腱組織缺乏血供，故氧濃度<5%[98-99]。
目前對于氧濃度的研究主要集中在低氧環境對干細胞成肌腱、成軟骨和成骨分化的影響。Zhang 等[100]比較了人 TDSCs 在低氧（5%）和常氧（20%）環境下的生物學行為，結果發現低氧環境能促進 TDSCs 的增殖和成肌腱分化，但抑制了 TDSCs 的成骨和成軟骨分化。Yu 等[20]比較了不同氧濃度（0.5%、5%、10% 和 20%）對 TDSCs 克隆能力和分化能力的影響，結果發現氧濃度為 5% 時，TDSCs 的克隆能力和增殖能力最強；氧濃度為 0.5% 時，TDSCs 的克隆能力受到抑制，但是干細胞相關基因 ［Nanog、Oct-4（octamer-binding transcription factor 4）和階段特異性胚胎抗原 4（SSEA-4）］的表達反而增強；氧濃度為 20% 時，TDSCs 成脂、成軟骨和成骨相關基因 ［過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、Sry 相關高遷移率族盒蛋白 9（Sox-9）和 Runx2］表達水平較高。Lee 等[101]比較了 TDSCs 在低氧（2%）和常氧（20%）環境下的生物學行為，結果發現低氧促進了細胞增殖能力和成肌腱分化，但降低了細胞成骨、成脂和成軟骨分化。Yu 等[102]進一步比較了低氧（2%）和常氧（20%）對肌腱細胞和 ADSCs 間接共培養時的影響，結果發現間接共培養時，肌腱細胞能夠增強 ADSCs 的成肌腱分化，而且低氧環境進一步通過促進缺氧誘導因子 1 α 基因表達來促進 ADSCs 成肌腱相關基因［SCX、TNMD 和血小板反應蛋白 4（THBS-4）］的表達。盡管前期研究發現低氧會降低干細胞成骨分化，但是部分學者發現低氧（1% 或 5%）環境會增強 BMSCs 的成骨分化[103-104]。故低氧對干細胞成骨分化的影響仍需進一步研究。
組織損傷往往伴隨著血供缺乏，從而導致周圍環境出現氧含量不足，在外源性細胞和生物材料植入修復早期，盡管細胞會分泌血管生長因子促進新生血管形成，然而如該過程較長會導致植入細胞死亡[105]。為了改善損傷組織的極度低氧環境，目前已有學者制備出能夠局部釋放氧氣的支架材料用于修復損傷組織。Touri 等[106]用 3D 打印技術制備出含有過氧化鈣-PCL 顆粒的雙相 HA/磷酸鈣支架用于骨損傷修復，結果顯示在缺氧條件下，該支架能夠長時間（10 d）緩慢增加周圍環境的氧含量，促進成骨細胞增殖。Montesdeoca 等[107]同樣發現含有過氧化鈣的明膠甲基丙烯酸水凝膠能夠持續（6 d）釋放氧氣，改善缺氧條件下軟骨細胞的存活率。Wang 等[108]將含有過氧化鈣的明膠微球和含有 BMSCs 的海藻酸鈉/明膠水凝膠復合在 3D 打印多層多孔管狀 PCL/nHA 支架內部，構建細胞-支架復合物并用于修復兔股骨頭壞死。體外研究結果發現該復合支架能夠長時間（19 d）持續釋放氧氣，并且能夠維持 BMSCs 在低氧環境（1%）下的增殖；體內研究結果證實與不含過氧化鈣微球的支架相比，該復合支架能夠提高外源性 BMSCs 的存活率，減少細胞凋亡，從而促進骨組織和血管再生。
總的來說，培養環境中的氧濃度對干細胞的命運起著非常重要的作用，然而由于目前研究缺乏統一的實驗參數和干細胞種類，不同氧濃度對于干細胞的分化作用仍需要進一步研究。此外，腱骨界面不僅在細胞、結構組成以及力學性能方面具有梯度變化，細胞所處的氧環境也具有相似變化，未來研究需要同時關注肌腱和骨組織中的氧濃度，在設計相應支架時還要考慮尋找一合適氧濃度來支持相應部位細胞的成肌腱、成軟骨和成骨表型。
5 力學刺激
除了組織環境中的氧濃度會影響損傷組織修復，力學刺激也會對腱骨界面組織的發育和再生起到重要作用。在生物發育階段，力學刺激影響骨、軟骨和肌腱的發育，對于骨來說，力學刺激增加（例如體力活動）會導致骨密度增加，力學刺激減少（例如石膏固定和臥床休息等）則會導致骨密度降低[109]。對于軟骨和肌腱來說，力學刺激對軟骨和肌腱的發育、穩態及功能至關重要，去除力學刺激會損害軟骨和肌腱的結構，從而導致相應疾病發生[110-111]。部分學者通過 A 型肉毒桿菌毒素麻痹大鼠岡上肌，觀察力學刺激在肩袖損傷修復中的作用，結果發現與生理鹽水注射組相比，肌肉麻痹組岡上肌體積減少，界面的纖維軟骨發育延遲，礦化骨也減少，同時破骨細胞活性增高，從而延緩了腱骨界面的發育[21]。顯而易見，來自肌肉和肌腱的力學刺激有助于腱骨界面結構發育，從而形成具有力學性能梯度變化的結構，實現有效的力學傳遞和降低應力集中。
