引用本文： 姚旺祥, 戴晗豪, 董佩龍, 桂鑒超. TRPV4 在骨關節炎與正常軟骨中的表達差異及意義. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(1): 63-68. doi: 10.7507/1002-1892.201903056 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨退變為主的疾病，據統計全世界約有 1/4 人口患有此病，是造成人類殘疾的第 4 大病因[1]。然而，目前人們對 OA 的病理機制尚缺乏足夠認識，因此缺少有效阻斷疾病發展的方法。關節軟骨退變導致軟骨細胞外基質降解是 OA 常見的起始因素，軟骨細胞外基質降解可造成局部低滲透壓微環境，引起關節腫脹，激活一系列炎性因子，進而破壞軟骨組織[2]。瞬時受體電位香草素受體 4 型通道蛋白（transient receptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4）是瞬時受體電位通道家族的一種亞型，為細胞膜上一類非電壓依賴的鈣離子通道蛋白。低滲透壓、機械應力及熱能均可激活 TRPV4，進而通過鈣離子內流來啟動一系列生物學反應[3]。目前認為 TRPV4 是軟骨細胞膜上調節滲透壓的主要離子通道，不僅參與低滲透壓引起的炎性反應，其在軟骨細胞中過度表達可以引起鈣離子內流，進而導致軟骨的破壞[4]。本研究通過比較下肢膝關節 OA 患者與無 OA 表現的患者軟骨內 TRPV4 表達差異，以及不同程度 OA 患者軟骨組織中 TRPV4 表達差異，為進一步研究 TRPV4 在 OA 防治中的作用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 研究樣本
OA 軟骨組織來自 2016 年 9 月—2018 年 12 月于南京醫科大學附屬南京醫院行人工膝關節置換的 15 例 OA 患者（OA 組）。其中，男 6 例，女 9 例；年齡 55～78 歲，平均 69 歲。患者均符合美國風濕病協會 1995 年修訂的 OA 診斷標準[5]，未合并糖尿病、關節感染及全身系統性疾病。由 2 名受過培訓的高年資骨科醫生，根據患者站立位 X 線片，分別對 OA 行 Kellgren-Lawrence（K-L）評分，若結果不一致時由第 3 位醫師進行評估。患者 K-L 評分為（3.0±0.8）分。
正常軟骨組織來自同時間段行人工髖關節置換的 15 例股骨頸骨折患者（對照組）。其中，男 5 例，女 10 例；年齡 57～91 歲，平均 71 歲。經術前詢問病史、患髖 CT 檢查及術中觀察股骨頭軟骨退變情況排除 OA，未合并糖尿病、關節感染及全身系統性疾病。兩組患者性別、年齡比較差異無統計學意義（χ2=0.144，P=0.705；t=0.744，P=0.460）。
1.2 主要試劑及儀器
TRPV4 兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物材料有限公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔/羊抗鼠二抗、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體、兔抗人 TRPV4-IgG 單克隆抗體、酶標羊抗兔 IgG 聚合物（杭州華安生物科技有限公司）；Prime Script RT Master Mix（Takara 公司，日本）。PCR 儀（Biometra 公司，美國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Western blot 檢測
兩組各取 5 例軟骨組織標本，生理鹽水漂洗干凈后組織剪剪碎，液氮中充分研磨成粉末狀。加入適量冰預冷的細胞蛋白裂解液混勻，冰上充分裂解 30 min 后，以 13 000×g 離心 30 min，所得上清即為抽提的蛋白，按 BCA 法測定蛋白濃度。按照產品說明書配制 10%SDS-PAGE 凝膠，以每孔蛋白總上樣量 30 μg 加入 SDS-PAGE 凝膠泳道進行電泳、轉膜，常溫下封閉后用 TBST 洗滌聚偏二氟乙烯膜 3 次；加入 TRPV4 兔抗人多克隆抗體（1∶1 000）、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體（1∶5 000），4℃ 孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫下孵育。按 ECL 說明書配制 ECL 發光液，將膜蛋白面與發光液充分接觸，放入曝光儀器中，設定不同曝光時間，自動采集、拍照，根據相應圖片采用 Image J 軟件計算 TRPV4 蛋白相對表達量。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測
