引用本文： 張鷹, 賈帥軍, 田方, 高新林, 王致遠, 朱雷, 郝定均. 磷酸鈣骨水泥復合透明質酸-姜黃素對成骨細胞增殖及成骨能力影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(1): 104-110. doi: 10.7507/1002-1892.202007088 復制
隨著我國人口老齡化逐漸加重，骨質疏松性椎體壓縮骨折（osteoporotic vertebral compression fracture，OVCF）已成為威脅老年人健康的主要疾病之一[1]。椎體成形術是治療 OVCF 的主要手段，通過向椎體內注入骨水泥迅速穩定損傷椎體，恢復椎體強度和高度[2-3]。磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是 OVCF 中常用骨水泥類型，具有良好生物相容性、骨傳導性、反應產熱低以及可生物降解等優點[4]，但也存在力學強度較低、降解周期長及骨誘導性差等不足，限制了其在臨床中的廣泛應用[5]。針對上述不足對 CPC 進行改性成為研究熱點。CPC 載藥具有局部藥物濃度高、全身毒副作用小、緩慢釋放及持續時間長等[6-7]優點，因此目前通常采用 CPC 負載活性藥物來增強其生物活性及骨誘導性。
姜黃素（curcumin，CUR）是從姜科植物姜黃、郁金、莪術等植物干燥根莖中提取的黃色酸性酚類物質，是姜黃發揮藥理作用的主要活性成分[8]。CUR 具有抗炎[9]、抗病毒、抗感染和促成骨分化[10-11]等藥理活性。為此，本研究擬在 CPC 中引入 CUR 以提高骨誘導能力，進而促進骨缺損愈合。但 CUR 水溶性差，直接應用于 CPC 中不利于其在生物體內吸收和利用。
透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種可生物降解、生物相容性好的大分子鏈狀黏多糖，具有高度親水性，存在可用于化學修飾的 4 個部位[12]，其中對羧基鍵的修飾最為常見。為提高 CUR 的生物利用度，本研究擬對 CUR 基團的羥基鍵與 HA 的羧基鍵成酯化共價結合制備 HA/CUR，改善 CUR 的水溶性，并將其與 CPC 復合后經體外實驗檢測對成骨細胞增殖及成骨能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
CUR（純度≥95%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽、透析袋（截留分子量為 3 500）、茜素紅染液、ALP 染液、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、DAPI 溶液（北京索萊寶科技有限公司）；HA（相對分子質量 4.5×103；山東焦點生物科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（上海麥克林生化科技有限公司）；自固化 CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
雷磁 pH 儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀、超凈工作臺、酶標儀、低速離心機（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；掃描電鏡（Phenom 公司，荷蘭）；萬能力學機（Instron 公司，美國）；維卡儀（無錫中科建材儀器有限公司）。
1.2 HA/CUR 的制備及觀測
1.2.1 制備方法
稱取 HA 413 mg（1.08 mmol）置于 100 mL 圓底燒瓶中，加入 10 mL 去離子水使其溶解，再加入 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽 207 mg（1.08 mmol）活化 30 min。稱取 CUR 51.6 mg（0.54 mmol），加入 2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺使其溶解。然后，將溶解的 CUR 加入制備的 HA 溶液中，加入 60 mg 4-二甲氨基吡啶反應 6 h 后用透析袋透析 24 h，每 2 小時更換 1 次透析水。透析結束后，將反應液轉移至玻璃培養皿中，置于?40℃ 冰箱預凍過夜，第 2 天取出后冷凍干燥 24 h，最終獲得呈淡黃色固體的 HA/CUR。
1.2.2 觀測指標
大體觀察 HA/CUR 水溶性，并采用 KBr 壓片法用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行表征檢測，以 HA 作為對照。
1.3 復合骨水泥的制備及觀測
1.3.1 制備方法
將自固化 CPC 充分混勻攪拌后，按 5%（W/W）分別添加 CUR、HA、HA/CUR，將糊狀樣品倒入直徑 3 mm、高 5 mm 的聚四氟乙烯圓柱形模具中，固化 4 h 后從模具中取出，分別獲得 CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC。
1.3.2 觀測指標