在組織工程領域，已有學者使用動態培養（例如生物反應器）方法對細胞施加不同力學刺激，來模擬人體生理器官的力學環境，誘導細胞增殖、分化以及體外形成新的組織用于修復[112]。Elashry 等[113]將 ADSCs 接種于二氧化硅/膠原納米復合材料，并將細胞-支架復合物放入生物反應器中培養，結果發現流體剪切應力能夠促進 BMSCs 的 ALP 以及成骨相關基因（Runx2）表達。除了通過生物反應器的方法使細胞感受力學刺激外，目前有學者制備出能夠感受外來刺激（例如磁場或超聲波），從而使自身結構發生變化的支架用于組織修復。Min 等[114]通過模板輔助電沉積和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽復合技術制備出具備磁性的鈷鐵納米線圈，在外來磁場作用下，納米線圈具有“開”和“關”兩種形態，體外研究結果發現納米線圈在“開”的形態下能夠促進 MSCs 黏附，并通過 Yes 相關蛋白與轉錄共激活因子 PDZ 結合基序（YAP/TAZ）力學傳導通路促進干細胞成骨分化；體內研究結果發現在外來磁場作用下，裸鼠皮下埋植的磁性納米線圈仍然能夠促進注射在材料表面的 MSCs 黏附以及成骨相關基因（Runx2）表達。Camarero-Espinosa 等[115]使用 3D 打印技術制備了 PCL/聚乳酸混合 Janus 支架，該支架能夠將外部超聲產生的聲學信號轉換成機械納米振動的力學信號作用于干細胞，結果發現在外來超聲波作用下，Janus 支架能夠促進 BMSCs 增殖、基質沉積和成骨相關基因（Runx2 和骨鈣素）的表達，并且該支架是通過激活電壓門控鈣離子通道，從而增強 BMSCs 的成骨分化。
目前多數研究仍在探索力學刺激對于干細胞增殖、黏附、遷移和分化的影響以及相關作用機制，還未設計和制備出用于腱骨界面修復的力學刺激支架。相反，多數已設計的新型支架僅在靜態細胞培養下探討修復效果，往往忽視了力學刺激對腱骨界面愈合的影響。因此，未來研究可結合動態培養系統來控制環境中的力學刺激，從而制備具有梯度變化的材料界面，增強支架對干細胞的調控。
6 小結
近年來界面組織工程技術取得了很大進步，然而關于腱骨界面發育和再生的機制仍未探明，研究者們一直試圖通過了解再生過程中所涉及的不同信號來重現界面組織的復雜性。對于種子細胞和生長因子，了解天然腱骨界面中多種細胞的相互作用尤為重要，包括細胞與細胞間的作用、細胞和 ECM 之間的作用以及旁分泌的作用。對于生物材料，可以通過多種技術手段來協同設計生物材料的特性，以模擬天然腱骨界面的微觀結構、基質組成和力學特點。最后，腱骨愈合和再生的最佳策略不僅需要使用具有梯度變化的生物材料，還需要細胞、生長因子和特定培養條件（例如氧濃度和力學刺激）的結合。盡管越來越多證據表明種子細胞、生長因子和生物材料的治療有利于腱骨界面愈合，但相應治療手段的臨床轉化仍然是一個非常緩慢的過程。
作者貢獻：何樹坤負責資料收集和文章撰寫；秦廷武負責對文章審閱和修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點。
肩袖損傷是導致肩關節持續性疼痛和功能障礙的主要原因之一，其發病率為 5%～40%，50 歲以上人群高達 50%[1-2]。目前研究發現肩袖損傷有以下幾種發病機制：一是存在解剖異常（例如肩峰撞擊綜合征），岡上肌經常受到肩峰和喙肩韌帶擠壓，進而導致水腫斷裂等病理變化[3]；二是存在慢性炎癥，炎癥能使岡上肌腱的超微結構發生改變，進而導致肌腱鈣化斷裂等[4]；三是存在其他危險因素，包括吸煙[5]、基質金屬蛋白酶功能活躍[6]和基因表達改變[7]等。對于保守治療失敗和不適合保守治療的患者，手術修復是一種有效手段，然而系統評價結果顯示肩袖修復術后平均不愈合率為 26.6%，并且大型（3～5 cm）和巨大型（>5 cm）肩袖撕裂患者術后再斷裂率高達 79%[8-9]。研究發現影響術后肩袖是否再斷裂的因素有很多，包括年齡、肌腱質量、骨密度、肌肉萎縮程度、脂肪浸潤程度、撕裂大小和病程長短等[10-12]。
為了更好地了解肩袖損傷修復術后再斷裂原因，我們首先要了解肩袖的正常結構以及肩袖損傷部位特點。正常肩袖是由岡上肌、岡下肌、小圓肌和肩胛下肌組成，這些肌肉均起于肩胛骨，而肌腱則匯合成一個薄片即肩袖，最終止于肱骨大、小結節，其功能是維持肩關節穩定和協助完成肩關節的內、外旋和外展運動[13]。岡上肌腱因其特殊的解剖位置和止點處缺少血供的生理特點，是肩袖中最容易發生損傷的肌腱[14]，其最常斷裂部位是肌腱和骨之間的連接處即腱骨界面，并且肩袖修復術后腱骨界面不愈合是導致手術失敗的主要原因之一[15]。腱骨界面是一個包括肌腱、纖維軟骨、礦化纖維軟骨和骨 4 種不同類型組織的不均勻區域，是一個細胞、結構組成以及力學性能各異的部位[16]。其中，肌腱細胞分布在含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的肌腱組織內；纖維軟骨細胞則沿著膠原纖維的長軸排列，分布在含有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型和Ⅹ型膠原蛋白的非礦化纖維軟骨區域；而含有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的礦化纖維軟骨中可見肥大軟骨細胞，且呈柱狀排列；最后，含有Ⅰ型膠原蛋白的骨中可見成骨細胞、骨細胞和破骨細胞。除此之外，各個區域中礦物質含量和蛋白多糖種類也各有不同，而這種天然的異質性導致此界面組織的力學和生物學特性發生變化，有效降低了應力集中，允許載荷從肌腱或韌帶轉移到骨骼中[17-18]。
