引用本文： 李矛, 白玉龍, 李淼, 周建偉. 兩種去抗原異種骨性能評價及修復大鼠顱骨缺損實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(10): 1303-1310. doi: 10.7507/1002-1892.202103177 復制
嚴重創傷、骨病造成的骨缺損需要使用植骨材料進行填充、修復和重建。自體骨移植一直被認為是骨缺損修復“金標準”，但可供移植的骨源有限，且存在術后供區疼痛、感染等問題[1]。同種異體骨來源于捐獻者的骨組織，經過加工處理制備而成，其臨床療效僅次于自體骨[2]；但骨來源同樣受限，且存在免疫排斥反應及傳染易感病毒的風險[3]。人工合成材料如生物陶瓷和金屬植骨材料，雖然來源不受限制，無免疫排斥反應和疾病傳播風險，但其結構、成分、力學特性無法比擬天然骨組織，生物活性欠缺，臨床治療效果不甚理想[3]。因此，研制和開發可替代同種異體骨、生物惰性陶瓷和金屬植骨材料實現骨再生的骨修復材料，仍是目前植骨材料研究的焦點和重點[4]。
動物源性骨修復材料的成分與結構和人骨相似度較高，具有較好的生物相容性和力學特性，并且來源充分，不受限制，被視為具有骨修復潛力的生物支架[5]。隨著技術發展，異種骨支架的免疫原性問題也逐漸被解決[6-7]。常用的異種骨支架有脫鈣骨基質（decalcified bone matrix，DBM）（去無機質支架）和煅燒骨（去有機質支架），分別保留了骨的有機成分和無機成分。因其保留了骨的天然空隙結構，因此常作為組織工程支架搭載生長因子、細胞等用于骨或軟骨組織修復[8-11]。但上述兩種不同組分材料的理化性能、抗原性及成骨性能差異尚未見報道。本研究采用超臨界 CO2 脫脂技術結合脫鈣和煅燒工藝制備了兩種去抗原異種骨支架——DBM 和煅燒骨，并通過理化性能表征和體內/外實驗對比研究了兩種支架的理化性質差異以及對大鼠顱骨缺損的修復效果，以期為不同情況下選擇恰當的異種骨支架提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、材料及主要試劑、儀器
6 周齡雄性 SD 大鼠 24 只，體質量（200±10）g，由上海睿太莫斯生物科技有限公司提供，實驗操作均在上海睿太莫斯生物科技有限公司動物實驗室完成。成年豬股骨，購自上海明珠湖肉食品有限公司。小鼠成纖維細胞 L-929、小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1（中國科學院細胞庫）。
高純 CO2（上海雋頂氣體銷售有限公司）；無水乙醇、過氧化氫（上海波維化學試劑有限公司）；RPMI 1640 培養液（HyClone 公司，美國）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/鏈霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）；刀豆蛋白、刀豆球蛋白 A（Con-A）、人外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；高密度聚乙烯（批號：1546707，美國藥典委員會）。
HA220-50-10 型超臨界萃取裝置（江蘇海安華陽超臨界科技有限公司）；SX 系列箱式電阻爐（紹興滬越科學實驗儀器廠）；KQ250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；CO2 培養箱（濟南鑫貝生物技術有限公司）；酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；EG1150 H 病理組織包埋機（Leica 公司，德國）；倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；Sirion 200 場發射掃描電鏡（FEL 公司，美國）；SL200C 全自動接觸角測量儀（上海梭倫信息科技有限公司）；Skyscan1172 Micro-CT（Bruker 公司，比利時）。
1.2 DBM 和煅燒骨的制備
1.2.1 DBM
取成年豬股骨，剔除肌肉、韌帶、骨膜等軟組織。利用環形鉆切取松質骨為直徑 5 mm、高 9 mm 的圓柱狀骨塊，用高壓水槍反復沖洗，沖去骨髓、血液等成分。將沖洗后的松質骨塊用無水乙醇漂洗 3 次，每次 5 min。然后置于超臨界 CO2 萃取設備進行脫脂處理，設置脫脂溫度為 50℃，壓強 35 MPa，CO2 流速 20～50 L/h，夾帶劑為 3% 過氧化氫，脫脂時間 5 h。將脫脂后骨塊放入錐形瓶，按照料液比 1 g∶30 mL 加入 0.5 mol/L 鹽酸，于搖床上進行動態脫鈣，設置轉速為 130 r/min，溫度為室溫。之后用純化水沖洗骨塊 5 min，再放置于盛有純化水的超聲波清洗設備進行超聲清洗，清洗功率 35 Hz，時間 30 min；重復清洗 1 遍。將骨塊置于冷凍干燥設備進行干燥；干燥后骨塊按照使用需要切割或研磨成更小顆粒（直徑 0.25～1.00 mm），PA/PE 復合尼龍袋密封包裝后，60Co 輻照滅菌（25 kGy），備用。
1.2.2 煅燒骨
取成年豬股骨，同 DBM 制備脫脂后骨塊置于 80℃ 干燥箱，干燥 2 h，然后于箱式電阻爐煅燒，溫度 350℃，時間 12 h。煅燒結束后取出骨塊，放置于盛有純化水的超聲波清洗機進行超聲清洗，清洗功率 35 Hz，時間 30 min。將骨塊置于冷凍干燥設備進行干燥；干燥后骨塊按照 DBM 制樣方式粉碎，密封包裝，60Co 輻照滅菌（25 kGy），備用。
1.3 材料理化性能表征
1.3.1 材料密度測量
隨機選取 DBM 和煅燒骨（直徑 5 mm、高 6 mm 圓柱）各 5 個樣本，稱取質量并計算密度。
1.3.2 pH 值檢測
取 DBM 和煅燒骨各 2 g，加入 40 mL 新煮沸晾冷的蒸餾水，置于超聲波清洗機超聲清洗 10 min 后靜止 10 min，用 pH 計測定溶液 pH 值，重復 3 次，取均值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
隨機選取 DBM 和煅燒骨各 3 個樣本，用手術刀片將圓柱狀骨塊切成 3 等份，掃描電鏡于 5 kV 電壓下觀察材料表面結構及形貌，并測量材料孔徑大小。
1.3.4 表面接觸角測量
隨機選取 DBM 和煅燒骨各 3 個樣本，用全自動接觸角測量儀測量樣品表面接觸角。每個樣品重復測量 3 次，取均值。
1.4 材料體外細胞實驗
1.4.1 細胞毒性實驗
無菌環境下稱取一定量 DBM 和煅燒骨，按照 0.1 g/mL 浸提比例，加入無血清 RPMI 1640 培養液，于（37±1）℃ 恒溫培養箱中浸提（72±2）h，獲得兩種材料浸提液。