① 凝結時間測試：采用維卡儀測量 CPC、CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC （n=6）初凝時間以及終凝時間。將盛有骨水泥漿體的圓柱形模具置于試針下，使試針與凈漿面接觸，擰緊螺絲。然后放松螺絲，使試針自由沉入凈漿，觀察指針讀數。測試初凝時間時，試針長度 50 mm、直徑 1.15 mm，每隔 5 min 測試 1 次；測試終凝時間時，試針長度 30 mm、直徑 1.15 mm，每隔 15 min 測試 1 次。每次測試時，注意避免試針落入前次測量的針孔。
② 壓縮強度測試：取單純 CPC 及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本（n=3），采用萬能力學機測量其壓縮強度，載荷速度為 1 mm/min。
③ 可注射性能測試：取 5 mL 注射器稱重并記為 m0；將攪拌均勻的單純 CPC 及 3 種復合骨水泥漿體裝入注射器，稱重并記為 m1；推動注射器推桿擠出漿體至不能擠出為止，稱量剩余漿體和注射器質量并記為 m2。按以下公式計算可注射率，公式：（m1?m2）/（m1?m0）×100%。重復測量 3 次。
④ 掃描電鏡觀察：取單純 CPC 及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本，置于掃描電鏡樣品臺上并連接導電膠、噴金處理，觀察骨水泥微觀形貌特性。
1.4 骨水泥復合成骨細胞培養及觀測
1.4.1 成骨細胞分離及培養
取出生后 1～2 d 的 SD 大鼠（西安交通大學動物實驗中心提供），斷頸處死后置于 75% 乙醇浸泡 5 min，取顱骨以 PBS 緩沖液沖洗后，0.25% 胰蛋白酶消化，采用低速離心機以離心半徑 40 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后轉移至培養瓶，加入成骨培養基（含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素、10 mmol/L 甘油磷酸鈉、0.1 μmol/L 地塞米松、50 mg/L 維生素 C 的 H-DMEM 培養基），置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，培養 3 d 后換液，待細胞融合度達 80% 時進行傳代培養。取第 2 代細胞進行后續實驗。
1.4.2 骨水泥生物相容性檢測
取單純 CPC 以及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本，置于 75% 乙醇浸泡 6 h 消毒后，成骨培養基沖洗浸泡過夜。將密度為 1×104個/mL 的細胞懸液 0.5 mL 滴加至各骨水泥樣本，然后置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養 48 h；取出 PBS 清洗 2～3 次，4% 戊二醛固定，掃描電鏡觀察細胞在骨水泥上黏附情況及形態。
1.4.3 活/死細胞熒光染色觀察
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養 3 d 后，采用 Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒行活/死細胞熒光染色，于倒置熒光顯微鏡 490 nm 波長下觀察，其中活細胞為綠色熒光、死細胞為紅色熒光，對活/死細胞進行計數，按以下公式計算細胞存活率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
1.4.4 成骨細胞增殖檢測
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養，于 24、48、72 h 后各取 3 孔采用 0.25% 胰蛋白酶消化后，吹打制成細胞懸液，采用細胞計數板進行細胞計數。
1.4.5 成骨能力檢測
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養，培養 48 h 行 OPN 免疫熒光染色，7 d 行 ALP 染色，21 d 行茜素紅染色，觀察成骨情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HA/CUR 表征檢測
CUR 難溶于水，沉淀明顯；HA/CUR 溶于水，水溶液呈黃色。傅里葉變換紅外光譜儀檢測示，與 HA 相比，HA/CUR 紅外圖譜中 3 419.97 cm?1 處的峰變強，屬于 CUR 結構中-OH 基團；2937.59 cm?1處的峰變強，屬于 CUR 帶有的雙 C=O 官能團；在 1 651.07、1 508.33、1 226.73 cm?1 3 處出現了新峰，其中 1508.33 cm?1 的峰屬于 CUR 中苯環內 C=C 的振動。結合 1 226.73、1 651.07 cm?1 處的峰可以判斷酯鍵形成，表明 HA 已成功共價結合到 CUR 的分子骨架中。見圖 1。
圖1
HA/CUR 觀測
a. 紅外光譜圖；b. CUR 顆粒與水混合物；c. HA/CUR 水溶液；d. HA/CUR-CPC
Figure1. HA/CUR observationa. Infrared spectrum; b. The mixture of CUR particles and water; c. HA/CUR solution; d. HA/CUR-CPC
2.2 復合骨水泥觀測
2.2.1 凝結時間測試
HA/CUR-CPC 組初凝時間及終凝時間與 CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組凝結時間
Figure2.
