引用本文： 李瑛, 吳冰, 丘志河, 梁達強, 柳海峰, 鐘名金, 許鑒, 陳康, 馮文哲, 李皓, 彭亮權, 歐陽侃, 朱偉民, 陸偉, 王大平. 自體腘繩肌腱移植重建前交叉韌帶后移植物膠原纖維直徑與 Mohawk 表達水平的相關性研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(9): 1095-1101. doi: 10.7507/1002-1892.201902040 復制
目前，對于前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷臨床常選擇關節鏡下自體腘繩肌腱移植重建[1-3]。肌腱移植物在膝關節內經歷缺血壞死、血管重建、細胞增殖和組織成熟等生物學改變過程，最終轉變為與正常 ACL 組織學相似的組織，這一過程被定義為 ACL 移植物塑形或韌帶化[4-5]。研究發現，移植物塑形結果會直接決定移植物的生物力學特性，進而影響膝關節穩定性及運動功能[6-7]。
Ⅰ、Ⅲ型膠原是韌帶和肌腱主要組成成分，也是賦予韌帶和肌腱力學特性的重要結構基礎。ACL 具有大直徑（≥90 nm）與小直徑（<90 nm）膠原纖維雙峰混合分布模式，大直徑膠原纖維因膠原分子間高密度的交聯而具有更高的抗張力強度[8-9]。結締組織的最大載荷強度與膠原纖維的總體平均直徑成正相關[10-12]，在 ACL 移植物進入塑形穩定期后（術后 9～36 個月后）移植物的組織學特點，尤其是膠原纖維類型、直徑、分布等超微結構特點，是判定移植物最終轉歸結果的金標準[13]。
Mohawk（MKX）是三氨基酸循環超家族中，非典型的同源異型盒基因編碼的調節肌肉、軟骨、肌腱、骨骼等組織膠原蛋白合成代謝的關鍵轉錄因子[14-15]。我們前期研究發現，在自體肌腱重建 ACL 術后移植物塑形過程中，MKX 發揮至關重要的膠原調控作用，在移植物塑形穩定后，關節鏡下評估為塑形良好的移植物較塑形一般的移植物其 MKX 及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達更接近正常 ACL[16]。目前缺少 ACL 移植物 MKX 及膠原纖維超微結構相關性研究。因此，本研究擬對塑形穩定期 ACL 移植物 MKX 表達水平進行觀察，分析其與移植物膠原纖維直徑的相關性，為研究 MKX 調控 ACL 移植物塑形的相關機制奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 韌帶標本來源
以 2018 年 1 月—8 月于我院行關節鏡下自體腘繩肌腱單束重建 ACL 術后 48 個月以上、因移除脛骨端內固定物行二次關節鏡探查患者的移植物為研究對象。患者納入標準：① 關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束解剖重建 ACL 術后 48 個月以上；重建手術由同一組醫生完成，術中腘繩肌腱編織成 4～8 股，移植物直徑 7.5～9.0 mm、長 6.5～10.0 cm；股骨端帶袢鈦板（Smith & Nephew 公司，美國）懸吊固定，脛骨端骨道內固定翼系統及界面螺釘（Smith & Nephew 公司，美國）加骨道外門形釘雙重固定；術后采用相同康復計劃。② 二次關節鏡探查術前 Lachman 試驗陰性、軸移試驗陰性，KT-2000（MED metric 公司，美國）檢查雙側膝關節脛骨前向位移差值≤5 mm，膝關節 Lysholm 評分≥80 分。③ 患膝關節 MRI 檢查證實移植物連續性完整，無移植物明顯缺失、迂曲及高信號影，MRI 評分[17]≥75 分。④ 二次關節鏡探查證實關節內移植物連續性完整、無容量缺損，關節鏡下測量移植物直徑較重建術時減少比例≤30%。排除標準：① ACL 翻修；② 聯合同種異體肌腱重建 ACL；③ 合并膝關節其他慢性代謝或傳染性關節病變。
1.2 移植物關節鏡下評分
兩位未參與 ACL 重建術的高年資醫生分別對 ACL 移植物進行關節鏡下評估，取均值。根據關節鏡下移植物質量評估標準[18-19]進行評分，包括移植物滑膜及血管覆蓋、移植物張力、移植物容量及纖維再撕裂情況。其中，移植物關節鏡下評分 5～6 分為塑形良好，3～4 分為塑形一般，0～2 分為塑形不良。
1.3 關節鏡下取材
關節鏡下行移植物探查及關節清理后，使用探鉤及射頻縱形切開移植物中央表面滑膜，探查確認移植物纖維脛骨端與股骨端完整后，使用自制的 ACL 取樣針從移植物中央區域縱向鉗取厚 2 mm、長 6 mm 標本，注意避免鉗取滑膜組織及避開移植物撕裂或磨損區域。
移植物樣本取出后于無菌環境下分為 3 份，其中 2 份進行透射電鏡觀察，縱切面與橫切面各 1 份，大小分別厚 1 mm、長 2 mm 以及厚 2 mm、長 1 mm，標本置于預冷的 4℃ 電鏡固定液（2.5% 中性戊二醛）中保存。另外 1 份樣本（厚 2 mm、長 3 mm）行實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）檢查，標本取出后立即置于液氮罐中保存，然后轉移至?80℃ 冰箱凍存。
1.4 透射電鏡觀察