近年來，界面組織工程研究的出現給腱骨界面修復和再生帶來新的機遇，該研究旨在通過多種方法重建復雜的、層次分明的界面組織，修復或再生受損的不同組織連接部位[19]。界面組織工程主要由種子細胞、生長因子、生物材料三要素構成。種子細胞是源頭，即細胞通過遷移、黏附、增殖和分化等行為來實現缺損組織的再生；生長因子是調控，即因子通過作用于特定的信號通路來調控細胞的多種行為；生物材料是橋梁，即材料一方面可以為種子細胞提供適當的生長環境，另一方面可以為生長因子提供載體。除了上述三要素，適宜的氧濃度和力學刺激也會影響細胞的生物學行為和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積等[20-21]。見表 1。本文擬從上述方面對肩袖損傷修復的界面組織工程研究進展進行綜述。
表1
肩袖損傷修復的界面組織工程進展
Table1.
Research progress of interfacial tissue engineering in rotator cuff repair
1 種子細胞
目前用于界面組織工程的種子細胞類型包括干細胞和終末分化細胞，細胞培養策略則包括單獨培養和共培養，最佳的細胞來源以及共培養中合適的細胞比例仍在探索中。
1.1 單獨培養
單獨培養研究主要集中在干細胞方面，相對于終末分化細胞，干細胞具有自我復制能力以及向不同譜系細胞分化的能力，目前研究較多的是 BMSCs 和脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。
BMSCs 是目前研究最為廣泛的一種干細胞，來源于骨髓，參與肩袖腱骨界面的修復和再生。在動物實驗方面，Lim 等[22]用包含 BMSCs 的纖維蛋白膠包裹自體肌腱重建兔前交叉韌帶，術后實驗組可觀察到成熟的軟骨區存在，且力學性能顯著提高。Kida 等[23]通過轉孔的方法將肩袖止點的自體 BMSCs 應用于大鼠岡上肌腱止點修復，術后發現轉孔組腱骨界面力學性能更好。在臨床試驗方面，Hernigou 等[24]設計了病例對照研究，觀察注射 BMSCs 能否提高肩袖損傷修復效果，結果發現注射組患者術后 6 個月和 10 年的肩袖損傷愈合率均高于對照組。其他研究也同樣表明 BMSCs 的應用能改善腱骨界面的力學性能[25-26]。然而有學者發現在修復大鼠肩袖腱骨界面實驗中，單獨應用 BMSCs 并未促進腱骨界面的愈合或提高界面的力學強度[27]。因此在后續研究中，該團隊通過腺病毒轉染制備了 SCX（scleraxis）和膜型基質金屬蛋白酶 1（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）過表達的 BMSCs 用于腱骨界面修復，結果發現過表達組存在更多新生纖維軟骨組織和更高力學強度[28-29]。同時，其他學者通過編碼 shRNA 的腺病毒制備了 TOB1（transducer of ERBB2.1）缺陷的 BMSCs 用于大鼠肩袖損傷修復，結果發現實驗組存在更多纖維軟骨和Ⅱ型膠原，并且腱骨界面力學強度更好[30]。然而有學者發現，BMP-13 過表達的 BMSCs 未能促進腱骨界面愈合[31]。上述研究說明 BMSCs 可能需要特定的誘導才能發揮其促進肩袖腱骨界面損傷修復的作用。
盡管 ADSCs 未直接參與肩袖腱骨界面的修復，但其來源廣泛、相關并發癥少，并且也具有成骨、成軟骨和成肌腱等多向分化潛能，因此 ADSCs 也是有研究前景的干細胞之一[32-33]。在動物實驗方面，Oh 等[34]使用 ADSCs 修復兔肩胛下肌腱損傷，結果發現局部注射 ADSCs 能夠改善肩袖損傷后的肌肉功能和促進肌腱愈合，并減少脂肪浸潤。Kosaka 等[35]將 ADSCs 局部注射至兔前交叉韌帶重建模型中，同樣促進了肌腱-骨的整合。在臨床試驗方面，Kim 等[36]設計了隊列研究觀察注射含 ADSCs 的纖維蛋白膠能否提高關節鏡術后肩袖損傷修復效果，結果發現相比于對照組，注射組患者術后肩袖再斷裂率明顯降低。Jo 等[37]對比了不同注射濃度 ADSCs 的安全性和有效性，術后 2 年隨訪結果發現，注射高濃度（1×108 個）ADSCs 不會出現相關并發癥，并且能夠減輕疼痛，改善肩袖肌肉力量和提高肩關節臨床功能評分。其他研究也同樣表明 ADSCs 能促進腱骨界面損傷的修復再生[38-40]。