The setting time of each group
2.2.2 壓縮強度測試
CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組以及 HA/CUR-CPC 組壓縮強度分別為（17.00±0.95）、（15.20±1.91）、（15.70±2.00）、（20.10±1.04）MPa，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 可注射性能測試
CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組以及 HA/CUR-CPC 組可注射率分別為 89.20%±0.20%、76.20%±0.90%、82.70%±0.30%、85.30%±0.30%，HA/CUR-CPC 組可注射率與其他3 組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.4 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察見 HA/CUR-CPC 組材料較光滑，HA/CUR 散在分布于 CPC 表面，CPC 顆粒分布均勻，顆粒間結合較 CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組更緊密。見圖 3。
圖3
各組骨水泥掃描電鏡觀察（×1 000）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure3. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group (×1 000)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3 骨水泥復合成骨細胞培養觀測
2.3.1 骨水泥生物相容性檢測
成骨細胞與各組骨水泥復合培養 48 h 后，掃描電鏡觀察見成骨細胞黏附于各組骨水泥上，形態伸展良好，具有成骨細胞生長特征，其中 HA/CUR-CPC 組還有較多的細胞外基質產生。見圖 4。
圖4
各組骨水泥與成骨細胞共培養后掃描電鏡觀察（×800）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure4. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group after co-cultured with osteoblasts (×800)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.2 活/死細胞熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡觀察見各組骨水泥上有較多綠色熒光細胞。CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組、HA/CUR-CPC 組細胞存活率分別為 98.33%±0.20%、98.65%±0.22%、98.66%±0.16%、99.08%±0.13%，組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞存活情況（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure5. Inverted fluorescence microscope observation of cells survival in each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.3 成骨細胞增殖觀測
細胞計數檢測顯示，各時間點 HA/CUR-CPC 組細胞較其他 3 組明顯增多，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
各時間點各組細胞計數
Figure6.
Cell counting of each group at each time point
2.3.4 成骨能力檢測
各組骨水泥與成骨細胞培養 48 h 后，OPN 免疫熒光染色顯示 HA/CUR-CPC 組細胞綠色熒光強于其他組，且形態規則。見圖 7。培養 7 d 后，ALP 染色顯示各組細胞胞質中均可見淡藍色小顆粒，提示細胞具有分泌 ALP 能力，符合成骨細胞生物學特征；其中 HA/CUR-CPC 組 ALP 表達強于其他組。見圖 8。培養 21 d 后，茜素紅染色顯示各組均有深紅色顆粒，且 HA/CUR-CPC 組明顯多于其他組。見圖 9。
圖7
各組 OPN 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure7. OPN immunofluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
圖8
各組 ALP 染色觀察（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure8. ALP staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
圖9
各組茜素紅染色觀察（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure9. Alizarin red staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
3 討論