樣本于 2.5% 中性戊二醛固定 2 h 后取出，0.1 mol/L PBS 漂洗 6 次，每次 30 min；1% 鋨酸固定 1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 10 min；梯度乙醇脫水，Epon812 樹脂包埋；電熱鼓風干燥箱中加熱聚合固化。超薄切片機（Leica 公司，德國）半薄切片（層厚 1 μm），光鏡（OLYMPUS 公司，日本）下定位目標觀察區域后行超薄切片，厚度 60 nm。2% 醋酸雙氧鈾染色 30 min，檸檬酸鉛染色 15 min，雙蒸水沖洗切片，烤燈下烤 15 min，使切片徹底干燥。
于透射電鏡（JEOL 公司，日本）下觀察樣本膠原纖維超微結構特點，采用自帶 RADIUS 采圖測量軟件進行觀察，用 2 160 行/nm 的復制光柵進行放大檢查。在橫切面樣本上測量膠原纖維直徑及不同類型纖維比值，每個切片至少測量 5 個視野，取均值。測量指標：移植物膠原纖維直徑（Dc）、大直徑（≥90 nm）膠原纖維直徑（DL）、小直徑（< 90 nm）膠原纖維直徑（DS）以及大、小直徑膠原纖維數量比值（RL/S）。
1.5 qRT-PCR 檢測 MKX 表達水平
每個樣本取約 200 mg 組織，分離提取總 RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析和分光度測定 RNA 的完整性和濃度、純度，然后逆轉錄合成 cDNA，反應體系如下：5×RT Master Mix 4 μL，RNA Template 2 μg，加入 Nuclease-free Water 至 20 mL。處理步驟：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃ 5 min，離心并?20℃ 保存。于熒光定量 PCR 儀（ABI 7900HT，Applied Biosystems 公司，美國）采用 Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix（Takara 公司，日本）進行檢測，以 GAPDH 為內參基因。引物設計：MKX，上游 5′-GAAGGCAACTTTGTCTATCGCA-3′，下游 5′-TGATCTCCTTCCAATACGTGTC-3′；GAPDH，上游 5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。共 40 個循環，退火溫度為 60℃。采用 2?ΔΔCt 方法計算目標基因表達，計算與內參基因 GAPDH 的比值作為 MKX 相對表達值。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，檢驗水準 α=0.05。首先，對 ACL 移植物 MKX 表達水平與 Dc、DL、Ds、RL/S 進行 Spearman 相關分析；若結果呈直線相關，則以 MKX 表達水平為自變量（x）、移植物膠原纖維直徑為因變量（y）進一步進行線性回歸，以獲得二者之間的線性依存關系。
2 結果
2.1 納入研究患者基本資料
共 26 例患者符合選擇標準，其 ACL 移植物標本納入研究。男 20 例，女 6 例；年齡 21～44 歲，平均 32.3 歲。ACL 重建術至二次關節鏡探查時間為 52～128 個月，平均 78.6 個月。二次關節鏡探查前，膝關節 Lysholm 評分為 83～96 分，平均 90.3 分。Lachman 試驗及軸移試驗均為陰性。KT-2000 檢測雙側膝關節脛骨前向位移差值為 0～4 mm，平均 2.3 mm。MRI 檢查所有移植物連續性完整，無移植物明顯缺失、迂曲及高信號影；移植物評分為 78～89 分，平均 82.8 分。關節鏡下移植物質量評分為 3～6 分，平均 4.8 分；塑形良好 17 例、塑形一般 9 例。
2.2 透射電鏡觀察
ACL 移植物均表現為大直徑與小直徑膠原纖維雙峰混合排列，與正常 ACL 類似。與塑形一般的移植物相比，塑形良好的移植物可見更豐富的大直徑膠原纖維，且大、小直徑膠原纖維間隔交叉分布更均勻、有序（圖 1）。
圖1
移植物觀察
從左至右分別為關節鏡下以及縱切面、橫切面透射電鏡（×50 k）觀察 L：大直徑膠原纖維 S：小直徑膠原纖維a. 塑形良好移植物；b. 塑形一般移植物
Figure1. Graft observationFrom left to right for arthroscopic observation and longitudinal and cross sections observations by transmission electron microscopy (×50 k) L: Large-diameter collagen fiber S: Small-diameter collagen fiber a. Excellent remodeling graft; b. Fair remodeling graft
移植物 Dc、DL、DS 及 RL/S 分別為（65.2±9.3）nm、（91.6±10.5）nm、（45.7±8.6）nm、0.73±0.12。
2.3 移植物 MKX 表達水平及其與移植物膠原纖維直徑相關性分析
移植物 MKX 相對表達量為 1.42±0.11。相關分析顯示，移植物 MKX 表達水平與 Dc、DL 及 RL/S 成正相關（r=0.809，P=0.000；r=0.861，P=0.000；r=0.942，P=0.000），與 DS 無相關（r=0.147，P=0.238）。進一步回歸分析示，MKX 表達水平可以預測移植物 Dc、DL及 RL/S（P<0.05）。見表1。
表1
MKX 表達水平與移植物膠原纖維 DC、DL 及 RL/S 的線性回歸分析
Table1.