除了上述兩種干細胞，近年來學者們發現肌腱來源干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）[41]、韌帶來源干細胞[42]、滑膜來源干細胞[43]、骨膜來源干細胞[44]和尿源性干細胞[45]在腱骨界面修復中也顯示出巨大潛能。
1.2 共培養
由于腱骨界面包含細胞種類較多，相對于單一細胞研究，研究細胞間的共培養能夠了解腱骨界面的發育和修復過程，因此共培養策略的研究與應用尤為重要。目前，界面組織工程中共培養策略分為直接接觸共培養和間接接觸或非接觸共培養，所選細胞則分為終末分化細胞間的共培養和終末分化細胞與干細胞間的共培養[46]。直接接觸共培養存在細胞與細胞間相互作用、旁分泌因子對細胞的作用以及細胞與 ECM 間的作用，機制研究較為困難。而間接接觸或非接觸共培養的細胞由多孔膜分離，可以單獨研究旁分泌因子對細胞的作用或 ECM 對細胞的作用[46]。對于終末分化細胞間的共培養，Wang 等[47]利用直接接觸共培養模型研究了成骨細胞和成纖維細胞之間的相互作用，在培養過程中兩種細胞能夠遷移并相互作用形成 3 個不同區域：成纖維細胞區、成纖維細胞+成骨細胞區和成骨細胞區。該研究發現成纖維細胞的 ALP 活性和礦化可能受到成骨細胞的影響；此外，相對于兩側區域細胞，中間區域細胞的Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）和軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）基因表達水平上調。Cooper 等[48]通過調整培養基的組成成分共培養了 NIH-3T3 成纖維細胞系和 MC-3T3 成骨細胞系，從而制備出具有 3 個不同區域的支架來模擬腱骨界面的天然結構。對于終末分化細胞與干細胞間的共培養，He 等[49]在絲素蛋白-羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架上共培養兔成纖維細胞、BMSCs 和成骨細胞，將支架分為 4 個不同區域：成纖維細胞區、成纖維細胞+BMSCs 區、成骨細胞+BMSCs 區、成骨細胞區，結果發現 BMSCs 與成骨細胞和成纖維細胞共培養時向纖維軟骨細胞系分化。Calejo 等[50]發現基礎培養基和成骨誘導培養基不同混合比例會影響人肌腱來源細胞和前成骨細胞共培養時的基因表達，成骨誘導培養基比例提高能夠顯著增強共培養細胞的 ALP 表達、礦物沉積以及成軟骨相關標志物（ACAN 和 COMP）表達，同時使人肌腱來源細胞表型發生成骨轉化。Lyu 等[51]設計了一種樹形微流體裝置，該裝置可以將普通培養基和成骨誘導培養基合并成具有梯度濃度比例的混合液，從而誘導接種于脫細胞肌腱片上的 BMSCs 和 TDSCs 向成骨、成軟骨及成肌腱方向分化，最終在材料表面形成 3 個不同區域，大鼠跟腱缺損修復研究結果表明，該裝置所制備的新型材料能夠促進腱骨界面愈合。
盡管前期研究已揭示出肌腱和骨組織中的細胞類型，但位于腱骨界面的細胞呈現出與上述兩種細胞不同的特征。既往研究通過轉錄組學和蛋白質組學結果揭示出腱骨界面細胞表達軟骨相關標記物（包括 ACAN、軟骨黏附素、Ⅱ型膠原等）以及終末分化的肥大樣軟骨細胞標記物 ［例如 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2），整合素結合唾液蛋白和基質金屬蛋白酶 13（matrix metal proteinase 13，MMP-13）等］，從而提示該類型細胞屬于軟骨細胞樣表型[52]。然而迄今為止，由于缺少針對腱骨界面細胞亞群的單細胞測序研究，我們對于腱骨界面發育和再生的機制仍缺乏了解，而共培養是研究體外細胞相互作用的重要方法，因此下一步應通過模擬腱骨界面處的微環境，研究多個細胞間的相互作用，相比于直接接觸共培養，使用間接接觸共培養或非接觸共培養可能是一種比較好的研究方法。
2 生長因子
生長因子是細胞增殖、遷移、分化和 ECM 沉積的調節因子，在組織修復和再生中發揮著重要作用[53]。在腱骨界面愈合過程中，不同區域生長因子類型和表達也各有不同，因此為了與種子細胞和生物材料相配合增強修復效果，生長因子的正確組合、有效濃度和釋放時間均需要進行深入研究。
2.1 單一組分應用
目前研究中的生長因子包括 BMP（如 BMP-2、BMP-4 和 BMP-7）、TGF（如 TGF-β1 和 TGF-β3）、PDGF（如 PDGF-BB）、FGF（如 FGF-2）和集落刺激因子［如粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）］等。