近年來對 CPC 改性成為國內外學者研究熱點，尤其是利用中成藥改性的研究。比如韓愈等[13]采用淫羊藿苷與 CPC 形成蛋白載體來修復骨缺損；董航等[14]研究了載骨碎補總黃酮 CPC 對骨缺損模型大鼠誘導膜成骨分化的影響，結果顯示載骨碎補總黃酮 CPC 通過激活 BMP-2/Smad 通路，調節成骨細胞分化，促進骨缺損模型大鼠誘導膜的成骨作用。
大量臨床研究證實 CUR 具有廣泛的藥理作用，但對成骨細胞的作用研究較少，主要是因為 CUR 水溶性差，如何對 CUR 改性成為了首要問題。目前已有學者對 CUR 進行了改性，如 Landeros 等[15]以第 2 代聚酯枝晶（樹枝化）對 CUR 酚基團進行改性，以達到最佳的親水/疏水平衡，使新的 CUR 衍生物能在室溫下完全水溶，并表現出良好穩定性。本研究引入 HA 對 CUR 進行改性，使 CUR 基團的羥基鍵與 HA 的羧基鍵共酯化結合。傅里葉變換紅外光譜儀檢測顯示 HA 已成功共價結合到 CUR 的分子骨架，而且 HA/CUR 完全溶于水，表現出良好的水溶性。
CUR 改性后，本研究將 HA/CUR 與 CPC 進行復合，制備了 HA/CUR-CPC。可注射性測試及凝結時間測試顯示，HA/CUR-CPC 在上述兩個方面與單純 CPC 相比均無顯著差異，為其臨床用于 OVCF 奠定了基礎。另外，生物力學測試顯示，HA/CUR-CPC 壓縮強度約為 20 MPa，與單純 CPC 相比差異無統計學意義，提示添加 HA/CUR 未影響 CPC 骨水泥的力學性能，可滿足人體椎體的機械應力要求[16]，不影響其臨床應用。
在物理性能檢測基礎上，本研究進一步將 HA/CUR-CPC 與成骨細胞復合培養，觀察其生物相容性以及對成骨細胞成骨能力的影響。復合培養 48 h 后，與其他骨水泥相比，成骨細胞能較好地黏附于 HA/CUR-CPC 材料表面生長，且有較多的細胞外基質生成，提示 CUR 對細胞無毒性作用，對細胞增殖還有促進作用[17]。OPN 蛋白作為早期成骨標志物，能準確地表達早期成骨活性，免疫熒光染色顯示成骨細胞在 HA/CUR-CPC 材料表面能分泌 OPN 蛋白，且明顯優于其余骨水泥。ALP 的表達是成骨細胞在早期體外分化成熟的重要標志，ALP 染色示 HA/CUR-CPC 組 ALP 表達較其他組更顯著。茜素紅染色主要用于鑒定成骨分化能力，HA/CUR-CPC 組深紅色鈣化結節明顯多于其他組。上述檢測結果均表明 CPC 中添加 HA/CUR 可明顯促進成骨細胞的成骨分化活性，且不影響成骨細胞增殖。
綜上述， 與單純 CPC 相比，HA/CUR-CPC 能顯著促進成骨細胞增殖及提高其成骨能力，并且力學強度無明顯下降，符合臨床應用要求。后續我們將對其體內應用及相關分子機制作進一步探索。
作者貢獻：郝定均、賈帥軍、朱雷負責實驗設計；張鷹負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、撰寫文章；田方、高新林、王致遠負責數據收集整理及統計分析；朱雷參與文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經西安交通大學附屬紅會醫院醫學倫理委員會批準（202001010）。實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2018-001。
隨著我國人口老齡化逐漸加重，骨質疏松性椎體壓縮骨折（osteoporotic vertebral compression fracture，OVCF）已成為威脅老年人健康的主要疾病之一[1]。椎體成形術是治療 OVCF 的主要手段，通過向椎體內注入骨水泥迅速穩定損傷椎體，恢復椎體強度和高度[2-3]。磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是 OVCF 中常用骨水泥類型，具有良好生物相容性、骨傳導性、反應產熱低以及可生物降解等優點[4]，但也存在力學強度較低、降解周期長及骨誘導性差等不足，限制了其在臨床中的廣泛應用[5]。針對上述不足對 CPC 進行改性成為研究熱點。CPC 載藥具有局部藥物濃度高、全身毒副作用小、緩慢釋放及持續時間長等[6-7]優點，因此目前通常采用 CPC 負載活性藥物來增強其生物活性及骨誘導性。
姜黃素（curcumin，CUR）是從姜科植物姜黃、郁金、莪術等植物干燥根莖中提取的黃色酸性酚類物質，是姜黃發揮藥理作用的主要活性成分[8]。CUR 具有抗炎[9]、抗病毒、抗感染和促成骨分化[10-11]等藥理活性。為此，本研究擬在 CPC 中引入 CUR 以提高骨誘導能力，進而促進骨缺損愈合。但 CUR 水溶性差，直接應用于 CPC 中不利于其在生物體內吸收和利用。
透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種可生物降解、生物相容性好的大分子鏈狀黏多糖，具有高度親水性，存在可用于化學修飾的 4 個部位[12]，其中對羧基鍵的修飾最為常見。為提高 CUR 的生物利用度，本研究擬對 CUR 基團的羥基鍵與 HA 的羧基鍵成酯化共價結合制備 HA/CUR，改善 CUR 的水溶性，并將其與 CPC 復合后經體外實驗檢測對成骨細胞增殖及成骨能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
CUR（純度≥95%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽、透析袋（截留分子量為 3 500）、茜素紅染液、ALP 染液、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、DAPI 溶液（北京索萊寶科技有限公司）；HA（相對分子質量 4.5×103；山東焦點生物科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（上海麥克林生化科技有限公司）；自固化 CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