Linear regression analysis of MKX expression level and DC, DL, and RL/S of graft collagen fiber
3 討論
3.1 ACL 塑形階段及塑形時間
自體腘繩肌腱是 ACL 重建常用移植物，在形態學、組織學及生物力學三方面均具有優勢[1-3]。然而，移植物組織最終能否完全轉化為超微結構類似正常 ACL 的組織，還是僅作為股骨與脛骨之間的纖維連接，目前尚無定論[5]。游離肌腱移植物植入膝關節后，在關節內通過一系列復雜的組織學生物學變化，轉變為大體與正常 ACL 相似的組織[4-5]。移植物塑形過程分為塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形穩定期 4 個階段，一般重建術后 9～18 個月達塑形穩定期[20-21]。但目前對于移植物塑形穩定期時間仍有爭議，因為大部分塑形研究均未超過術后 15 個月[5]。Sánchez 等[22]提出 ACL 移植物塑形成熟需要 2 年左右，Rougraff 等[23]報道 ACL 重建術后 3 年仍然可以觀察到移植物局部去血管化和細胞富集。為此，為保證移植物均達塑形穩定期，本研究選擇 ACL 重建術后至少 4 年的移植物作為研究對象。
3.2 ACL 膠原纖維超微結構特點
自 Parry 等[12]報道成人成熟肌腱及韌帶膠原纖維呈雙峰分布之后，后續研究將 ACL 膠原纖維分成小直徑（細）膠原纖維和大直徑（粗）膠原纖維兩大類，前者直徑范圍為 30～90 nm，占整個韌帶纖維數量的 70%～80%；后者直徑范圍為 90～110 nm，占整個韌帶纖維的 20%～30%[23-25]。研究發現，粗、細膠原纖維的超微結構不同，前者輪廓不規則、直徑大小不統一；后者纖維輪廓規則、邊緣平滑、直徑統一，直徑分布波峰在 45 nm 處[22]。有學者認為肌腱及韌帶高抗拉強度與存在大直徑膠原纖維相關，因為大直徑膠原纖維分子間膠原交聯密度更高。相關定量分析證實了這一假設[26]，研究發現在關節外環境中，大直徑膠原纖維與豬屈肌腱和伸肌腱拉伸強度存在明顯正相關。進一步研究發現，韌帶的膠原纖維超微結構特點與韌帶局部生物力學環境密切關系，不均勻的大直徑膠原纖維有利于韌帶抵抗高牽拉應力，而均勻一致的小直徑膠原纖維則與韌帶抗多向應力相關[27-28]。因此，研究不同塑形情況的移植物膠原纖維超微結構特點，可以掌握移植物的組織學及生物力學特點，進而為研究移植物塑形機制提供良好的評判標準及評估體系。
3.3 ACL 重建術后移植物超微結構變化
ACL 重建術后，肌腱移植物超微結構變化主要體現在膠原纖維數量及大、小直徑膠原纖維比例的改變。既往研究發現肌腱移植物在塑形過程中，大直徑膠原纖維逐步減少，塑形成熟后只有小直徑膠原纖維的單峰分布。Shino 等[25]使用各種同種異體肌腱組織重建 ACL 并分析其膠原纖維構成，發現術后 6 個月內大直徑膠原纖維比例下降，但仍呈單峰與雙峰混合的雙峰分布；6 個月后大直徑膠原纖維消失，被小直徑膠原纖維取代，呈典型單峰分布。Abe 等[21]發現骨-髕腱-骨移植物在術后 6～15 個月時呈統一的小直徑膠原纖維分布，大直徑膠原纖維通常在術后 9 個月內減少，術后約 1 年完全消失。Zaffagnini 等[20]研究評估了自體腘繩肌腱重建術后 10 年的超微結構變化特點，結果顯示腘繩肌腱移植物膠原纖維數目和直徑改變發生在術后 2 年內，表現為移植物膠原纖維直徑分布范圍小于正常肌腱，大部分膠原纖維直徑<50 nm，2 年后移植物超微結構不再發生明顯變化，小直徑膠原纖維單峰分布一直維持到術后 10 年。這種超微結構變化現象在動物模型中出現更早，Jackson 等[29]報道了山羊 ACL 重建模型中，自體肌腱移植物大直徑膠原纖維在術后 12 周即消失，52 周內移植物表面區域大直徑膠原纖維完全消失。在其他動物模型中也觀察到膠原纖維由雙峰向單峰分布的類似變化，不能恢復完整 ACL 中存在的不同類型膠原纖維異質性組成[30-31]。
本研究發現不管是關節鏡下評分表現為塑形良好還是塑形一般的 ACL 移植物，在術后 4～10 年均存在大直徑膠原纖維的分布，關節鏡下塑形成熟度越高的移植物組織，大直徑膠原纖維含量越豐富且膠原纖維直徑更大，與 Dong 等[32]、夏春等[33]研究結果一致，但是與之前的研究結果不同，分析可能有以下兩方面原因：首先，本研究標本均來自取脛骨端內固定物而行二次關節鏡探查的患者，其臨床功能評分、影像學評分、關節鏡評分均表現優良。臨床工作中，我們對移植物塑形不良的患者往往采取進一步保守康復治療，而對失敗患者采取翻修手術（部分加強或重建），因此這部分塑形不良或塑形失敗的患者未納入研究。所以本研究只能說明 ACL 重建術后塑形成功的患者，其移植物超微結構特點可以表現為正常 ACL 結構的大、小直徑膠原纖維雙峰分布特征。