取小鼠 L-929 細胞加入含 10%FBS、1% 雙抗的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養，0.25% 胰蛋白酶傳代。將 100 μL 小鼠 L-929 細胞懸液以 1.0×105 個/mL 密度接種于 96 孔板中，待細胞長滿后棄去培養基，PBS 洗滌 2 次，然后分別加入 100 μL 兩種材料浸提液（DBM 組、煅燒骨組），并設置陽性對照組（加入含 20%DMSO 的細胞培養液）、陰性對照組［加入高密度聚乙烯浸提液（按照 DBM 浸提條件制備）］、空白對照組（加入新鮮細胞培養液）。繼續培養 24 h 后，通過 MTT 法檢測各組細胞活力 ［以酶標儀測量波長 570 nm（參照波長為 650 nm）處吸光度（A）值計算］。同時，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
根據《GB/T16886.5-2017 醫療器械生物學評價 第 5 部分：體外細胞毒性試驗》判定標準：細胞活性下降>30% 認為有細胞毒性（定量）；或超過 50% 的細胞呈圓縮狀體、無細胞質內顆粒，大范圍溶解，可觀察到超過 50% 細胞生長抑制現象，認為有細胞毒性（定性）。
1.4.2 成骨細胞增殖實驗
用純化水和乙醇分別清洗兩種材料 3 次，并進行冷凍干燥；之后將樣品置于 24 孔培養板中，每個樣品 3 個復孔；然后將 1.5 mL 含 1×104 個小鼠 MC3T3-E1 細胞的細胞懸液接種至樣品上；將培養板輕輕轉移至 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱培養。培養 1、4、7 d 后，PBS 輕輕洗滌，用 MTT 法檢測材料表面細胞數量，以酶標儀測量 492 nm 處的 A 值表示。另外，取培養 7 d 兩種支架，PBS 洗滌 3 次，每次 1 min，0.3% 戊二醛固定 12 h，乙醇梯度脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察小鼠 MC3T3-E1 細胞的形態和生長特征。
1.5 材料免疫原性評價
1.5.1 DNA 殘留檢測
采用徐麗明等[12]的方法檢測 DBM 和煅燒骨材料中 DNA 殘留量，以成年豬股骨作為對照。
1.5.2 人外周血淋巴細胞增殖實驗
無菌環境下分別稱取 0.3 g DBM 和煅燒骨，置于 10 mL 無菌離心管中，加入 3 mL 無血清 RPMI 1640 培養液，勻漿 5 min，靜置 3 min 取上清液待測。
淋巴細胞提取與培養：取成年健康志愿者（無吸煙史）的外周血 10 mL，加至含 1 mL 250 U 肝素鈉（PBS 配置）的離心管中，并加入 11 mL PBS，混勻。傾斜 45° 持離心管，加入 6.6 mL 人外周血淋巴細胞分離液，常溫下以 900×g 離心 30 min。吸棄最上層分離液，并吸取下一層單個核細胞分離液移入新的離心管中，加入 3 倍體積 PBS 洗滌細胞。常溫下以 400×g 離心 10 min，棄上清液。重復以上步驟洗滌細胞，以去除血小板。加入含 10%FBS、1% 雙抗的 RPMI 1640 培養基重懸細胞，吸取至培養皿中，37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態。
淋巴細胞增殖檢測：實驗分為陰性組（添加含 10%FBS 的 RPMI 1640 培養液）、陽性組（含 10%FBS、5 μg/mL ConA 的 RPMI 1640 培養液）、實驗組 1（添加 DBM 浸提液）、實驗組 2（添加煅燒骨浸提液）共 4 組，每組設 3 個復孔。每孔中加入 100 μL 密度為 1×106 個/mL 的淋巴細胞懸液，置于 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養 3 d；加入 10%CCK-8，繼續孵育 2～4 h，再將培養液轉移至 96 孔板中，每孔 100 μL，酶標儀 450 nm 下測量 A 值。
1.6 動物體內實驗
取 SD 大鼠 24 只，以 3% 戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，俯身固定于手術臺，顱頂備皮，消毒。沿顱骨頂中線作 2 cm 長縱切口，依次分離皮膚、皮下組織和骨膜。使用直徑 5 mm 環形鉆于中線左右兩側分別制備 1 個圓形全層骨缺損，注意勿損傷腦組織。取其中 12 只大鼠，左右側骨缺損處分別隨機植入粒徑為 0.25～1.00 mm 的 DBM（DBM 組）或不植入任何材料（空白對照組）；剩余 12 只大鼠左右側骨缺損處分別隨機植入粒徑 0.25～1.00 mm 煅燒骨（煅燒骨組）或不植入任何材料（空白對照組）。逐層縫合骨膜、肌肉和皮膚，待動物蘇醒后送回動物實驗室繼續飼養。
1.6.1 大體觀察
術后觀察動物存活及活動情況以及切口愈合情況；術后 4、8 周處死大鼠（DBM 組和煅燒骨組 n=6，空白對照組 n=12），沿顱骨中線切開并簡單剝離皮下組織，取出實驗區顱骨觀察大體形態。之后將樣本置于 10% 甲醛固定 24 h 以上，進行以下觀測。
1.6.2 Micro-CT 觀察
取標本經流水沖洗 1 h 后，Micro-CT 觀察顱骨缺損修復情況；掃描條件：電流 112 μA，電壓 80 kV。利用 NRecon（1.7.3.0）圖像分析軟件定量分析新生骨體積百分比（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.6.3 組織學觀察
取標本經 50% 甲酸脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（片厚 4 μm）后，行 HE 染色觀察顱骨缺損修復情況。
1.7 統計學方法
采用 SPSS20 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間及組內多時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料理化性能表征
DBM 密度為（0.212 2±0.017 2）g/cm3，顯著小于煅燒骨（0.575 7±0.039 2）g/cm3，差異有統計學意義（t=18.971，P=0.042）。DBM pH 值為 5.5，呈弱酸性；煅燒骨 pH 值略高，為 6.1。掃描電鏡觀察示，材料表面光滑且為多孔結構（圖 1）；兩種材料孔徑均在 160～800 μm 之間。DBM 表面呈現疏水特性，液滴接觸材料表面 1 s 時平均接觸角為 110.85°，2 s 時為 108.21°，3 s 時為 102.36°；而煅燒骨表現為親水性，液滴接觸材料表面不到 1 s，接觸角迅速變為 0°（圖 2）。
圖1