參照 Primer Bank 及 NCBI 數據庫，設計并合成 TRPV4 基因上下游引物，β-actin 為內參基因。引物序列：TRPV4 上游 5'-GATGGGCGACCAAATCTGC-3'，下游 5'-GAGGACTCATATAGGGTGGACTC-3'；β-actin 上游 5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下游 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。
兩組各取 5 例軟骨組織樣本，液氮中研磨成粉末狀后，用總 RNA 提取試劑盒提取樣本 RNA，核酸定量儀測定濃度。參照 Prime Script RT Master Mix 產品說明書，以 1 μg RNA 配制逆轉錄反應體系；PCR 儀上設定反應程序：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、30 min，完成后所得逆轉錄產物即為 cDNA。參照產品說明書配制實時定量 PCR 反應體系，按照說明書設置反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，共 40 個循環。以 β-actin 為內參，計算 TRPV4 mRNA 相對表達量。每組實驗重復 3 次。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色
兩組各取 5 例軟骨組織（連帶部分軟骨下骨），置于 4% 甲醛固定后 20%EDTA 脫鈣，隔日換液直至可切片，片厚 5 μm。采用 Masson 染色觀察組織退變程度。免疫組織化學染色觀察 TRPV4 表達，選用兔抗人 TRPV4-IgG 單克隆抗體為一抗、酶標羊抗兔 IgG 聚合物為二抗，阿利新藍復染，鏡下觀察 TRPV4 陽性染色為棕黃色，軟骨基質染為藍色。每個標本選取 5 個切片，每張切片中隨機選擇 10 個高倍視野，計數陽性細胞，按照以下公式計算陽性細胞率：染色陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.4 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，OA 組及對照組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；采用 Spearman 秩相關分析 OA 組軟骨 TRPV4 陽性細胞率與 OA 嚴重程度（K-L 評分）的相關性。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot 及實時定量熒光 PCR 檢測
Western blot 檢測 OA 組 TRPV4 蛋白相對表達量為 0.454±0.199，較對照組 0.165±0.074 明顯升高，差異有統計學意義（t=2.718，P=0.026）。見圖1。
圖1
Western blot 檢測兩組軟骨組織中 TRPV4 蛋白表達a. 對照組；b. OA 組
Figure1.
Protein expression of TRPV4 in cartilage tissue of two groups detected by Western blot analysis
a. Control group; b. OA group
實時熒光定量 PCR 檢測 OA 組 TRPV4 mRNA 相對表達量為 2.951±1.200，較對照組 1.437±0.682 明顯升高，但差異無統計學意義（t=2.415，P=0.073）。
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
OA 組軟骨細胞排列紊亂，細胞外基質失去正常結構，局部軟骨缺損可達深層，退變組織中可見較多 TRPV4 陽性細胞，陽性細胞率為 37.353%±13.496%。其中軟骨退變嚴重者，其軟骨表面破損、毛糙，細胞外基質退變嚴重，全層軟骨組織內可見 TRPV4 染色較深，多分布在細胞膜及細胞質內（圖2）；而軟骨退變較輕者細胞外基質退變程度相對較輕，靠近關節面的退變組織中 TRPV4 染色較多（圖3）。對照組軟骨細胞層次分明，可見少量 TRPV4 陽性細胞，陽性細胞率為 9.642%±3.284%（圖4）。兩組陽性細胞率比較差異有統計學意義（t=7.491，P=0.000）。
圖2
OA 組退變嚴重的軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure2. Histology observation of severe degenerated cartilage in OA groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
圖3
OA 組退變較輕的軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure3. Histology observation of mild degenerated cartilage in OA groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