其次，ACL 移植物會根據新的生物力學和生物環境進行組織學重建，影響移植物重建過程的因素很多，包括手術技術、移植物固定和康復方案[4]。移植物組織受力強度和持續時間可傳導給調控硫酸葡萄糖胺糖合成的細胞，而硫酸葡萄糖胺糖最終決定膠原纖維直徑，從而使組織更適應功能和力學需要。大直徑膠原纖維占移植物的橫截面積越大，移植物抗張力性能越強，反映移植物此時局部的生物力學特點接近正常 ACL。本研究采用的 ACL 解剖重建可能使得移植物在解剖結構特點上更接近正常 ACL，從而具有更類似的局部生物力學環境。同時，本研究納入患者在術后 2 年內均采取保守的康復策略，以保護移植物在塑形成熟前免受過多外界應力刺激干擾，并防止移植物局部纖維的再撕裂；從術后 6 個月開始，每 3 個月行 MRI 檢查，根據患者移植物 MRI 評分不斷調整患者運動方式、運動量與運動頻率，使得患者 MRI 評分穩步維持在優良水平，從而保證移植物在每個階段都能有一個適合的力學刺激強度，最終逐步達到正常 ACL 局部生物力學狀態，從而有助于移植物膠原纖維超微結構特點向正常 ACL 組織轉變。
3.4 移植物 MKX 表達與 ACL 移植物塑形的關系
MKX 是三氨基酸循環超家族中非典型的同源異型盒基因，是肌腱調節膠原蛋白合成代謝的關鍵基因[14-15]。在損傷肌腱修復過程中，MKX 發揮著重要作用。在肌腱組織損傷早期 MKX 表達增加，可促進肌腱膠原纖維的合成，利于組織修復[32]。骨關節炎患者 ACL 膠原組織排列不規則、紊亂，成纖維細胞中 MKX 表達量明顯降低[34]。我們前期研究對不同塑形程度 ACL 移植物的 MKX 及膠原表達進行了對比研究，發現正常 ACL 及塑形良好移植物中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量豐富，纖維排列有序，MKX 陽性細胞比例高；而塑形不良的移植物中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量明顯降低，纖維排列較紊亂，MKX 陽性細胞比例減少[16]。
本次研究進一步探討了移植物 MKX 表達水平與膠原纖維超微結構的相關性，結果表明移植物 MKX 表達水平與移植物大直徑膠原纖維分布含量存在密切關系。其中，MKX 相對表達水平與 Dc、DL 及 RL/S 成正相關，與 DS 不相關。因此，在自體腘繩肌腱移植物塑形穩定后，MKX 表達水平可預測電鏡下膠原纖維超微結構測量結果，可作為移植物膠原合成代謝水平的重要評估依據。這一研究成果表明在關節內局部生物學及生物力學環境因素的作用下，MKX 可能通過調控表達膠原代謝及硫酸葡萄糖胺糖等相關基因，影響移植物最終膠原構成。由于重建方式、康復方案、膝關節運動方式不同，導致個體 ACL 移植物局部生物力學環境也不同，組織為適應這種生物力學差異表現出了不一樣的生物學特性，MKX 通過上調或下調與抗張力強度直接相關的大直徑膠原纖維表達水平，從而適應移植物局部生物力學的環境。
本研究著眼于術后塑形穩定期 ACL 移植物的 MKX 與膠原纖維超微結構的相關性，主要存在以下不足：① 本研究是侵入性人體組織活體取材研究，由于倫理要求及限制，不能取韌帶中央標本或整條韌帶進行多處病理檢查。因此，實驗結果可能受取材部位的影響，比如移植物表面與移植物中央標本組織學結果可能不同。② 移植物膠原纖維超微結構評估指標還包括膠原纖維橫截面面積，彈性纖維及耐酸纖維數量、比例、分布等指標[22]，需要在今后研究中進一步探討。
作者貢獻：陸偉、王大平負責科研設計，李瑛、吳冰、丘志河、梁達強、柳海峰、彭亮權負責實驗實施及文章撰寫，李皓、鐘名金、陳康、馮文哲負責數據收集整理及統計分析，許鑒、歐陽侃、朱偉民負責論文審校。
利益沖突：本文所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。本研究來源的基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經深圳大學第一附屬醫院（深圳市第二人民醫院）醫學倫理委員會批準（批號：20173357201819），患者均知情同意。
目前，對于前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷臨床常選擇關節鏡下自體腘繩肌腱移植重建[1-3]。肌腱移植物在膝關節內經歷缺血壞死、血管重建、細胞增殖和組織成熟等生物學改變過程，最終轉變為與正常 ACL 組織學相似的組織，這一過程被定義為 ACL 移植物塑形或韌帶化[4-5]。研究發現，移植物塑形結果會直接決定移植物的生物力學特性，進而影響膝關節穩定性及運動功能[6-7]。