掃描電鏡觀察 DBM 和煅燒骨結構及形貌（×100）
a. DBM；b. 煅燒骨
Figure1. Scanning electron microscope observation of the structure and morphology of DBM and calcined bone (×100)a. DBM; b. Calcined bone
圖2
DBM 和煅燒骨表面接觸角檢測
a. DBM；b. 煅燒骨
Figure2. Surface contact angle detection of DBM and calcined bonea. DBM; b. Calcined bone
2.2 材料體外細胞實驗
2.2.1 細胞毒性實驗
定量檢測示，DBM 組、煅燒骨組、空白對照組、陰性對照組細胞活性均超過 90%，分別為 95.7%±1.0%、94.4%±2.4%、100.0%、102.6%±1.5%，顯著高于陽性對照組 12.3%±1.0%，差異有統計學意義（P<0.05）；其中 DBM 組和煅燒骨組細胞活性差異無統計學意義（P>0.05）。倒置顯微鏡觀察示，兩種支架材料浸提液培養的細胞形態較好，無細胞圓縮、大范圍溶解等現象（圖 3）。因此，兩種支架材料均未表現出細胞毒性。
圖3
兩種材料浸提液與小鼠 L-292 細胞共培養形態觀察（倒置顯微鏡×100）
a. DBM 組；b. 煅燒骨組
Figure3. Morphology observation of co-culture of material extract and mouse L-292 cells (Inverted microscope×100)a. DBM group; b. Calcined bone group
2.2.2 成骨細胞增殖實驗
MTT 法檢測示，培養 1、4、7 d 成骨細胞在兩種材料表面正常附著生長，細胞數量隨時間延長而增加。各時間點 DBM 組A 值均顯著高于煅燒骨組，差異有統計學意義（P<0.05）；并且隨時間延長，兩組A 值差值也逐漸增大。見圖 4a。
圖4
兩種材料成骨細胞增殖實驗
a. MTT 法檢測；b. 掃描電鏡觀察成骨細胞在 DBM（左）和煅燒骨（右）表面黏附生長情況（×500）
Figure4. Osteoblast proliferation experiment of two materialsa. Detection by MTT method; b. Scanning electron microscope observation of the adhesion and growth of osteoblasts on the surface of DBM (left) and calcined bone (right) (×500)
掃描電鏡觀察示，成骨細胞在兩種材料表面形態均較好，可見細胞突起附著于材料表面，細胞呈正常梭形或多角形，有偽足狀結構，細胞質豐富，細胞成片生長。見圖 4b。
2.3 材料免疫原性評價
2.3.1 DNA 殘留檢測
骨原材料、DBM 和煅燒骨 DNA 殘留量分別為（152.48±13.25）、（25.68±3.00）、（2.26±0.93）ng/mg 干重，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3.2 人外周血淋巴細胞增殖實驗
陰性組、陽性組、實驗組 1 和實驗組 2 的 A 值分別為 0.126 4±0.005 3、0.239 9±0.006 2、0.112 5±0.004 9、0.113 4±0.003 6，實驗組 1 和實驗組 2 與陰性組比較差異無統計學意義（P>0.05），但均顯著低于陽性組，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 動物體內實驗
2.4.1 大體觀察
術后動物活動良好，無死亡。手術切口均于術后 2 周愈合，皮膚未見紅腫。術后 4、8 周取材觀察示，手術部位已被毛發覆蓋，組織形態良好，未見壞死。
2.4.2 Micro-CT 觀察
術后 4、8 周，空白對照組缺損明顯，未見新骨生成；煅燒骨組及 DBM 組修復效果明顯優于空白對照組。見圖 5。
圖5
術后各組顱骨 Micro-CT 掃描觀察
從左至右分別為空白對照組、DBM 組、煅燒骨組，黃色為支架材料，灰色為新生骨 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure5. Micro-CT scan observation of skulls in each group at 4 and 8 weeks after operationFrom left to right for blank control group, DBM group, and calcined bone group, respectively; yellow for the scaffold material and gray for the new bone a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
術后隨時間延長，各組 BV/TV 均逐漸增加，術后 4、8 周間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 4、8 周煅燒骨組和 DBM 組 BV/TV 均顯著高于空白對照組，術后 4 周煅燒骨組顯著高于 DBM 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 DBM 組和煅燒骨組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后 4、8 周各組 BV/TV 比較（
）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at 4 and 8 weeks after operation (
)
2.4.3 組織學觀察
HE 染色示，術后 4 周，空白對照組缺損部位被纖維結締組織填充，缺損明顯，未見骨長入；DBM 組在缺損處可見植入的 DBM 基質，材料周圍可見少量淋巴細胞浸潤，同時可見成骨細胞及新生骨形成；煅燒骨組因組織脫鈣處理后幾乎觀察不到材料，只留下不規則的圓形空隙，空隙周圍可見淋巴細胞浸潤，同時能觀察到成骨細胞及新生骨形成。術后 8 周，空白對照組缺損處被大量纖維組織包裹，未見骨長入；DBM 組可見材料部分降解，新生骨呈“島狀”分布于缺損區域，同時可見新骨由缺損四周向中間生長，骨缺損體積逐漸縮小；煅燒骨組材料空隙分布均勻，材料未明顯降解，在材料周圍形成連續的互相連接的新生“骨橋”，同時可見新骨由缺損四周向中間生長，骨缺損體積逐漸縮小。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組大鼠 HE 染色觀察