圖4
對照組軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure4. Histology observation of cartilage in control groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
2.3 TRPV4 陽性細胞率與 OA 嚴重程度相關性分析
OA 組 TRPV4 陽性細胞率與 OA 的 K-L 評分成正相關（r=0.775，P=0.001）。
3 討論
關節軟骨由軟骨外基質及散在其中的軟骨細胞組成，軟骨外基質是由水（60%～85%）、Ⅱ型膠原（15%～22%）、蛋白多糖（4%～7%），以及其他一些重要膠原構成的復雜網格樣結構，對關節軟骨起到壓力支撐及應力分散作用[6]。在步態的不同時相，關節中的水分及營養物質在關節液與軟骨組織中保持動態平衡，行走著地時增加的壓力能將水分擠出到關節腔內，而抬起時降低的壓力能重新將水分吸收入軟骨中[7]。研究表明，關節液的滲透壓對調節關節功能起到重要作用，而 OA 患者關節液的滲透壓明顯低于健康志愿者[8]，軟骨外基質降解后產生的低滲環境，可以激活 TRPV4 的表達，增加 IL-1β 等炎性因子的表達，進一步降解軟骨外基質，形成正循環，從而促進 OA 的進展[9]。本研究采用 Western blot、實時熒光定量 PCR 檢測方法，分別從蛋白及 mRNA 水平比較 OA 與正常軟骨中 TRPV4 表達差異。結果顯示 OA 組中 TRPV4 蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；而 mRNA 相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。我們分析可能與實驗樣本較少、樣本組內差異較大有一定關系。此外，基因表達后通過轉錄、翻譯等一系列過程才能造成蛋白水平的改變，但該過程受到許多因素的調控，所以兩組存在 mRNA 水平無明顯差異、而在蛋白水平有差異的可能性。一般來說，機體主要是通過蛋白水平來調控生物功能，所以 TRPV-4 在蛋白水平的差異更能說明該蛋白的高表達與 OA 發生、發展有關。
離子通道在軟骨細胞的機械應力傳導、體積調節、凋亡及軟骨分化方面起到重要作用[10]。Walter 等[11]發現在退變的椎間盤組織中 TRPV4 表達增多，且多分布在蛋白多糖的降解區域，提示其與椎間盤的退變相關。本研究免疫組織化學染色觀察也發現 TRPV4 陽性細胞多分布于靠近關節面的區域，細胞外基質退變越嚴重，其陽性細胞染色率就越高。有研究表明健康的關節軟骨依靠細胞外基質的合成與降解代謝而保持其穩態，而在 OA 病理狀態下，細胞外基質的變化不僅反映疾病的狀態，也體現了軟骨細胞活性與功能[12]。OA 早期即可見膠原與蛋白多糖分布改變，軟骨細胞腫脹與細胞簇形成，引起軟骨彈性模量降低、機械應力傳導能力下降，進而激活包括 TRPV4 在內的一系列生物活性物質而加重 OA[13]。在干細胞的三維培養分化過程中，細胞體積的改變同樣可以激活 TRPV4，通過激活 RUNX-2 基因來促進其向成骨細胞分化[14]。本研究同樣觀察到 TRPV4 染色陽性細胞與陰性細胞相比體積稍大，且多分布于降解基質周圍，直接證明了局部的低滲透壓環境引起細胞腫脹，后續骨贅形成可能與之有關。
低滲透壓激活 TRPV4 后，可引起細胞內鈣離子濃度升高，從而引起一系列與轉錄、遷移及增殖有關的生理效應，導致培養的軟骨細胞去分化；降低鈣離子濃度則可增加膠原與蛋白多糖的合成，減少軟骨細胞的肥大[15]。研究表明，特異性敲除軟骨細胞的 TRPV4，可減輕成年大鼠衰老所致的 OA 嚴重程度，但不能阻止創傷后關節炎，這可能與創傷后關節炎的發病機制與衰老所致的 OA 機制不同有關[16]。低滲透壓通過 ERK1/2 的磷酸化激活來快速活化 TRPV4，使用 PD98085（一種 ERK 通路的特異性抑制劑）阻斷 ERK1/2 后，可阻斷低滲透壓引起的 TRPV4 高表達[17]。
OA 的 K-L 評分簡單實用，在臨床上為廣大醫師所采用，主要通過關節間隙狹窄程度、骨贅增生等評定 OA 程度[18]。本研究相關分析結果顯示 OA 越嚴重，TRPV4 陽性細胞率也越高，說明 TRPV4 與 OA 的發展有一定相關性。OA 早期表現不典型，多為非特異性關節疼痛及腫脹，因此容易被患者忽略，從而失去早期干預機會，若能夠通過檢測某種蛋白質的改變來協助診斷，則可以通過早期干預來阻止 OA 進展[19]。TRPV4 在 OA 早期階段，即細胞外基質降解階段即被激活，可能有較好的預測價值[20]。綜上述，TRPV4 有可能用于 OA 的早期診斷。但本研究不足之處在于僅觀察了 TRPV4 在不同類型患者軟骨組織內的差異表達，而未檢測兩組患者血液或關節液中的濃度是否有差異，這將是下一步研究方向。