Hirakawa 等[54]使用復合 BMP-2 的磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）支架修復兔岡下肌腱損傷，結果發現 BMP-2 能夠促進纖維軟骨生成、腱骨界面愈合并提高力學強度。Lee‐Barthel 等[55]發現 BMP-4 能夠通過改變腱骨界面處的細胞表型（肌腱/韌帶轉變為纖維軟骨），提高腱骨界面的極限斷裂載荷。Kabuto 等[56]發現與單純注射 BMP-7 相比，BMP-7 緩釋更有利于軟骨基質生成和肌腱取向排列，并且緩釋組具有更高的腱骨成熟評分和更大的力學強度。其他學者同樣發現 TGF-β1 或 TGF-β3 的緩釋能夠促進修復部位更好的膠原排列和新的纖維軟骨形成，從而促進腱骨界面愈合，提高力學強度[57-58]。Tokunaga 等[59]使用含有 PDGF?BB 的膜狀水凝膠修復大鼠岡上肌腱損傷，結果發現 PDGF?BB 能夠增加增殖細胞核抗原陽性細胞數目，改善膠原排列取向，進而增強腱骨界面的力學強度。Yonemitsu 等[60]同樣發現 FGF-2 能夠促進干細胞增殖，即增加腱骨界面處 SCX 和腱調蛋白（tenomodulin，TNMD）陽性細胞數目，從而提高腱骨界面力學強度。Kobayashi 等[61]發現大鼠皮下注射 G-CSF 能夠動員 BMSCs 從骨髓通過外周血遷移至岡上肌腱損傷部位參與修復，提高軟骨基質沉積和腱骨界面力學強度。
2.2 兩種組分應用
除了單一生長因子的使用，近年來出現了兩種生長因子聯合應用。Min 等[62]設計了具有雙重反向生長因子濃度梯度（PDGF-BB 梯度從膜的左側到右側和 BMP-2 梯度從膜的右側到左側）的多孔膜支架，將 ADSCs 接種在支架材料表面進行培養，結果發現細胞會根據材料上生長因子的濃度梯度向成肌腱和成骨方向進行特定分化。
2.3 混合組分應用
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）富含大量血小板和多種生長因子，包括 VEGF、PDGF、TGF-β 和 IGF-1 等，這些因子能夠促進肌腱、韌帶、肌肉和骨骼的愈合[63]。Kesikburun 等[64]采用雙盲隨機對照試驗比較了 PRP 和安慰劑對于部分或完全肩袖撕裂患者的治療效果，術后 1 年隨訪結果顯示，PRP 組和安慰劑組患者在疼痛緩解和肩關節功能改善上無明顯差異。Shams 等[65]采用隨機對照試驗比較了 PRP 和類固醇激素對于有癥狀的部分肩袖撕裂患者的治療效果，結果顯示 PRP 組患者在術后 12 周臨床評分改善更明顯，但在術后 6 個月時兩組間評分相似。最新的一項納入 16 個隨機對照試驗的系統評價結果顯示，PRP 的應用不僅能夠降低小型和中型肩袖撕裂患者術后再撕裂率，還能改善大型和巨大型肩袖撕裂患者手術失敗率[66]。然而 PRP 對肩袖損傷修復的作用仍然存在爭議，并且 PRP 中各種生物活性物質的作用機制或注射濃度尚未明確，仍需要進一步研究。
外泌體是直徑為 30～100 nm 的囊泡樣小體，可由內皮細胞、免疫細胞和骨骼肌細胞等多種細胞釋放[67]。不同細胞產生包含各自獨特信息的外泌體，通過自分泌或旁分泌方式傳遞各自信息，包括調控蛋白、生長因子、mRNA 和 miRNA 等[68]。前期研究發現外泌體中的 miRNA 能夠改變細胞表型和功能，參與免疫反應，影響細胞增殖和遷移以及血管生成等生物學過程[69]。Sevivas 等[70]發現 BMSCs 來源外泌體能在體外促進肌腱細胞增殖，體內促進肌腱成熟，提高腱骨界面力學強度，從而促進大鼠慢性肩袖損傷修復。Huang 等[71]通過尾靜脈注射 BMSCs 來源外泌體觀察大鼠肩袖損傷修復情況，結果發現 BMSCs 來源外泌體通過促進血管生成和抑制炎癥，從而促進腱骨界面愈合。Wang 等[72]發現局部注射 ADSCs 來源外泌體能夠阻止脂肪浸潤進展，促進腱骨愈合，改善肩袖生物力學性能。Chen 等[73]使用包含 BMSCs 條件培養基 ［含有 BMSCs 分泌產物（如外泌體等）的培養基］ 的明膠水凝膠修復大鼠岡上肌腱損傷，結果發現 BMSCs 條件培養基能通過 Smad2/3 信號通路調控巨噬細胞的激化，促進 M1 型巨噬細胞向 M2 型巨噬細胞轉化，從而加速腱骨界面愈合。Li 等[74]發現 TDSCs 來源外泌體中富含大量 TGF-β，能夠激活 TGF-β/Smad2/3 和細胞外調節激酶 1/2（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信號通路，從而促進 TDSCs 增殖和遷移。Zhang 等[75]同樣發現 TDSCs 來源外泌體通過磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2 信號通路促進肌腱細胞增殖和遷移，并且體內研究發現 TDSCs 來源外泌體早期能夠抑制炎癥和細胞凋亡，晚期能夠通過改善纖維排列方向提高再生肌腱的質量。