右圖（×5）為左圖（×20）方框局部放大圖，紅箭頭示宿主骨、藍箭頭示材料、綠箭頭示新骨a、b. 術后 4、8 周空白對照組；c、d. 術后 4、8 周 DBM 組；e、f. 術后 4、8 周煅燒骨組
Figure6. HE staining observation of rats in each group at various time points after operationThe picture on the right (×5) was a partial enlarged view of the box on the left picture (×20). The red arrow indicated the host bone, the blue arrow indicated the material, and the green arrow indicated the new bone a, b. Blank control group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; c, d. DBM group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; e, f. Calcined bone group at 4 and 8 weeks after operation, respectively
3 討論
骨科及口腔科對植骨材料需求較大。據報道，20 世紀末全球植骨材料的使用量已超過 200 萬件，其中美國超過 50 萬件[13]，如今預計使用量已翻了幾倍，自體骨或同種異體骨遠遠無法滿足臨床需求。人工合成骨與動物來源的骨材料來源充分，可工業化大規模生產，然而國內已上市的產品卻寥寥無幾，大部分市場仍被進口產品占據。尤其在口腔領域，瑞士 Geistlich 公司的 Bio-Oss 骨粉（牛骨制備）在全球占據了較大的市場份額。
異種骨修復材料因具有類似于人骨的天然多孔結構，有利于細胞、血管、組織長入并促進新骨生成。但因早期加工制備技術限制，導致無法徹底清除抗原，免疫排斥反應發生率較高。研究發現，異種骨主要抗原成分是血液、骨髓、各種細胞成分及 α-半乳糖基抗原（廣泛存在于豬、牛和其他低等動物體內的一種含有聚乳糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂）[14-15]。未處理徹底的血清、細胞、蛋白和多種靶抗原分子可與人體內的抗體結合，激活補體導致超急性排斥反應發生，也可能持續刺激和誘導宿主免疫系統的 T 細胞、B 細胞及相關免疫系統產生免疫應答[16]。因此，如何有效清洗骨組織去除抗原，一直是異種骨研究的重點。研究人員嘗試了多種物理和化學方法去除抗原，如深低溫冷凍法、反復凍融、煅燒法、化學試劑處理法（如 SDS、Triton X-100、過氧化氫等）以及生物酶處理法等[17-18]，其中煅燒法最為簡單，去抗原也最為徹底，且能夠徹底殺滅病原微生物。采用高溫煅燒制備異種骨，應注意煅燒前的清潔和處理，同時控制好煅燒溫度和時間。煅燒前清潔不徹底會導致殘渣留在松質骨孔隙，不易清理；煅燒溫度過低，有機物燃燒不充分，溫度過高可能導致無機物結晶度升高，進而影響其降解性[19-20]。李龍飛等[21]采用不同燒結溫度對豬骨進行煅燒，發現隨著煅燒溫度由 600℃ 升至 1 000℃，晶體的結晶度明顯升高。Bio-Oss 即利用小牛骨經過強堿處理后，低溫（約 300℃）煅燒制備[22]。煅燒后的骨支架保留了松質骨天然的多孔結構，具有很好的骨傳導性能，但不具備骨誘導活性。
DBM 則是通過酸脫去骨中礦物質，使得內源性 BMP-2 得以暴露，從而發揮骨誘導作用。其主要成分為膠原蛋白，脫鈣后仍保持著多孔骨架結構，為細胞、血管、組織的長入提供有利環境，因此 DBM 兼具了骨傳導性和骨誘導性。研究表明，BMP-2 具有高度保守性，其氨基酸序列在哺乳動物中是相同的，在不同種屬間 BMP-2 可以發揮相同作用[23]。因此，保留異種骨的 BMP-2 對于提高異種骨修復材料的成骨活性具有顯著意義。
本研究采用高壓水槍沖洗可有效去除血液、骨髓等可見污物，進而利用超臨界 CO2 技術對異種骨進行深度清潔，進一步減少脂肪和其他抗原成分，通過脫鈣和煅燒工藝制備異種骨來源的有機物支架和無機物支架。兩種支架主要成分不同，煅燒骨主要成分為羥基磷灰石，支架密度較大；DBM 主要成分為膠原蛋白，支架密度較小。兩種材料 pH 值均在 5.5～6.1 之間，符合骨植入材料的要求。二者均保留了骨的天然多孔結構，其孔徑和孔隙率無顯著差異。煅燒骨支架親水性更好，DBM 支架由于主要成分為膠原，而膠原蛋白主要為疏水性分子，所以其親水性較差。細胞體外實驗結果顯示，煅燒和脫鈣制備的兩種異種骨支架均未表現出細胞毒性，并且兩種支架都能促進成骨細胞增殖，DBM 促增殖效果優于煅燒骨，這可能與 DBM 所含內源性 BMP-2 釋放有關。對兩種材料免疫原性評價結果顯示，DBM 和煅燒骨經過軟組織去除、清洗、超臨界 CO2 萃取等工序處理，其主要抗原細胞已被大量去除，DNA 殘留水平遠低于文獻報道的評價組織材料脫細胞程度的標準：50 ng/mg 干重[24]。同時，人外周血淋巴細胞實驗表明，兩種支架均不會刺激外周血淋巴細胞增殖和分化。大鼠顱骨缺損修復實驗結果顯示，兩種支架材料的成骨方式略有差異。煅燒骨支架降解性較差，術后 8 周仍可見大量材料殘留；其主要依靠骨傳導作用成骨，組織學結果顯示新生骨圍繞支架爬行。DBM 支架降解性較好，術后 8 周僅有少量材料殘留，組織學觀察可見新生骨呈點狀、片狀分布，成骨作用明顯。兩種材料在 Micro-CT 下顯影程度不同，DBM 弱顯影，而煅燒骨顯影較亮。術后 4 周時，煅燒骨 BV/TV 大于脫鈣骨，但是從組織學結果看并無顯著差異，這可能與煅燒骨支架緩慢降解釋放 Ca2+，形成密度類似于新骨的高 Ca2+ 區域有關。
綜上述，不同類型的異種骨支架其理化性能、降解性和體內成骨作用可能存在差異。DBM 親水性差，降解性較好，內源性 BMP-2 因脫鈣處理得以充分暴露，具有很好的成骨活性；鍛燒骨親水性較好，降解性較差，因高溫煅燒而失活，但天然多孔結構仍為成骨提供了良好條件。兩種支架均無免疫原性且能夠促進大鼠顱骨缺損修復，具有一定應用前景。
作者貢獻：李矛直接參與材料制備、動物實驗操作與結果評價，數據收集整理以及文章撰寫；白玉龍參與材料制備與表征、動物實驗、文章復核；李淼參與細胞實驗和數據分析；周建偉提供實驗設計思路并把控實驗正確實施、文章審核修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會（TRECKY2021-060）及上海睿太莫斯生物科技有限公司動物福利倫理委員會批準（RM200214）。實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0004。