雷磁 pH 儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀、超凈工作臺、酶標儀、低速離心機（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；掃描電鏡（Phenom 公司，荷蘭）；萬能力學機（Instron 公司，美國）；維卡儀（無錫中科建材儀器有限公司）。
1.2 HA/CUR 的制備及觀測
1.2.1 制備方法
稱取 HA 413 mg（1.08 mmol）置于 100 mL 圓底燒瓶中，加入 10 mL 去離子水使其溶解，再加入 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽 207 mg（1.08 mmol）活化 30 min。稱取 CUR 51.6 mg（0.54 mmol），加入 2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺使其溶解。然后，將溶解的 CUR 加入制備的 HA 溶液中，加入 60 mg 4-二甲氨基吡啶反應 6 h 后用透析袋透析 24 h，每 2 小時更換 1 次透析水。透析結束后，將反應液轉移至玻璃培養皿中，置于?40℃ 冰箱預凍過夜，第 2 天取出后冷凍干燥 24 h，最終獲得呈淡黃色固體的 HA/CUR。
1.2.2 觀測指標
大體觀察 HA/CUR 水溶性，并采用 KBr 壓片法用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行表征檢測，以 HA 作為對照。
1.3 復合骨水泥的制備及觀測
1.3.1 制備方法
將自固化 CPC 充分混勻攪拌后，按 5%（W/W）分別添加 CUR、HA、HA/CUR，將糊狀樣品倒入直徑 3 mm、高 5 mm 的聚四氟乙烯圓柱形模具中，固化 4 h 后從模具中取出，分別獲得 CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC。
1.3.2 觀測指標
① 凝結時間測試：采用維卡儀測量 CPC、CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC （n=6）初凝時間以及終凝時間。將盛有骨水泥漿體的圓柱形模具置于試針下，使試針與凈漿面接觸，擰緊螺絲。然后放松螺絲，使試針自由沉入凈漿，觀察指針讀數。測試初凝時間時，試針長度 50 mm、直徑 1.15 mm，每隔 5 min 測試 1 次；測試終凝時間時，試針長度 30 mm、直徑 1.15 mm，每隔 15 min 測試 1 次。每次測試時，注意避免試針落入前次測量的針孔。
② 壓縮強度測試：取單純 CPC 及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本（n=3），采用萬能力學機測量其壓縮強度，載荷速度為 1 mm/min。
③ 可注射性能測試：取 5 mL 注射器稱重并記為 m0；將攪拌均勻的單純 CPC 及 3 種復合骨水泥漿體裝入注射器，稱重并記為 m1；推動注射器推桿擠出漿體至不能擠出為止，稱量剩余漿體和注射器質量并記為 m2。按以下公式計算可注射率，公式：（m1?m2）/（m1?m0）×100%。重復測量 3 次。
④ 掃描電鏡觀察：取單純 CPC 及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本，置于掃描電鏡樣品臺上并連接導電膠、噴金處理，觀察骨水泥微觀形貌特性。
1.4 骨水泥復合成骨細胞培養及觀測
1.4.1 成骨細胞分離及培養
取出生后 1～2 d 的 SD 大鼠（西安交通大學動物實驗中心提供），斷頸處死后置于 75% 乙醇浸泡 5 min，取顱骨以 PBS 緩沖液沖洗后，0.25% 胰蛋白酶消化，采用低速離心機以離心半徑 40 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后轉移至培養瓶，加入成骨培養基（含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素、10 mmol/L 甘油磷酸鈉、0.1 μmol/L 地塞米松、50 mg/L 維生素 C 的 H-DMEM 培養基），置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，培養 3 d 后換液，待細胞融合度達 80% 時進行傳代培養。取第 2 代細胞進行后續實驗。
1.4.2 骨水泥生物相容性檢測
取單純 CPC 以及 3 種復合骨水泥圓柱形樣本，置于 75% 乙醇浸泡 6 h 消毒后，成骨培養基沖洗浸泡過夜。將密度為 1×104個/mL 的細胞懸液 0.5 mL 滴加至各骨水泥樣本，然后置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養 48 h；取出 PBS 清洗 2～3 次，4% 戊二醛固定，掃描電鏡觀察細胞在骨水泥上黏附情況及形態。
1.4.3 活/死細胞熒光染色觀察
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養 3 d 后，采用 Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒行活/死細胞熒光染色，于倒置熒光顯微鏡 490 nm 波長下觀察，其中活細胞為綠色熒光、死細胞為紅色熒光，對活/死細胞進行計數，按以下公式計算細胞存活率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
1.4.4 成骨細胞增殖檢測
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養，于 24、48、72 h 后各取 3 孔采用 0.25% 胰蛋白酶消化后，吹打制成細胞懸液，采用細胞計數板進行細胞計數。