Ⅰ、Ⅲ型膠原是韌帶和肌腱主要組成成分，也是賦予韌帶和肌腱力學特性的重要結構基礎。ACL 具有大直徑（≥90 nm）與小直徑（<90 nm）膠原纖維雙峰混合分布模式，大直徑膠原纖維因膠原分子間高密度的交聯而具有更高的抗張力強度[8-9]。結締組織的最大載荷強度與膠原纖維的總體平均直徑成正相關[10-12]，在 ACL 移植物進入塑形穩定期后（術后 9～36 個月后）移植物的組織學特點，尤其是膠原纖維類型、直徑、分布等超微結構特點，是判定移植物最終轉歸結果的金標準[13]。
Mohawk（MKX）是三氨基酸循環超家族中，非典型的同源異型盒基因編碼的調節肌肉、軟骨、肌腱、骨骼等組織膠原蛋白合成代謝的關鍵轉錄因子[14-15]。我們前期研究發現，在自體肌腱重建 ACL 術后移植物塑形過程中，MKX 發揮至關重要的膠原調控作用，在移植物塑形穩定后，關節鏡下評估為塑形良好的移植物較塑形一般的移植物其 MKX 及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達更接近正常 ACL[16]。目前缺少 ACL 移植物 MKX 及膠原纖維超微結構相關性研究。因此，本研究擬對塑形穩定期 ACL 移植物 MKX 表達水平進行觀察，分析其與移植物膠原纖維直徑的相關性，為研究 MKX 調控 ACL 移植物塑形的相關機制奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 韌帶標本來源
以 2018 年 1 月—8 月于我院行關節鏡下自體腘繩肌腱單束重建 ACL 術后 48 個月以上、因移除脛骨端內固定物行二次關節鏡探查患者的移植物為研究對象。患者納入標準：① 關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束解剖重建 ACL 術后 48 個月以上；重建手術由同一組醫生完成，術中腘繩肌腱編織成 4～8 股，移植物直徑 7.5～9.0 mm、長 6.5～10.0 cm；股骨端帶袢鈦板（Smith & Nephew 公司，美國）懸吊固定，脛骨端骨道內固定翼系統及界面螺釘（Smith & Nephew 公司，美國）加骨道外門形釘雙重固定；術后采用相同康復計劃。② 二次關節鏡探查術前 Lachman 試驗陰性、軸移試驗陰性，KT-2000（MED metric 公司，美國）檢查雙側膝關節脛骨前向位移差值≤5 mm，膝關節 Lysholm 評分≥80 分。③ 患膝關節 MRI 檢查證實移植物連續性完整，無移植物明顯缺失、迂曲及高信號影，MRI 評分[17]≥75 分。④ 二次關節鏡探查證實關節內移植物連續性完整、無容量缺損，關節鏡下測量移植物直徑較重建術時減少比例≤30%。排除標準：① ACL 翻修；② 聯合同種異體肌腱重建 ACL；③ 合并膝關節其他慢性代謝或傳染性關節病變。
1.2 移植物關節鏡下評分
兩位未參與 ACL 重建術的高年資醫生分別對 ACL 移植物進行關節鏡下評估，取均值。根據關節鏡下移植物質量評估標準[18-19]進行評分，包括移植物滑膜及血管覆蓋、移植物張力、移植物容量及纖維再撕裂情況。其中，移植物關節鏡下評分 5～6 分為塑形良好，3～4 分為塑形一般，0～2 分為塑形不良。
1.3 關節鏡下取材
關節鏡下行移植物探查及關節清理后，使用探鉤及射頻縱形切開移植物中央表面滑膜，探查確認移植物纖維脛骨端與股骨端完整后，使用自制的 ACL 取樣針從移植物中央區域縱向鉗取厚 2 mm、長 6 mm 標本，注意避免鉗取滑膜組織及避開移植物撕裂或磨損區域。
移植物樣本取出后于無菌環境下分為 3 份，其中 2 份進行透射電鏡觀察，縱切面與橫切面各 1 份，大小分別厚 1 mm、長 2 mm 以及厚 2 mm、長 1 mm，標本置于預冷的 4℃ 電鏡固定液（2.5% 中性戊二醛）中保存。另外 1 份樣本（厚 2 mm、長 3 mm）行實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）檢查，標本取出后立即置于液氮罐中保存，然后轉移至?80℃ 冰箱凍存。
1.4 透射電鏡觀察
樣本于 2.5% 中性戊二醛固定 2 h 后取出，0.1 mol/L PBS 漂洗 6 次，每次 30 min；1% 鋨酸固定 1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 10 min；梯度乙醇脫水，Epon812 樹脂包埋；電熱鼓風干燥箱中加熱聚合固化。超薄切片機（Leica 公司，德國）半薄切片（層厚 1 μm），光鏡（OLYMPUS 公司，日本）下定位目標觀察區域后行超薄切片，厚度 60 nm。2% 醋酸雙氧鈾染色 30 min，檸檬酸鉛染色 15 min，雙蒸水沖洗切片，烤燈下烤 15 min，使切片徹底干燥。
于透射電鏡（JEOL 公司，日本）下觀察樣本膠原纖維超微結構特點，采用自帶 RADIUS 采圖測量軟件進行觀察，用 2 160 行/nm 的復制光柵進行放大檢查。在橫切面樣本上測量膠原纖維直徑及不同類型纖維比值，每個切片至少測量 5 個視野，取均值。測量指標：移植物膠原纖維直徑（Dc）、大直徑（≥90 nm）膠原纖維直徑（DL）、小直徑（< 90 nm）膠原纖維直徑（DS）以及大、小直徑膠原纖維數量比值（RL/S）。