作者貢獻：姚旺祥負責實驗設計與實施，論文撰寫；戴晗豪負責臨床樣本收集，統計分析；董佩龍負責臨床樣本收集，數據整理；桂鑒超負責實驗設計、論文修改及審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨退變為主的疾病，據統計全世界約有 1/4 人口患有此病，是造成人類殘疾的第 4 大病因[1]。然而，目前人們對 OA 的病理機制尚缺乏足夠認識，因此缺少有效阻斷疾病發展的方法。關節軟骨退變導致軟骨細胞外基質降解是 OA 常見的起始因素，軟骨細胞外基質降解可造成局部低滲透壓微環境，引起關節腫脹，激活一系列炎性因子，進而破壞軟骨組織[2]。瞬時受體電位香草素受體 4 型通道蛋白（transient receptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4）是瞬時受體電位通道家族的一種亞型，為細胞膜上一類非電壓依賴的鈣離子通道蛋白。低滲透壓、機械應力及熱能均可激活 TRPV4，進而通過鈣離子內流來啟動一系列生物學反應[3]。目前認為 TRPV4 是軟骨細胞膜上調節滲透壓的主要離子通道，不僅參與低滲透壓引起的炎性反應，其在軟骨細胞中過度表達可以引起鈣離子內流，進而導致軟骨的破壞[4]。本研究通過比較下肢膝關節 OA 患者與無 OA 表現的患者軟骨內 TRPV4 表達差異，以及不同程度 OA 患者軟骨組織中 TRPV4 表達差異，為進一步研究 TRPV4 在 OA 防治中的作用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 研究樣本
OA 軟骨組織來自 2016 年 9 月—2018 年 12 月于南京醫科大學附屬南京醫院行人工膝關節置換的 15 例 OA 患者（OA 組）。其中，男 6 例，女 9 例；年齡 55～78 歲，平均 69 歲。患者均符合美國風濕病協會 1995 年修訂的 OA 診斷標準[5]，未合并糖尿病、關節感染及全身系統性疾病。由 2 名受過培訓的高年資骨科醫生，根據患者站立位 X 線片，分別對 OA 行 Kellgren-Lawrence（K-L）評分，若結果不一致時由第 3 位醫師進行評估。患者 K-L 評分為（3.0±0.8）分。
正常軟骨組織來自同時間段行人工髖關節置換的 15 例股骨頸骨折患者（對照組）。其中，男 5 例，女 10 例；年齡 57～91 歲，平均 71 歲。經術前詢問病史、患髖 CT 檢查及術中觀察股骨頭軟骨退變情況排除 OA，未合并糖尿病、關節感染及全身系統性疾病。兩組患者性別、年齡比較差異無統計學意義（χ2=0.144，P=0.705；t=0.744，P=0.460）。
1.2 主要試劑及儀器
TRPV4 兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物材料有限公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔/羊抗鼠二抗、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體、兔抗人 TRPV4-IgG 單克隆抗體、酶標羊抗兔 IgG 聚合物（杭州華安生物科技有限公司）；Prime Script RT Master Mix（Takara 公司，日本）。PCR 儀（Biometra 公司，美國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Western blot 檢測
兩組各取 5 例軟骨組織標本，生理鹽水漂洗干凈后組織剪剪碎，液氮中充分研磨成粉末狀。加入適量冰預冷的細胞蛋白裂解液混勻，冰上充分裂解 30 min 后，以 13 000×g 離心 30 min，所得上清即為抽提的蛋白，按 BCA 法測定蛋白濃度。按照產品說明書配制 10%SDS-PAGE 凝膠，以每孔蛋白總上樣量 30 μg 加入 SDS-PAGE 凝膠泳道進行電泳、轉膜，常溫下封閉后用 TBST 洗滌聚偏二氟乙烯膜 3 次；加入 TRPV4 兔抗人多克隆抗體（1∶1 000）、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體（1∶5 000），4℃ 孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫下孵育。按 ECL 說明書配制 ECL 發光液，將膜蛋白面與發光液充分接觸，放入曝光儀器中，設定不同曝光時間，自動采集、拍照，根據相應圖片采用 Image J 軟件計算 TRPV4 蛋白相對表達量。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測
參照 Primer Bank 及 NCBI 數據庫，設計并合成 TRPV4 基因上下游引物，β-actin 為內參基因。引物序列：TRPV4 上游 5'-GATGGGCGACCAAATCTGC-3'，下游 5'-GAGGACTCATATAGGGTGGACTC-3'；β-actin 上游 5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下游 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。