1.4.5 成骨能力檢測
同 1.4.2 方法將成骨細胞與 4 種骨水泥復合培養，培養 48 h 行 OPN 免疫熒光染色，7 d 行 ALP 染色，21 d 行茜素紅染色，觀察成骨情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HA/CUR 表征檢測
CUR 難溶于水，沉淀明顯；HA/CUR 溶于水，水溶液呈黃色。傅里葉變換紅外光譜儀檢測示，與 HA 相比，HA/CUR 紅外圖譜中 3 419.97 cm?1 處的峰變強，屬于 CUR 結構中-OH 基團；2937.59 cm?1處的峰變強，屬于 CUR 帶有的雙 C=O 官能團；在 1 651.07、1 508.33、1 226.73 cm?1 3 處出現了新峰，其中 1508.33 cm?1 的峰屬于 CUR 中苯環內 C=C 的振動。結合 1 226.73、1 651.07 cm?1 處的峰可以判斷酯鍵形成，表明 HA 已成功共價結合到 CUR 的分子骨架中。見圖 1。
圖1
HA/CUR 觀測
a. 紅外光譜圖；b. CUR 顆粒與水混合物；c. HA/CUR 水溶液；d. HA/CUR-CPC
Figure1. HA/CUR observationa. Infrared spectrum; b. The mixture of CUR particles and water; c. HA/CUR solution; d. HA/CUR-CPC
2.2 復合骨水泥觀測
2.2.1 凝結時間測試
HA/CUR-CPC 組初凝時間及終凝時間與 CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組凝結時間
Figure2.
The setting time of each group
2.2.2 壓縮強度測試
CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組以及 HA/CUR-CPC 組壓縮強度分別為（17.00±0.95）、（15.20±1.91）、（15.70±2.00）、（20.10±1.04）MPa，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 可注射性能測試
CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組以及 HA/CUR-CPC 組可注射率分別為 89.20%±0.20%、76.20%±0.90%、82.70%±0.30%、85.30%±0.30%，HA/CUR-CPC 組可注射率與其他3 組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.4 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察見 HA/CUR-CPC 組材料較光滑，HA/CUR 散在分布于 CPC 表面，CPC 顆粒分布均勻，顆粒間結合較 CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組更緊密。見圖 3。
圖3
各組骨水泥掃描電鏡觀察（×1 000）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure3. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group (×1 000)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3 骨水泥復合成骨細胞培養觀測
2.3.1 骨水泥生物相容性檢測
成骨細胞與各組骨水泥復合培養 48 h 后，掃描電鏡觀察見成骨細胞黏附于各組骨水泥上，形態伸展良好，具有成骨細胞生長特征，其中 HA/CUR-CPC 組還有較多的細胞外基質產生。見圖 4。
圖4
各組骨水泥與成骨細胞共培養后掃描電鏡觀察（×800）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure4. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group after co-cultured with osteoblasts (×800)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.2 活/死細胞熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡觀察見各組骨水泥上有較多綠色熒光細胞。CPC 組、CUR-CPC 組、HA-CPC 組、HA/CUR-CPC 組細胞存活率分別為 98.33%±0.20%、98.65%±0.22%、98.66%±0.16%、99.08%±0.13%，組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞存活情況（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure5. Inverted fluorescence microscope observation of cells survival in each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.3 成骨細胞增殖觀測
細胞計數檢測顯示，各時間點 HA/CUR-CPC 組細胞較其他 3 組明顯增多，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
各時間點各組細胞計數
Figure6.