目前研究顯示應用單一或多種生長因子、PRP 或外泌體均能提高腱骨界面修復組織的質量。然而考慮到腱骨界面的復雜性，組織再生修復過程中很可能存在多種生長因子在不同時間和位置協同作用[76-77]。因此，為了能夠重建腱骨界面，研究多種生長因子的組合或探究 PRP 和外泌體促進修復的作用機制尤為重要。
3 生物材料
為了能夠促進或再生肌腱與骨之間的界面，理想的界面組織工程再生策略對支架材料提出以下要求：第一，盡可能重現組織界面的多區域結構，包括基質組成、微觀結構以及力學特點等；第二，支架能夠支持不同種類干細胞或祖細胞的黏附、增殖和特定表型的分化；第三，支架應具有可降解性，且降解速率與組織再生速率相當，能夠繼續維持生理負荷；第四，支架的設計還需考慮臨床可操作性，與相應的修復重建手術匹配[78]。目前已有多種技術用于設計復合支架材料，包括電紡絲技術、紡織技術（例如針織或編織）、3D 打印技術、冷凍干燥技術和其他技術（例如擠壓鹽浸技術或熔壓技術）等。
3.1 電紡絲技術
Li 等[79]使用電紡絲技術制備聚左旋乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］/HA 雙層支架來模擬腱骨界面的非礦化區和礦化區，體內實驗證實該支架能夠促進界面不同組織再生。Li 等[80]使用電紡絲技術制備出聚乙丙交酯 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］纖維支架，通過改變材料在模擬體液的浸泡時間，進一步制備礦物含量呈梯度變化的 PLGA 支架；Liu 等[81]發現礦物含量梯度變化的支架能夠在空間上調控 ADSCs 成骨分化程度。Samavedi 等[82]同樣通過混電紡絲技術制備出具有梯度的納米羥基磷灰石/聚己內酯/聚氨酯（nano hydroxyapatite/polycaprolactone/polyurethane，nHA-PCL/PU）混合支架來模擬韌帶與骨之間的界面。Lipner 等[83]為了提高支架修復效果，進一步將包含 ADSCs 的纖維蛋白水凝膠置于具有礦物含量梯度變化的 3 層 PLGA 支架中構建多層復合支架。Calejo 等[84]證實了 ADSCs 在濕紡絲技術制備的 PCL/明膠/HA 梯度膜的肌腱區域呈現伸長的細胞骨架和膠原沉積，而在梯度膜的骨區域呈現成骨分化和礦化沉積。
3.2 紡織技術
Nishimoto 等[85]通過手工編織方法制備了 PLLA 支架材料，用于修復兔內側副韌帶損傷，結果發現該支架材料能夠通過促進Ⅰ型膠原沉積和纖維軟骨再生，提高腱骨界面力學強度。Mengsteab 等[86]通過將聚對苯二甲酸乙二醇酯紗線和 PLLA 紗線混合編織出力學性能優越的材料用于兔前交叉韌帶修復，結果證實該支架增強了材料與骨之間的整合以及腱骨界面的再生。Kimura 等[87]進一步將 PLLA 和含有 FGF-2 的明膠水凝膠編織成混合支架并用膠原膜包裹，用于修復兔前交叉韌帶，結果發現 FGF-2 的釋放提高了編織支架的修復效果，促進了組織再生，提高了腱骨界面力學強度。Gwiazda 等[88]采用熔解電紡絲取向纖維制備技術設計了不同取向排列的 PCL 纖維膜，并將細胞接種在纖維膜表面進行培養，構成細胞-支架復合物，進一步通過編織方法制備出具有骨-韌帶-骨結構的支架，韌帶部分是由 3 束包含細胞的纖維膜編織而成，骨部分是由包含細胞的相互垂直纖維排列的膜構成。
3.3 3D 打印技術
近年來 3D 打印技術的出現給界面組織工程注入新的活力。Park 等[89]使用 3D 打印技術制備出 PCL/PLGA/β-TCP 復合支架，動物實驗證實該支架促進了腱骨界面纖維軟骨再生以及Ⅱ型膠原生成。Tarafder 等[90]進一步將含有生長因子的微球載體復合在薄膜狀 3D 打印支架上，通過多種生長因子的釋放募集宿主 TDSCs 參與腱骨界面的再生，提高支架修復效果。Jiang 等[91]則將含有 ADSCs 的水凝膠注射于 3D 打印 PLGA 3 層支架中構建復合支架，研究證實該復合支架能夠促進 ADSCs 增殖和腱向分化，同時也具有良好的組織相容性。Cao 等[92]進一步將含有成纖維細胞、BMSCs 和成骨細胞的甲基丙烯酸明膠負載于 3D 打印 PCL/TCP 三相支架的相應區域，構建細胞-支架復合物，小鼠皮下埋植實驗結果表明復合支架內部有纖維軟骨組織形成。為了模擬韌帶、骨和纖維軟骨界面組織，Criscenti 等[93]聯合 3D 打印和電紡絲技術制備出物理和力學性能梯度變化的 PLGA/PCL 三相支架，該支架包括取向的 PLGA 電紡絲區域、PCL 3D 打印區域以及電紡絲-3D 打印混合區域。