兩組各取 5 例軟骨組織樣本，液氮中研磨成粉末狀后，用總 RNA 提取試劑盒提取樣本 RNA，核酸定量儀測定濃度。參照 Prime Script RT Master Mix 產品說明書，以 1 μg RNA 配制逆轉錄反應體系；PCR 儀上設定反應程序：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、30 min，完成后所得逆轉錄產物即為 cDNA。參照產品說明書配制實時定量 PCR 反應體系，按照說明書設置反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，共 40 個循環。以 β-actin 為內參，計算 TRPV4 mRNA 相對表達量。每組實驗重復 3 次。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色
兩組各取 5 例軟骨組織（連帶部分軟骨下骨），置于 4% 甲醛固定后 20%EDTA 脫鈣，隔日換液直至可切片，片厚 5 μm。采用 Masson 染色觀察組織退變程度。免疫組織化學染色觀察 TRPV4 表達，選用兔抗人 TRPV4-IgG 單克隆抗體為一抗、酶標羊抗兔 IgG 聚合物為二抗，阿利新藍復染，鏡下觀察 TRPV4 陽性染色為棕黃色，軟骨基質染為藍色。每個標本選取 5 個切片，每張切片中隨機選擇 10 個高倍視野，計數陽性細胞，按照以下公式計算陽性細胞率：染色陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.4 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，OA 組及對照組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；采用 Spearman 秩相關分析 OA 組軟骨 TRPV4 陽性細胞率與 OA 嚴重程度（K-L 評分）的相關性。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot 及實時定量熒光 PCR 檢測
Western blot 檢測 OA 組 TRPV4 蛋白相對表達量為 0.454±0.199，較對照組 0.165±0.074 明顯升高，差異有統計學意義（t=2.718，P=0.026）。見圖1。
圖1
Western blot 檢測兩組軟骨組織中 TRPV4 蛋白表達a. 對照組；b. OA 組
Figure1.
Protein expression of TRPV4 in cartilage tissue of two groups detected by Western blot analysis
a. Control group; b. OA group
實時熒光定量 PCR 檢測 OA 組 TRPV4 mRNA 相對表達量為 2.951±1.200，較對照組 1.437±0.682 明顯升高，但差異無統計學意義（t=2.415，P=0.073）。
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
OA 組軟骨細胞排列紊亂，細胞外基質失去正常結構，局部軟骨缺損可達深層，退變組織中可見較多 TRPV4 陽性細胞，陽性細胞率為 37.353%±13.496%。其中軟骨退變嚴重者，其軟骨表面破損、毛糙，細胞外基質退變嚴重，全層軟骨組織內可見 TRPV4 染色較深，多分布在細胞膜及細胞質內（圖2）；而軟骨退變較輕者細胞外基質退變程度相對較輕，靠近關節面的退變組織中 TRPV4 染色較多（圖3）。對照組軟骨細胞層次分明，可見少量 TRPV4 陽性細胞，陽性細胞率為 9.642%±3.284%（圖4）。兩組陽性細胞率比較差異有統計學意義（t=7.491，P=0.000）。
圖2
OA 組退變嚴重的軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure2. Histology observation of severe degenerated cartilage in OA groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
圖3
OA 組退變較輕的軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure3. Histology observation of mild degenerated cartilage in OA groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
圖4
對照組軟骨組織染色觀察
左側為×2、右側為×10 a. Masson 染色；b. TRPV4 免疫組織化學染色