Cell counting of each group at each time point
2.3.4 成骨能力檢測
各組骨水泥與成骨細胞培養 48 h 后，OPN 免疫熒光染色顯示 HA/CUR-CPC 組細胞綠色熒光強于其他組，且形態規則。見圖 7。培養 7 d 后，ALP 染色顯示各組細胞胞質中均可見淡藍色小顆粒，提示細胞具有分泌 ALP 能力，符合成骨細胞生物學特征；其中 HA/CUR-CPC 組 ALP 表達強于其他組。見圖 8。培養 21 d 后，茜素紅染色顯示各組均有深紅色顆粒，且 HA/CUR-CPC 組明顯多于其他組。見圖 9。
圖7
各組 OPN 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure7. OPN immunofluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
圖8
各組 ALP 染色觀察（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure8. ALP staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
圖9
各組茜素紅染色觀察（×40）
a. CPC 組；b. CUR-CPC 組；c. HA-CPC 組；d. HA/CUR-CPC 組
Figure9. Alizarin red staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
3 討論
近年來對 CPC 改性成為國內外學者研究熱點，尤其是利用中成藥改性的研究。比如韓愈等[13]采用淫羊藿苷與 CPC 形成蛋白載體來修復骨缺損；董航等[14]研究了載骨碎補總黃酮 CPC 對骨缺損模型大鼠誘導膜成骨分化的影響，結果顯示載骨碎補總黃酮 CPC 通過激活 BMP-2/Smad 通路，調節成骨細胞分化，促進骨缺損模型大鼠誘導膜的成骨作用。
大量臨床研究證實 CUR 具有廣泛的藥理作用，但對成骨細胞的作用研究較少，主要是因為 CUR 水溶性差，如何對 CUR 改性成為了首要問題。目前已有學者對 CUR 進行了改性，如 Landeros 等[15]以第 2 代聚酯枝晶（樹枝化）對 CUR 酚基團進行改性，以達到最佳的親水/疏水平衡，使新的 CUR 衍生物能在室溫下完全水溶，并表現出良好穩定性。本研究引入 HA 對 CUR 進行改性，使 CUR 基團的羥基鍵與 HA 的羧基鍵共酯化結合。傅里葉變換紅外光譜儀檢測顯示 HA 已成功共價結合到 CUR 的分子骨架，而且 HA/CUR 完全溶于水，表現出良好的水溶性。
CUR 改性后，本研究將 HA/CUR 與 CPC 進行復合，制備了 HA/CUR-CPC。可注射性測試及凝結時間測試顯示，HA/CUR-CPC 在上述兩個方面與單純 CPC 相比均無顯著差異，為其臨床用于 OVCF 奠定了基礎。另外，生物力學測試顯示，HA/CUR-CPC 壓縮強度約為 20 MPa，與單純 CPC 相比差異無統計學意義，提示添加 HA/CUR 未影響 CPC 骨水泥的力學性能，可滿足人體椎體的機械應力要求[16]，不影響其臨床應用。
在物理性能檢測基礎上，本研究進一步將 HA/CUR-CPC 與成骨細胞復合培養，觀察其生物相容性以及對成骨細胞成骨能力的影響。復合培養 48 h 后，與其他骨水泥相比，成骨細胞能較好地黏附于 HA/CUR-CPC 材料表面生長，且有較多的細胞外基質生成，提示 CUR 對細胞無毒性作用，對細胞增殖還有促進作用[17]。OPN 蛋白作為早期成骨標志物，能準確地表達早期成骨活性，免疫熒光染色顯示成骨細胞在 HA/CUR-CPC 材料表面能分泌 OPN 蛋白，且明顯優于其余骨水泥。ALP 的表達是成骨細胞在早期體外分化成熟的重要標志，ALP 染色示 HA/CUR-CPC 組 ALP 表達較其他組更顯著。茜素紅染色主要用于鑒定成骨分化能力，HA/CUR-CPC 組深紅色鈣化結節明顯多于其他組。上述檢測結果均表明 CPC 中添加 HA/CUR 可明顯促進成骨細胞的成骨分化活性，且不影響成骨細胞增殖。
綜上述， 與單純 CPC 相比，HA/CUR-CPC 能顯著促進成骨細胞增殖及提高其成骨能力，并且力學強度無明顯下降，符合臨床應用要求。后續我們將對其體內應用及相關分子機制作進一步探索。
作者貢獻：郝定均、賈帥軍、朱雷負責實驗設計；張鷹負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、撰寫文章；田方、高新林、王致遠負責數據收集整理及統計分析；朱雷參與文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經西安交通大學附屬紅會醫院醫學倫理委員會批準（202001010）。實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2018-001。