嚴重創傷、骨病造成的骨缺損需要使用植骨材料進行填充、修復和重建。自體骨移植一直被認為是骨缺損修復“金標準”，但可供移植的骨源有限，且存在術后供區疼痛、感染等問題[1]。同種異體骨來源于捐獻者的骨組織，經過加工處理制備而成，其臨床療效僅次于自體骨[2]；但骨來源同樣受限，且存在免疫排斥反應及傳染易感病毒的風險[3]。人工合成材料如生物陶瓷和金屬植骨材料，雖然來源不受限制，無免疫排斥反應和疾病傳播風險，但其結構、成分、力學特性無法比擬天然骨組織，生物活性欠缺，臨床治療效果不甚理想[3]。因此，研制和開發可替代同種異體骨、生物惰性陶瓷和金屬植骨材料實現骨再生的骨修復材料，仍是目前植骨材料研究的焦點和重點[4]。
動物源性骨修復材料的成分與結構和人骨相似度較高，具有較好的生物相容性和力學特性，并且來源充分，不受限制，被視為具有骨修復潛力的生物支架[5]。隨著技術發展，異種骨支架的免疫原性問題也逐漸被解決[6-7]。常用的異種骨支架有脫鈣骨基質（decalcified bone matrix，DBM）（去無機質支架）和煅燒骨（去有機質支架），分別保留了骨的有機成分和無機成分。因其保留了骨的天然空隙結構，因此常作為組織工程支架搭載生長因子、細胞等用于骨或軟骨組織修復[8-11]。但上述兩種不同組分材料的理化性能、抗原性及成骨性能差異尚未見報道。本研究采用超臨界 CO2 脫脂技術結合脫鈣和煅燒工藝制備了兩種去抗原異種骨支架——DBM 和煅燒骨，并通過理化性能表征和體內/外實驗對比研究了兩種支架的理化性質差異以及對大鼠顱骨缺損的修復效果，以期為不同情況下選擇恰當的異種骨支架提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、材料及主要試劑、儀器
6 周齡雄性 SD 大鼠 24 只，體質量（200±10）g，由上海睿太莫斯生物科技有限公司提供，實驗操作均在上海睿太莫斯生物科技有限公司動物實驗室完成。成年豬股骨，購自上海明珠湖肉食品有限公司。小鼠成纖維細胞 L-929、小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1（中國科學院細胞庫）。
高純 CO2（上海雋頂氣體銷售有限公司）；無水乙醇、過氧化氫（上海波維化學試劑有限公司）；RPMI 1640 培養液（HyClone 公司，美國）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/鏈霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）；刀豆蛋白、刀豆球蛋白 A（Con-A）、人外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；高密度聚乙烯（批號：1546707，美國藥典委員會）。
HA220-50-10 型超臨界萃取裝置（江蘇海安華陽超臨界科技有限公司）；SX 系列箱式電阻爐（紹興滬越科學實驗儀器廠）；KQ250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；CO2 培養箱（濟南鑫貝生物技術有限公司）；酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；EG1150 H 病理組織包埋機（Leica 公司，德國）；倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；Sirion 200 場發射掃描電鏡（FEL 公司，美國）；SL200C 全自動接觸角測量儀（上海梭倫信息科技有限公司）；Skyscan1172 Micro-CT（Bruker 公司，比利時）。
1.2 DBM 和煅燒骨的制備
1.2.1 DBM
取成年豬股骨，剔除肌肉、韌帶、骨膜等軟組織。利用環形鉆切取松質骨為直徑 5 mm、高 9 mm 的圓柱狀骨塊，用高壓水槍反復沖洗，沖去骨髓、血液等成分。將沖洗后的松質骨塊用無水乙醇漂洗 3 次，每次 5 min。然后置于超臨界 CO2 萃取設備進行脫脂處理，設置脫脂溫度為 50℃，壓強 35 MPa，CO2 流速 20～50 L/h，夾帶劑為 3% 過氧化氫，脫脂時間 5 h。將脫脂后骨塊放入錐形瓶，按照料液比 1 g∶30 mL 加入 0.5 mol/L 鹽酸，于搖床上進行動態脫鈣，設置轉速為 130 r/min，溫度為室溫。之后用純化水沖洗骨塊 5 min，再放置于盛有純化水的超聲波清洗設備進行超聲清洗，清洗功率 35 Hz，時間 30 min；重復清洗 1 遍。將骨塊置于冷凍干燥設備進行干燥；干燥后骨塊按照使用需要切割或研磨成更小顆粒（直徑 0.25～1.00 mm），PA/PE 復合尼龍袋密封包裝后，60Co 輻照滅菌（25 kGy），備用。
1.2.2 煅燒骨
取成年豬股骨，同 DBM 制備脫脂后骨塊置于 80℃ 干燥箱，干燥 2 h，然后于箱式電阻爐煅燒，溫度 350℃，時間 12 h。煅燒結束后取出骨塊，放置于盛有純化水的超聲波清洗機進行超聲清洗，清洗功率 35 Hz，時間 30 min。將骨塊置于冷凍干燥設備進行干燥；干燥后骨塊按照 DBM 制樣方式粉碎，密封包裝，60Co 輻照滅菌（25 kGy），備用。
1.3 材料理化性能表征
1.3.1 材料密度測量
隨機選取 DBM 和煅燒骨（直徑 5 mm、高 6 mm 圓柱）各 5 個樣本，稱取質量并計算密度。
1.3.2 pH 值檢測
取 DBM 和煅燒骨各 2 g，加入 40 mL 新煮沸晾冷的蒸餾水，置于超聲波清洗機超聲清洗 10 min 后靜止 10 min，用 pH 計測定溶液 pH 值，重復 3 次，取均值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
隨機選取 DBM 和煅燒骨各 3 個樣本，用手術刀片將圓柱狀骨塊切成 3 等份，掃描電鏡于 5 kV 電壓下觀察材料表面結構及形貌，并測量材料孔徑大小。
1.3.4 表面接觸角測量
隨機選取 DBM 和煅燒骨各 3 個樣本，用全自動接觸角測量儀測量樣品表面接觸角。每個樣品重復測量 3 次，取均值。
1.4 材料體外細胞實驗
1.4.1 細胞毒性實驗
無菌環境下稱取一定量 DBM 和煅燒骨，按照 0.1 g/mL 浸提比例，加入無血清 RPMI 1640 培養液，于（37±1）℃ 恒溫培養箱中浸提（72±2）h，獲得兩種材料浸提液。