1.5 qRT-PCR 檢測 MKX 表達水平
每個樣本取約 200 mg 組織，分離提取總 RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析和分光度測定 RNA 的完整性和濃度、純度，然后逆轉錄合成 cDNA，反應體系如下：5×RT Master Mix 4 μL，RNA Template 2 μg，加入 Nuclease-free Water 至 20 mL。處理步驟：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃ 5 min，離心并?20℃ 保存。于熒光定量 PCR 儀（ABI 7900HT，Applied Biosystems 公司，美國）采用 Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix（Takara 公司，日本）進行檢測，以 GAPDH 為內參基因。引物設計：MKX，上游 5′-GAAGGCAACTTTGTCTATCGCA-3′，下游 5′-TGATCTCCTTCCAATACGTGTC-3′；GAPDH，上游 5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。共 40 個循環，退火溫度為 60℃。采用 2?ΔΔCt 方法計算目標基因表達，計算與內參基因 GAPDH 的比值作為 MKX 相對表達值。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，檢驗水準 α=0.05。首先，對 ACL 移植物 MKX 表達水平與 Dc、DL、Ds、RL/S 進行 Spearman 相關分析；若結果呈直線相關，則以 MKX 表達水平為自變量（x）、移植物膠原纖維直徑為因變量（y）進一步進行線性回歸，以獲得二者之間的線性依存關系。
2 結果
2.1 納入研究患者基本資料
共 26 例患者符合選擇標準，其 ACL 移植物標本納入研究。男 20 例，女 6 例；年齡 21～44 歲，平均 32.3 歲。ACL 重建術至二次關節鏡探查時間為 52～128 個月，平均 78.6 個月。二次關節鏡探查前，膝關節 Lysholm 評分為 83～96 分，平均 90.3 分。Lachman 試驗及軸移試驗均為陰性。KT-2000 檢測雙側膝關節脛骨前向位移差值為 0～4 mm，平均 2.3 mm。MRI 檢查所有移植物連續性完整，無移植物明顯缺失、迂曲及高信號影；移植物評分為 78～89 分，平均 82.8 分。關節鏡下移植物質量評分為 3～6 分，平均 4.8 分；塑形良好 17 例、塑形一般 9 例。
2.2 透射電鏡觀察
ACL 移植物均表現為大直徑與小直徑膠原纖維雙峰混合排列，與正常 ACL 類似。與塑形一般的移植物相比，塑形良好的移植物可見更豐富的大直徑膠原纖維，且大、小直徑膠原纖維間隔交叉分布更均勻、有序（圖 1）。
圖1
移植物觀察
從左至右分別為關節鏡下以及縱切面、橫切面透射電鏡（×50 k）觀察 L：大直徑膠原纖維 S：小直徑膠原纖維a. 塑形良好移植物；b. 塑形一般移植物
Figure1. Graft observationFrom left to right for arthroscopic observation and longitudinal and cross sections observations by transmission electron microscopy (×50 k) L: Large-diameter collagen fiber S: Small-diameter collagen fiber a. Excellent remodeling graft; b. Fair remodeling graft
移植物 Dc、DL、DS 及 RL/S 分別為（65.2±9.3）nm、（91.6±10.5）nm、（45.7±8.6）nm、0.73±0.12。
2.3 移植物 MKX 表達水平及其與移植物膠原纖維直徑相關性分析
移植物 MKX 相對表達量為 1.42±0.11。相關分析顯示，移植物 MKX 表達水平與 Dc、DL 及 RL/S 成正相關（r=0.809，P=0.000；r=0.861，P=0.000；r=0.942，P=0.000），與 DS 無相關（r=0.147，P=0.238）。進一步回歸分析示，MKX 表達水平可以預測移植物 Dc、DL及 RL/S（P<0.05）。見表1。
表1
MKX 表達水平與移植物膠原纖維 DC、DL 及 RL/S 的線性回歸分析
Table1.