3.4 其他技術
除此之外，Kim 等[94]使用冷凍干燥技術制備出 4 層膠原復合支架，包括肌腱膠原層、含有膠原和硫酸軟骨素的未礦化纖維軟骨層、含有少量 HA 的礦化纖維軟骨層以及含有膠原和大量 HA 的骨層，該支架在微環境和力學性能上呈現漸變趨勢，并支持多種細胞的黏附和增殖。Font Tellado 等[95]通過聯合定向冷凍、冷凍干燥和鹽浸技術制備出具有雙孔隙率的雙相絲素蛋白支架，該支架在肌腱/韌帶側具有取向的孔排列，而在骨側具有隨機的孔排列，體外實驗證實其具有良好的細胞相容性。Lee 等[96]采用擠壓-鹽浸法制備多孔柱狀聚乳酸-共聚己內酯支架，并通過肝素水凝膠將成纖維細胞負載在支架的韌帶部分，以及將纖維軟骨細胞和 BMP-2 結合在支架的纖維軟骨部分，動物實驗證實該支架促進纖維軟骨區域鈣和糖胺聚糖沉積，同時促進韌帶區域膠原沉積。Guo 等[97]采用熔壓技術制備了含有磷酸鈣硅酸鹽（calcium phosphate silicate ceramic，CPS）的 PLLA 復合膜用于兔岡上肌腱損傷修復，結果發現體積比為 5∶1 的 PLLA/CPS 復合膜不僅具有良好生物相容性、生物降解性和力學性能，還促進了膠原的取向排列以及軟骨和骨的再生。
目前電紡絲技術常與紡織或編織方式聯合應用，其原因可能是該技術可以模仿不同腱骨組織的納米纖維結構；3D 打印技術可以通過生物墨水和纖維聯合設計多種支架，然而該技術還需要進一步研究來提高支架的力學性能和微觀結構；冷凍干燥技術雖然可以獲得高孔隙率支架，但與其他方法相比，支架力學性能較差，需要與其他方法相結合。
4 氧濃度
在人體中，氧是多種組織器官發育和維持的重要因素。肌腱與骨組織之間的界面存在一個逐漸過渡的血管組織結構，相應的軟組織和硬組織之間也出現氧濃度變化，骨組織因血供比較豐富，故氧濃度為 5.5%～15%，而肌腱組織缺乏血供，故氧濃度<5%[98-99]。
目前對于氧濃度的研究主要集中在低氧環境對干細胞成肌腱、成軟骨和成骨分化的影響。Zhang 等[100]比較了人 TDSCs 在低氧（5%）和常氧（20%）環境下的生物學行為，結果發現低氧環境能促進 TDSCs 的增殖和成肌腱分化，但抑制了 TDSCs 的成骨和成軟骨分化。Yu 等[20]比較了不同氧濃度（0.5%、5%、10% 和 20%）對 TDSCs 克隆能力和分化能力的影響，結果發現氧濃度為 5% 時，TDSCs 的克隆能力和增殖能力最強；氧濃度為 0.5% 時，TDSCs 的克隆能力受到抑制，但是干細胞相關基因 ［Nanog、Oct-4（octamer-binding transcription factor 4）和階段特異性胚胎抗原 4（SSEA-4）］的表達反而增強；氧濃度為 20% 時，TDSCs 成脂、成軟骨和成骨相關基因 ［過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、Sry 相關高遷移率族盒蛋白 9（Sox-9）和 Runx2］表達水平較高。Lee 等[101]比較了 TDSCs 在低氧（2%）和常氧（20%）環境下的生物學行為，結果發現低氧促進了細胞增殖能力和成肌腱分化，但降低了細胞成骨、成脂和成軟骨分化。Yu 等[102]進一步比較了低氧（2%）和常氧（20%）對肌腱細胞和 ADSCs 間接共培養時的影響，結果發現間接共培養時，肌腱細胞能夠增強 ADSCs 的成肌腱分化，而且低氧環境進一步通過促進缺氧誘導因子 1 α 基因表達來促進 ADSCs 成肌腱相關基因［SCX、TNMD 和血小板反應蛋白 4（THBS-4）］的表達。盡管前期研究發現低氧會降低干細胞成骨分化，但是部分學者發現低氧（1% 或 5%）環境會增強 BMSCs 的成骨分化[103-104]。故低氧對干細胞成骨分化的影響仍需進一步研究。
組織損傷往往伴隨著血供缺乏，從而導致周圍環境出現氧含量不足，在外源性細胞和生物材料植入修復早期，盡管細胞會分泌血管生長因子促進新生血管形成，然而如該過程較長會導致植入細胞死亡[105]。為了改善損傷組織的極度低氧環境，目前已有學者制備出能夠局部釋放氧氣的支架材料用于修復損傷組織。Touri 等[106]用 3D 打印技術制備出含有過氧化鈣-PCL 顆粒的雙相 HA/磷酸鈣支架用于骨損傷修復，結果顯示在缺氧條件下，該支架能夠長時間（10 d）緩慢增加周圍環境的氧含量，促進成骨細胞增殖。Montesdeoca 等[107]同樣發現含有過氧化鈣的明膠甲基丙烯酸水凝膠能夠持續（6 d）釋放氧氣，改善缺氧條件下軟骨細胞的存活率。Wang 等[108]將含有過氧化鈣的明膠微球和含有 BMSCs 的海藻酸鈉/明膠水凝膠復合在 3D 打印多層多孔管狀 PCL/nHA 支架內部，構建細胞-支架復合物并用于修復兔股骨頭壞死。體外研究結果發現該復合支架能夠長時間（19 d）持續釋放氧氣，并且能夠維持 BMSCs 在低氧環境（1%）下的增殖；體內研究結果證實與不含過氧化鈣微球的支架相比，該復合支架能夠提高外源性 BMSCs 的存活率，減少細胞凋亡，從而促進骨組織和血管再生。