Figure4. Histology observation of cartilage in control groupLeft for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
2.3 TRPV4 陽性細胞率與 OA 嚴重程度相關性分析
OA 組 TRPV4 陽性細胞率與 OA 的 K-L 評分成正相關（r=0.775，P=0.001）。
3 討論
關節軟骨由軟骨外基質及散在其中的軟骨細胞組成，軟骨外基質是由水（60%～85%）、Ⅱ型膠原（15%～22%）、蛋白多糖（4%～7%），以及其他一些重要膠原構成的復雜網格樣結構，對關節軟骨起到壓力支撐及應力分散作用[6]。在步態的不同時相，關節中的水分及營養物質在關節液與軟骨組織中保持動態平衡，行走著地時增加的壓力能將水分擠出到關節腔內，而抬起時降低的壓力能重新將水分吸收入軟骨中[7]。研究表明，關節液的滲透壓對調節關節功能起到重要作用，而 OA 患者關節液的滲透壓明顯低于健康志愿者[8]，軟骨外基質降解后產生的低滲環境，可以激活 TRPV4 的表達，增加 IL-1β 等炎性因子的表達，進一步降解軟骨外基質，形成正循環，從而促進 OA 的進展[9]。本研究采用 Western blot、實時熒光定量 PCR 檢測方法，分別從蛋白及 mRNA 水平比較 OA 與正常軟骨中 TRPV4 表達差異。結果顯示 OA 組中 TRPV4 蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；而 mRNA 相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。我們分析可能與實驗樣本較少、樣本組內差異較大有一定關系。此外，基因表達后通過轉錄、翻譯等一系列過程才能造成蛋白水平的改變，但該過程受到許多因素的調控，所以兩組存在 mRNA 水平無明顯差異、而在蛋白水平有差異的可能性。一般來說，機體主要是通過蛋白水平來調控生物功能，所以 TRPV-4 在蛋白水平的差異更能說明該蛋白的高表達與 OA 發生、發展有關。
離子通道在軟骨細胞的機械應力傳導、體積調節、凋亡及軟骨分化方面起到重要作用[10]。Walter 等[11]發現在退變的椎間盤組織中 TRPV4 表達增多，且多分布在蛋白多糖的降解區域，提示其與椎間盤的退變相關。本研究免疫組織化學染色觀察也發現 TRPV4 陽性細胞多分布于靠近關節面的區域，細胞外基質退變越嚴重，其陽性細胞染色率就越高。有研究表明健康的關節軟骨依靠細胞外基質的合成與降解代謝而保持其穩態，而在 OA 病理狀態下，細胞外基質的變化不僅反映疾病的狀態，也體現了軟骨細胞活性與功能[12]。OA 早期即可見膠原與蛋白多糖分布改變，軟骨細胞腫脹與細胞簇形成，引起軟骨彈性模量降低、機械應力傳導能力下降，進而激活包括 TRPV4 在內的一系列生物活性物質而加重 OA[13]。在干細胞的三維培養分化過程中，細胞體積的改變同樣可以激活 TRPV4，通過激活 RUNX-2 基因來促進其向成骨細胞分化[14]。本研究同樣觀察到 TRPV4 染色陽性細胞與陰性細胞相比體積稍大，且多分布于降解基質周圍，直接證明了局部的低滲透壓環境引起細胞腫脹，后續骨贅形成可能與之有關。
低滲透壓激活 TRPV4 后，可引起細胞內鈣離子濃度升高，從而引起一系列與轉錄、遷移及增殖有關的生理效應，導致培養的軟骨細胞去分化；降低鈣離子濃度則可增加膠原與蛋白多糖的合成，減少軟骨細胞的肥大[15]。研究表明，特異性敲除軟骨細胞的 TRPV4，可減輕成年大鼠衰老所致的 OA 嚴重程度，但不能阻止創傷后關節炎，這可能與創傷后關節炎的發病機制與衰老所致的 OA 機制不同有關[16]。低滲透壓通過 ERK1/2 的磷酸化激活來快速活化 TRPV4，使用 PD98085（一種 ERK 通路的特異性抑制劑）阻斷 ERK1/2 后，可阻斷低滲透壓引起的 TRPV4 高表達[17]。
OA 的 K-L 評分簡單實用，在臨床上為廣大醫師所采用，主要通過關節間隙狹窄程度、骨贅增生等評定 OA 程度[18]。本研究相關分析結果顯示 OA 越嚴重，TRPV4 陽性細胞率也越高，說明 TRPV4 與 OA 的發展有一定相關性。OA 早期表現不典型，多為非特異性關節疼痛及腫脹，因此容易被患者忽略，從而失去早期干預機會，若能夠通過檢測某種蛋白質的改變來協助診斷，則可以通過早期干預來阻止 OA 進展[19]。TRPV4 在 OA 早期階段，即細胞外基質降解階段即被激活，可能有較好的預測價值[20]。綜上述，TRPV4 有可能用于 OA 的早期診斷。但本研究不足之處在于僅觀察了 TRPV4 在不同類型患者軟骨組織內的差異表達，而未檢測兩組患者血液或關節液中的濃度是否有差異，這將是下一步研究方向。
作者貢獻：姚旺祥負責實驗設計與實施，論文撰寫；戴晗豪負責臨床樣本收集，統計分析；董佩龍負責臨床樣本收集，數據整理；桂鑒超負責實驗設計、論文修改及審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