取小鼠 L-929 細胞加入含 10%FBS、1% 雙抗的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養，0.25% 胰蛋白酶傳代。將 100 μL 小鼠 L-929 細胞懸液以 1.0×105 個/mL 密度接種于 96 孔板中，待細胞長滿后棄去培養基，PBS 洗滌 2 次，然后分別加入 100 μL 兩種材料浸提液（DBM 組、煅燒骨組），并設置陽性對照組（加入含 20%DMSO 的細胞培養液）、陰性對照組［加入高密度聚乙烯浸提液（按照 DBM 浸提條件制備）］、空白對照組（加入新鮮細胞培養液）。繼續培養 24 h 后，通過 MTT 法檢測各組細胞活力 ［以酶標儀測量波長 570 nm（參照波長為 650 nm）處吸光度（A）值計算］。同時，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
根據《GB/T16886.5-2017 醫療器械生物學評價 第 5 部分：體外細胞毒性試驗》判定標準：細胞活性下降>30% 認為有細胞毒性（定量）；或超過 50% 的細胞呈圓縮狀體、無細胞質內顆粒，大范圍溶解，可觀察到超過 50% 細胞生長抑制現象，認為有細胞毒性（定性）。
1.4.2 成骨細胞增殖實驗
用純化水和乙醇分別清洗兩種材料 3 次，并進行冷凍干燥；之后將樣品置于 24 孔培養板中，每個樣品 3 個復孔；然后將 1.5 mL 含 1×104 個小鼠 MC3T3-E1 細胞的細胞懸液接種至樣品上；將培養板輕輕轉移至 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱培養。培養 1、4、7 d 后，PBS 輕輕洗滌，用 MTT 法檢測材料表面細胞數量，以酶標儀測量 492 nm 處的 A 值表示。另外，取培養 7 d 兩種支架，PBS 洗滌 3 次，每次 1 min，0.3% 戊二醛固定 12 h，乙醇梯度脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察小鼠 MC3T3-E1 細胞的形態和生長特征。
1.5 材料免疫原性評價
1.5.1 DNA 殘留檢測
采用徐麗明等[12]的方法檢測 DBM 和煅燒骨材料中 DNA 殘留量，以成年豬股骨作為對照。
1.5.2 人外周血淋巴細胞增殖實驗
無菌環境下分別稱取 0.3 g DBM 和煅燒骨，置于 10 mL 無菌離心管中，加入 3 mL 無血清 RPMI 1640 培養液，勻漿 5 min，靜置 3 min 取上清液待測。
淋巴細胞提取與培養：取成年健康志愿者（無吸煙史）的外周血 10 mL，加至含 1 mL 250 U 肝素鈉（PBS 配置）的離心管中，并加入 11 mL PBS，混勻。傾斜 45° 持離心管，加入 6.6 mL 人外周血淋巴細胞分離液，常溫下以 900×g 離心 30 min。吸棄最上層分離液，并吸取下一層單個核細胞分離液移入新的離心管中，加入 3 倍體積 PBS 洗滌細胞。常溫下以 400×g 離心 10 min，棄上清液。重復以上步驟洗滌細胞，以去除血小板。加入含 10%FBS、1% 雙抗的 RPMI 1640 培養基重懸細胞，吸取至培養皿中，37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態。
淋巴細胞增殖檢測：實驗分為陰性組（添加含 10%FBS 的 RPMI 1640 培養液）、陽性組（含 10%FBS、5 μg/mL ConA 的 RPMI 1640 培養液）、實驗組 1（添加 DBM 浸提液）、實驗組 2（添加煅燒骨浸提液）共 4 組，每組設 3 個復孔。每孔中加入 100 μL 密度為 1×106 個/mL 的淋巴細胞懸液，置于 37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養 3 d；加入 10%CCK-8，繼續孵育 2～4 h，再將培養液轉移至 96 孔板中，每孔 100 μL，酶標儀 450 nm 下測量 A 值。
1.6 動物體內實驗
取 SD 大鼠 24 只，以 3% 戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，俯身固定于手術臺，顱頂備皮，消毒。沿顱骨頂中線作 2 cm 長縱切口，依次分離皮膚、皮下組織和骨膜。使用直徑 5 mm 環形鉆于中線左右兩側分別制備 1 個圓形全層骨缺損，注意勿損傷腦組織。取其中 12 只大鼠，左右側骨缺損處分別隨機植入粒徑為 0.25～1.00 mm 的 DBM（DBM 組）或不植入任何材料（空白對照組）；剩余 12 只大鼠左右側骨缺損處分別隨機植入粒徑 0.25～1.00 mm 煅燒骨（煅燒骨組）或不植入任何材料（空白對照組）。逐層縫合骨膜、肌肉和皮膚，待動物蘇醒后送回動物實驗室繼續飼養。
1.6.1 大體觀察
術后觀察動物存活及活動情況以及切口愈合情況；術后 4、8 周處死大鼠（DBM 組和煅燒骨組 n=6，空白對照組 n=12），沿顱骨中線切開并簡單剝離皮下組織，取出實驗區顱骨觀察大體形態。之后將樣本置于 10% 甲醛固定 24 h 以上，進行以下觀測。
1.6.2 Micro-CT 觀察
取標本經流水沖洗 1 h 后，Micro-CT 觀察顱骨缺損修復情況；掃描條件：電流 112 μA，電壓 80 kV。利用 NRecon（1.7.3.0）圖像分析軟件定量分析新生骨體積百分比（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.6.3 組織學觀察
取標本經 50% 甲酸脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（片厚 4 μm）后，行 HE 染色觀察顱骨缺損修復情況。
1.7 統計學方法
采用 SPSS20 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間及組內多時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料理化性能表征
DBM 密度為（0.212 2±0.017 2）g/cm3，顯著小于煅燒骨（0.575 7±0.039 2）g/cm3，差異有統計學意義（t=18.971，P=0.042）。DBM pH 值為 5.5，呈弱酸性；煅燒骨 pH 值略高，為 6.1。掃描電鏡觀察示，材料表面光滑且為多孔結構（圖 1）；兩種材料孔徑均在 160～800 μm 之間。DBM 表面呈現疏水特性，液滴接觸材料表面 1 s 時平均接觸角為 110.85°，2 s 時為 108.21°，3 s 時為 102.36°；而煅燒骨表現為親水性，液滴接觸材料表面不到 1 s，接觸角迅速變為 0°（圖 2）。
圖1
掃描電鏡觀察 DBM 和煅燒骨結構及形貌（×100）
a. DBM；b. 煅燒骨