Linear regression analysis of MKX expression level and DC, DL, and RL/S of graft collagen fiber
3 討論
3.1 ACL 塑形階段及塑形時間
自體腘繩肌腱是 ACL 重建常用移植物，在形態學、組織學及生物力學三方面均具有優勢[1-3]。然而，移植物組織最終能否完全轉化為超微結構類似正常 ACL 的組織，還是僅作為股骨與脛骨之間的纖維連接，目前尚無定論[5]。游離肌腱移植物植入膝關節后，在關節內通過一系列復雜的組織學生物學變化，轉變為大體與正常 ACL 相似的組織[4-5]。移植物塑形過程分為塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形穩定期 4 個階段，一般重建術后 9～18 個月達塑形穩定期[20-21]。但目前對于移植物塑形穩定期時間仍有爭議，因為大部分塑形研究均未超過術后 15 個月[5]。Sánchez 等[22]提出 ACL 移植物塑形成熟需要 2 年左右，Rougraff 等[23]報道 ACL 重建術后 3 年仍然可以觀察到移植物局部去血管化和細胞富集。為此，為保證移植物均達塑形穩定期，本研究選擇 ACL 重建術后至少 4 年的移植物作為研究對象。
3.2 ACL 膠原纖維超微結構特點
自 Parry 等[12]報道成人成熟肌腱及韌帶膠原纖維呈雙峰分布之后，后續研究將 ACL 膠原纖維分成小直徑（細）膠原纖維和大直徑（粗）膠原纖維兩大類，前者直徑范圍為 30～90 nm，占整個韌帶纖維數量的 70%～80%；后者直徑范圍為 90～110 nm，占整個韌帶纖維的 20%～30%[23-25]。研究發現，粗、細膠原纖維的超微結構不同，前者輪廓不規則、直徑大小不統一；后者纖維輪廓規則、邊緣平滑、直徑統一，直徑分布波峰在 45 nm 處[22]。有學者認為肌腱及韌帶高抗拉強度與存在大直徑膠原纖維相關，因為大直徑膠原纖維分子間膠原交聯密度更高。相關定量分析證實了這一假設[26]，研究發現在關節外環境中，大直徑膠原纖維與豬屈肌腱和伸肌腱拉伸強度存在明顯正相關。進一步研究發現，韌帶的膠原纖維超微結構特點與韌帶局部生物力學環境密切關系，不均勻的大直徑膠原纖維有利于韌帶抵抗高牽拉應力，而均勻一致的小直徑膠原纖維則與韌帶抗多向應力相關[27-28]。因此，研究不同塑形情況的移植物膠原纖維超微結構特點，可以掌握移植物的組織學及生物力學特點，進而為研究移植物塑形機制提供良好的評判標準及評估體系。
3.3 ACL 重建術后移植物超微結構變化
ACL 重建術后，肌腱移植物超微結構變化主要體現在膠原纖維數量及大、小直徑膠原纖維比例的改變。既往研究發現肌腱移植物在塑形過程中，大直徑膠原纖維逐步減少，塑形成熟后只有小直徑膠原纖維的單峰分布。Shino 等[25]使用各種同種異體肌腱組織重建 ACL 并分析其膠原纖維構成，發現術后 6 個月內大直徑膠原纖維比例下降，但仍呈單峰與雙峰混合的雙峰分布；6 個月后大直徑膠原纖維消失，被小直徑膠原纖維取代，呈典型單峰分布。Abe 等[21]發現骨-髕腱-骨移植物在術后 6～15 個月時呈統一的小直徑膠原纖維分布，大直徑膠原纖維通常在術后 9 個月內減少，術后約 1 年完全消失。Zaffagnini 等[20]研究評估了自體腘繩肌腱重建術后 10 年的超微結構變化特點，結果顯示腘繩肌腱移植物膠原纖維數目和直徑改變發生在術后 2 年內，表現為移植物膠原纖維直徑分布范圍小于正常肌腱，大部分膠原纖維直徑<50 nm，2 年后移植物超微結構不再發生明顯變化，小直徑膠原纖維單峰分布一直維持到術后 10 年。這種超微結構變化現象在動物模型中出現更早，Jackson 等[29]報道了山羊 ACL 重建模型中，自體肌腱移植物大直徑膠原纖維在術后 12 周即消失，52 周內移植物表面區域大直徑膠原纖維完全消失。在其他動物模型中也觀察到膠原纖維由雙峰向單峰分布的類似變化，不能恢復完整 ACL 中存在的不同類型膠原纖維異質性組成[30-31]。