總的來說，培養環境中的氧濃度對干細胞的命運起著非常重要的作用，然而由于目前研究缺乏統一的實驗參數和干細胞種類，不同氧濃度對于干細胞的分化作用仍需要進一步研究。此外，腱骨界面不僅在細胞、結構組成以及力學性能方面具有梯度變化，細胞所處的氧環境也具有相似變化，未來研究需要同時關注肌腱和骨組織中的氧濃度，在設計相應支架時還要考慮尋找一合適氧濃度來支持相應部位細胞的成肌腱、成軟骨和成骨表型。
5 力學刺激
除了組織環境中的氧濃度會影響損傷組織修復，力學刺激也會對腱骨界面組織的發育和再生起到重要作用。在生物發育階段，力學刺激影響骨、軟骨和肌腱的發育，對于骨來說，力學刺激增加（例如體力活動）會導致骨密度增加，力學刺激減少（例如石膏固定和臥床休息等）則會導致骨密度降低[109]。對于軟骨和肌腱來說，力學刺激對軟骨和肌腱的發育、穩態及功能至關重要，去除力學刺激會損害軟骨和肌腱的結構，從而導致相應疾病發生[110-111]。部分學者通過 A 型肉毒桿菌毒素麻痹大鼠岡上肌，觀察力學刺激在肩袖損傷修復中的作用，結果發現與生理鹽水注射組相比，肌肉麻痹組岡上肌體積減少，界面的纖維軟骨發育延遲，礦化骨也減少，同時破骨細胞活性增高，從而延緩了腱骨界面的發育[21]。顯而易見，來自肌肉和肌腱的力學刺激有助于腱骨界面結構發育，從而形成具有力學性能梯度變化的結構，實現有效的力學傳遞和降低應力集中。
在組織工程領域，已有學者使用動態培養（例如生物反應器）方法對細胞施加不同力學刺激，來模擬人體生理器官的力學環境，誘導細胞增殖、分化以及體外形成新的組織用于修復[112]。Elashry 等[113]將 ADSCs 接種于二氧化硅/膠原納米復合材料，并將細胞-支架復合物放入生物反應器中培養，結果發現流體剪切應力能夠促進 BMSCs 的 ALP 以及成骨相關基因（Runx2）表達。除了通過生物反應器的方法使細胞感受力學刺激外，目前有學者制備出能夠感受外來刺激（例如磁場或超聲波），從而使自身結構發生變化的支架用于組織修復。Min 等[114]通過模板輔助電沉積和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽復合技術制備出具備磁性的鈷鐵納米線圈，在外來磁場作用下，納米線圈具有“開”和“關”兩種形態，體外研究結果發現納米線圈在“開”的形態下能夠促進 MSCs 黏附，并通過 Yes 相關蛋白與轉錄共激活因子 PDZ 結合基序（YAP/TAZ）力學傳導通路促進干細胞成骨分化；體內研究結果發現在外來磁場作用下，裸鼠皮下埋植的磁性納米線圈仍然能夠促進注射在材料表面的 MSCs 黏附以及成骨相關基因（Runx2）表達。Camarero-Espinosa 等[115]使用 3D 打印技術制備了 PCL/聚乳酸混合 Janus 支架，該支架能夠將外部超聲產生的聲學信號轉換成機械納米振動的力學信號作用于干細胞，結果發現在外來超聲波作用下，Janus 支架能夠促進 BMSCs 增殖、基質沉積和成骨相關基因（Runx2 和骨鈣素）的表達，并且該支架是通過激活電壓門控鈣離子通道，從而增強 BMSCs 的成骨分化。
目前多數研究仍在探索力學刺激對于干細胞增殖、黏附、遷移和分化的影響以及相關作用機制，還未設計和制備出用于腱骨界面修復的力學刺激支架。相反，多數已設計的新型支架僅在靜態細胞培養下探討修復效果，往往忽視了力學刺激對腱骨界面愈合的影響。因此，未來研究可結合動態培養系統來控制環境中的力學刺激，從而制備具有梯度變化的材料界面，增強支架對干細胞的調控。
6 小結
近年來界面組織工程技術取得了很大進步，然而關于腱骨界面發育和再生的機制仍未探明，研究者們一直試圖通過了解再生過程中所涉及的不同信號來重現界面組織的復雜性。對于種子細胞和生長因子，了解天然腱骨界面中多種細胞的相互作用尤為重要，包括細胞與細胞間的作用、細胞和 ECM 之間的作用以及旁分泌的作用。對于生物材料，可以通過多種技術手段來協同設計生物材料的特性，以模擬天然腱骨界面的微觀結構、基質組成和力學特點。最后，腱骨愈合和再生的最佳策略不僅需要使用具有梯度變化的生物材料，還需要細胞、生長因子和特定培養條件（例如氧濃度和力學刺激）的結合。盡管越來越多證據表明種子細胞、生長因子和生物材料的治療有利于腱骨界面愈合，但相應治療手段的臨床轉化仍然是一個非常緩慢的過程。
作者貢獻：何樹坤負責資料收集和文章撰寫；秦廷武負責對文章審閱和修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點。