Figure1. Scanning electron microscope observation of the structure and morphology of DBM and calcined bone (×100)a. DBM; b. Calcined bone
圖2
DBM 和煅燒骨表面接觸角檢測
a. DBM；b. 煅燒骨
Figure2. Surface contact angle detection of DBM and calcined bonea. DBM; b. Calcined bone
2.2 材料體外細胞實驗
2.2.1 細胞毒性實驗
定量檢測示，DBM 組、煅燒骨組、空白對照組、陰性對照組細胞活性均超過 90%，分別為 95.7%±1.0%、94.4%±2.4%、100.0%、102.6%±1.5%，顯著高于陽性對照組 12.3%±1.0%，差異有統計學意義（P<0.05）；其中 DBM 組和煅燒骨組細胞活性差異無統計學意義（P>0.05）。倒置顯微鏡觀察示，兩種支架材料浸提液培養的細胞形態較好，無細胞圓縮、大范圍溶解等現象（圖 3）。因此，兩種支架材料均未表現出細胞毒性。
圖3
兩種材料浸提液與小鼠 L-292 細胞共培養形態觀察（倒置顯微鏡×100）
a. DBM 組；b. 煅燒骨組
Figure3. Morphology observation of co-culture of material extract and mouse L-292 cells (Inverted microscope×100)a. DBM group; b. Calcined bone group
2.2.2 成骨細胞增殖實驗
MTT 法檢測示，培養 1、4、7 d 成骨細胞在兩種材料表面正常附著生長，細胞數量隨時間延長而增加。各時間點 DBM 組A 值均顯著高于煅燒骨組，差異有統計學意義（P<0.05）；并且隨時間延長，兩組A 值差值也逐漸增大。見圖 4a。
圖4
兩種材料成骨細胞增殖實驗
a. MTT 法檢測；b. 掃描電鏡觀察成骨細胞在 DBM（左）和煅燒骨（右）表面黏附生長情況（×500）
Figure4. Osteoblast proliferation experiment of two materialsa. Detection by MTT method; b. Scanning electron microscope observation of the adhesion and growth of osteoblasts on the surface of DBM (left) and calcined bone (right) (×500)
掃描電鏡觀察示，成骨細胞在兩種材料表面形態均較好，可見細胞突起附著于材料表面，細胞呈正常梭形或多角形，有偽足狀結構，細胞質豐富，細胞成片生長。見圖 4b。
2.3 材料免疫原性評價
2.3.1 DNA 殘留檢測
骨原材料、DBM 和煅燒骨 DNA 殘留量分別為（152.48±13.25）、（25.68±3.00）、（2.26±0.93）ng/mg 干重，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3.2 人外周血淋巴細胞增殖實驗
陰性組、陽性組、實驗組 1 和實驗組 2 的 A 值分別為 0.126 4±0.005 3、0.239 9±0.006 2、0.112 5±0.004 9、0.113 4±0.003 6，實驗組 1 和實驗組 2 與陰性組比較差異無統計學意義（P>0.05），但均顯著低于陽性組，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 動物體內實驗
2.4.1 大體觀察
術后動物活動良好，無死亡。手術切口均于術后 2 周愈合，皮膚未見紅腫。術后 4、8 周取材觀察示，手術部位已被毛發覆蓋，組織形態良好，未見壞死。
2.4.2 Micro-CT 觀察
術后 4、8 周，空白對照組缺損明顯，未見新骨生成；煅燒骨組及 DBM 組修復效果明顯優于空白對照組。見圖 5。
圖5
術后各組顱骨 Micro-CT 掃描觀察
從左至右分別為空白對照組、DBM 組、煅燒骨組，黃色為支架材料，灰色為新生骨 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure5. Micro-CT scan observation of skulls in each group at 4 and 8 weeks after operationFrom left to right for blank control group, DBM group, and calcined bone group, respectively; yellow for the scaffold material and gray for the new bone a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
術后隨時間延長，各組 BV/TV 均逐漸增加，術后 4、8 周間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 4、8 周煅燒骨組和 DBM 組 BV/TV 均顯著高于空白對照組，術后 4 周煅燒骨組顯著高于 DBM 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 DBM 組和煅燒骨組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后 4、8 周各組 BV/TV 比較（）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at 4 and 8 weeks after operation ()
2.4.3 組織學觀察
HE 染色示，術后 4 周，空白對照組缺損部位被纖維結締組織填充，缺損明顯，未見骨長入；DBM 組在缺損處可見植入的 DBM 基質，材料周圍可見少量淋巴細胞浸潤，同時可見成骨細胞及新生骨形成；煅燒骨組因組織脫鈣處理后幾乎觀察不到材料，只留下不規則的圓形空隙，空隙周圍可見淋巴細胞浸潤，同時能觀察到成骨細胞及新生骨形成。術后 8 周，空白對照組缺損處被大量纖維組織包裹，未見骨長入；DBM 組可見材料部分降解，新生骨呈“島狀”分布于缺損區域，同時可見新骨由缺損四周向中間生長，骨缺損體積逐漸縮小；煅燒骨組材料空隙分布均勻，材料未明顯降解，在材料周圍形成連續的互相連接的新生“骨橋”，同時可見新骨由缺損四周向中間生長，骨缺損體積逐漸縮小。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組大鼠 HE 染色觀察