本研究發現不管是關節鏡下評分表現為塑形良好還是塑形一般的 ACL 移植物，在術后 4～10 年均存在大直徑膠原纖維的分布，關節鏡下塑形成熟度越高的移植物組織，大直徑膠原纖維含量越豐富且膠原纖維直徑更大，與 Dong 等[32]、夏春等[33]研究結果一致，但是與之前的研究結果不同，分析可能有以下兩方面原因：首先，本研究標本均來自取脛骨端內固定物而行二次關節鏡探查的患者，其臨床功能評分、影像學評分、關節鏡評分均表現優良。臨床工作中，我們對移植物塑形不良的患者往往采取進一步保守康復治療，而對失敗患者采取翻修手術（部分加強或重建），因此這部分塑形不良或塑形失敗的患者未納入研究。所以本研究只能說明 ACL 重建術后塑形成功的患者，其移植物超微結構特點可以表現為正常 ACL 結構的大、小直徑膠原纖維雙峰分布特征。其次，ACL 移植物會根據新的生物力學和生物環境進行組織學重建，影響移植物重建過程的因素很多，包括手術技術、移植物固定和康復方案[4]。移植物組織受力強度和持續時間可傳導給調控硫酸葡萄糖胺糖合成的細胞，而硫酸葡萄糖胺糖最終決定膠原纖維直徑，從而使組織更適應功能和力學需要。大直徑膠原纖維占移植物的橫截面積越大，移植物抗張力性能越強，反映移植物此時局部的生物力學特點接近正常 ACL。本研究采用的 ACL 解剖重建可能使得移植物在解剖結構特點上更接近正常 ACL，從而具有更類似的局部生物力學環境。同時，本研究納入患者在術后 2 年內均采取保守的康復策略，以保護移植物在塑形成熟前免受過多外界應力刺激干擾，并防止移植物局部纖維的再撕裂；從術后 6 個月開始，每 3 個月行 MRI 檢查，根據患者移植物 MRI 評分不斷調整患者運動方式、運動量與運動頻率，使得患者 MRI 評分穩步維持在優良水平，從而保證移植物在每個階段都能有一個適合的力學刺激強度，最終逐步達到正常 ACL 局部生物力學狀態，從而有助于移植物膠原纖維超微結構特點向正常 ACL 組織轉變。
3.4 移植物 MKX 表達與 ACL 移植物塑形的關系
MKX 是三氨基酸循環超家族中非典型的同源異型盒基因，是肌腱調節膠原蛋白合成代謝的關鍵基因[14-15]。在損傷肌腱修復過程中，MKX 發揮著重要作用。在肌腱組織損傷早期 MKX 表達增加，可促進肌腱膠原纖維的合成，利于組織修復[32]。骨關節炎患者 ACL 膠原組織排列不規則、紊亂，成纖維細胞中 MKX 表達量明顯降低[34]。我們前期研究對不同塑形程度 ACL 移植物的 MKX 及膠原表達進行了對比研究，發現正常 ACL 及塑形良好移植物中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量豐富，纖維排列有序，MKX 陽性細胞比例高；而塑形不良的移植物中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量明顯降低，纖維排列較紊亂，MKX 陽性細胞比例減少[16]。
本次研究進一步探討了移植物 MKX 表達水平與膠原纖維超微結構的相關性，結果表明移植物 MKX 表達水平與移植物大直徑膠原纖維分布含量存在密切關系。其中，MKX 相對表達水平與 Dc、DL 及 RL/S 成正相關，與 DS 不相關。因此，在自體腘繩肌腱移植物塑形穩定后，MKX 表達水平可預測電鏡下膠原纖維超微結構測量結果，可作為移植物膠原合成代謝水平的重要評估依據。這一研究成果表明在關節內局部生物學及生物力學環境因素的作用下，MKX 可能通過調控表達膠原代謝及硫酸葡萄糖胺糖等相關基因，影響移植物最終膠原構成。由于重建方式、康復方案、膝關節運動方式不同，導致個體 ACL 移植物局部生物力學環境也不同，組織為適應這種生物力學差異表現出了不一樣的生物學特性，MKX 通過上調或下調與抗張力強度直接相關的大直徑膠原纖維表達水平，從而適應移植物局部生物力學的環境。
本研究著眼于術后塑形穩定期 ACL 移植物的 MKX 與膠原纖維超微結構的相關性，主要存在以下不足：① 本研究是侵入性人體組織活體取材研究，由于倫理要求及限制，不能取韌帶中央標本或整條韌帶進行多處病理檢查。因此，實驗結果可能受取材部位的影響，比如移植物表面與移植物中央標本組織學結果可能不同。② 移植物膠原纖維超微結構評估指標還包括膠原纖維橫截面面積，彈性纖維及耐酸纖維數量、比例、分布等指標[22]，需要在今后研究中進一步探討。
作者貢獻：陸偉、王大平負責科研設計，李瑛、吳冰、丘志河、梁達強、柳海峰、彭亮權負責實驗實施及文章撰寫，李皓、鐘名金、陳康、馮文哲負責數據收集整理及統計分析，許鑒、歐陽侃、朱偉民負責論文審校。
利益沖突：本文所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。本研究來源的基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經深圳大學第一附屬醫院（深圳市第二人民醫院）醫學倫理委員會批準（批號：20173357201819），患者均知情同意。