右圖（×5）為左圖（×20）方框局部放大圖，紅箭頭示宿主骨、藍箭頭示材料、綠箭頭示新骨a、b. 術后 4、8 周空白對照組；c、d. 術后 4、8 周 DBM 組；e、f. 術后 4、8 周煅燒骨組
Figure6. HE staining observation of rats in each group at various time points after operationThe picture on the right (×5) was a partial enlarged view of the box on the left picture (×20). The red arrow indicated the host bone, the blue arrow indicated the material, and the green arrow indicated the new bone a, b. Blank control group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; c, d. DBM group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; e, f. Calcined bone group at 4 and 8 weeks after operation, respectively
3 討論
骨科及口腔科對植骨材料需求較大。據報道，20 世紀末全球植骨材料的使用量已超過 200 萬件，其中美國超過 50 萬件[13]，如今預計使用量已翻了幾倍，自體骨或同種異體骨遠遠無法滿足臨床需求。人工合成骨與動物來源的骨材料來源充分，可工業化大規模生產，然而國內已上市的產品卻寥寥無幾，大部分市場仍被進口產品占據。尤其在口腔領域，瑞士 Geistlich 公司的 Bio-Oss 骨粉（牛骨制備）在全球占據了較大的市場份額。
異種骨修復材料因具有類似于人骨的天然多孔結構，有利于細胞、血管、組織長入并促進新骨生成。但因早期加工制備技術限制，導致無法徹底清除抗原，免疫排斥反應發生率較高。研究發現，異種骨主要抗原成分是血液、骨髓、各種細胞成分及 α-半乳糖基抗原（廣泛存在于豬、牛和其他低等動物體內的一種含有聚乳糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂）[14-15]。未處理徹底的血清、細胞、蛋白和多種靶抗原分子可與人體內的抗體結合，激活補體導致超急性排斥反應發生，也可能持續刺激和誘導宿主免疫系統的 T 細胞、B 細胞及相關免疫系統產生免疫應答[16]。因此，如何有效清洗骨組織去除抗原，一直是異種骨研究的重點。研究人員嘗試了多種物理和化學方法去除抗原，如深低溫冷凍法、反復凍融、煅燒法、化學試劑處理法（如 SDS、Triton X-100、過氧化氫等）以及生物酶處理法等[17-18]，其中煅燒法最為簡單，去抗原也最為徹底，且能夠徹底殺滅病原微生物。采用高溫煅燒制備異種骨，應注意煅燒前的清潔和處理，同時控制好煅燒溫度和時間。煅燒前清潔不徹底會導致殘渣留在松質骨孔隙，不易清理；煅燒溫度過低，有機物燃燒不充分，溫度過高可能導致無機物結晶度升高，進而影響其降解性[19-20]。李龍飛等[21]采用不同燒結溫度對豬骨進行煅燒，發現隨著煅燒溫度由 600℃ 升至 1 000℃，晶體的結晶度明顯升高。Bio-Oss 即利用小牛骨經過強堿處理后，低溫（約 300℃）煅燒制備[22]。煅燒后的骨支架保留了松質骨天然的多孔結構，具有很好的骨傳導性能，但不具備骨誘導活性。
DBM 則是通過酸脫去骨中礦物質，使得內源性 BMP-2 得以暴露，從而發揮骨誘導作用。其主要成分為膠原蛋白，脫鈣后仍保持著多孔骨架結構，為細胞、血管、組織的長入提供有利環境，因此 DBM 兼具了骨傳導性和骨誘導性。研究表明，BMP-2 具有高度保守性，其氨基酸序列在哺乳動物中是相同的，在不同種屬間 BMP-2 可以發揮相同作用[23]。因此，保留異種骨的 BMP-2 對于提高異種骨修復材料的成骨活性具有顯著意義。
本研究采用高壓水槍沖洗可有效去除血液、骨髓等可見污物，進而利用超臨界 CO2 技術對異種骨進行深度清潔，進一步減少脂肪和其他抗原成分，通過脫鈣和煅燒工藝制備異種骨來源的有機物支架和無機物支架。兩種支架主要成分不同，煅燒骨主要成分為羥基磷灰石，支架密度較大；DBM 主要成分為膠原蛋白，支架密度較小。兩種材料 pH 值均在 5.5～6.1 之間，符合骨植入材料的要求。二者均保留了骨的天然多孔結構，其孔徑和孔隙率無顯著差異。煅燒骨支架親水性更好，DBM 支架由于主要成分為膠原，而膠原蛋白主要為疏水性分子，所以其親水性較差。細胞體外實驗結果顯示，煅燒和脫鈣制備的兩種異種骨支架均未表現出細胞毒性，并且兩種支架都能促進成骨細胞增殖，DBM 促增殖效果優于煅燒骨，這可能與 DBM 所含內源性 BMP-2 釋放有關。對兩種材料免疫原性評價結果顯示，DBM 和煅燒骨經過軟組織去除、清洗、超臨界 CO2 萃取等工序處理，其主要抗原細胞已被大量去除，DNA 殘留水平遠低于文獻報道的評價組織材料脫細胞程度的標準：50 ng/mg 干重[24]。同時，人外周血淋巴細胞實驗表明，兩種支架均不會刺激外周血淋巴細胞增殖和分化。大鼠顱骨缺損修復實驗結果顯示，兩種支架材料的成骨方式略有差異。煅燒骨支架降解性較差，術后 8 周仍可見大量材料殘留；其主要依靠骨傳導作用成骨，組織學結果顯示新生骨圍繞支架爬行。DBM 支架降解性較好，術后 8 周僅有少量材料殘留，組織學觀察可見新生骨呈點狀、片狀分布，成骨作用明顯。兩種材料在 Micro-CT 下顯影程度不同，DBM 弱顯影，而煅燒骨顯影較亮。術后 4 周時，煅燒骨 BV/TV 大于脫鈣骨，但是從組織學結果看并無顯著差異，這可能與煅燒骨支架緩慢降解釋放 Ca2+，形成密度類似于新骨的高 Ca2+ 區域有關。
綜上述，不同類型的異種骨支架其理化性能、降解性和體內成骨作用可能存在差異。DBM 親水性差，降解性較好，內源性 BMP-2 因脫鈣處理得以充分暴露，具有很好的成骨活性；鍛燒骨親水性較好，降解性較差，因高溫煅燒而失活，但天然多孔結構仍為成骨提供了良好條件。兩種支架均無免疫原性且能夠促進大鼠顱骨缺損修復，具有一定應用前景。
作者貢獻：李矛直接參與材料制備、動物實驗操作與結果評價，數據收集整理以及文章撰寫；白玉龍參與材料制備與表征、動物實驗、文章復核；李淼參與細胞實驗和數據分析；周建偉提供實驗設計思路并把控實驗正確實施、文章審核修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會（TRECKY2021-060）及上海睿太莫斯生物科技有限公司動物福利倫理委員會批準（RM200214）。實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0004。
