引用本文： 趙斌, 馬劍雄, 馬信龍. 組織工程周圍神經血管化研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(8): 1029-1032. doi: 10.7507/1002-1892.201902032 復制
臨床上，由于創傷、腫瘤等原因造成的周圍神經缺損非常多見，周圍神經損傷已成為全球所面臨的健康問題之一[1]。目前，臨床修復周圍神經缺損的主要方法是自體神經移植，但存在自體神經來源有限、供區神經功能喪失及神經直徑難以匹配等問題。同種異體神經或異種神經是理想的神經來源，但因存在嚴重免疫排斥反應常導致治療失敗[2]。因此需要進一步研究理想的永久性修復材料。
近年來，隨著材料科學、細胞生物學的進步，采用組織工程技術構建組織工程周圍神經，為神經損傷的修復帶來了新希望。但構建的組織工程周圍神經修復大段周圍神經缺損還存在諸多問題，尤其是組織工程周圍神經的血管化問題成為限制其發揮生物學效能的一個“瓶頸”[3-4]。組織工程周圍神經早期血管化問題日益受到學者們的關注。組織工程周圍神經血管化的研究主要包括以下 5 個方面：周圍神經再生局部微環境及血供特點、支架材料修飾、種子細胞、自體血管束的植入、促血管因子。本文將圍繞上述 5 個方面進行文獻回顧及總結。
1 周圍神經再生局部微環境及血供特點
眾所周知，周圍神經主干結構是由神經纖維束及其周圍包括血管在內的結締組織構成[5]。神經移植后，移植段神經血管再形成大致有兩種形式：① 神經內形式，即內部叢狀血管，可持續 24 周；② 神經外形式，即外部縱行血管，出現在移植后 3～6 周內。有研究表明[6]，不帶血管的神經移植后 3 d 內為缺血狀態，1 周左右開始出現血流急劇增加；而帶血管的神經移植后早期雖有血流增加，但基本處于平穩狀態，這對于維持周圍神經微環境的穩定具有一定意義。局部微環境及神經再生所需要的各種營養物質對周圍神經的修復再生非常重要，而這些都與局部血供有重要關系[7]。神經移植物早期血管化，可以為移植的各種細胞提供足夠營養，進而促進軸突生長、神經再生；另一方面，可以減少體內膠原纖維形成，便于新生軸突通過。另外，神經移植物早期的血管化還可以聚集來源于血液中的巨噬細胞[8]，以利于快速清除周圍神經損傷后軸突、髓鞘的各種潰變產物，從而為新生軸突向遠端生長提供良好的通道[9]。
近年來，隨著組織工程學迅速發展，應用組織工程周圍神經修復神經缺損已成為研究趨勢[10]。對于大段神經缺損，血管化不足是制約其修復成功的關鍵因素。組織工程周圍神經不能早期血管化，不能早期在體內建立血液循環，制約了其進一步向臨床應用[11]。有研究表明，細胞在血管周圍 150～200 μm 內才能夠通過彌散作用來維持存活，否則移植體內部的細胞將難以通過滲透作用獲得養分及營養的支持[12]。因此，移植物早期血管化對組織工程周圍神經在體內存活起重要作用。
2 支架材料修飾
組織工程周圍神經血管化的最終目的是在移植物周圍形成功能化的血管網[13]，這就要求組織工程神經的支架材料與成血管相關細胞具有良好的組織相容性，以便血管長入。對支架材料的修飾，包括外部多孔狀結構的構建及內部支架的建立。適宜的外部及內部結構可以支持種子細胞黏附、促進種子細胞分化、生長及軸突再生，防止結締組織長入。有研究報道[14]，適宜細胞生長的三維支架材料孔徑應介于 50～400 μm。Chiu 等[15]研究了不同孔徑聚乙二醇多孔支架對移植物血管化的影響，結果表明大孔徑支架比小孔徑支架更有利于血管長入，且孔徑越大血管化程度越高。Bai 等[16]研究了不同孔徑對多孔生物陶瓷材料血管化的影響，結果表明隨著孔徑尺寸的增加，長入的血管逐漸增多。Sun 等[17]利用高分子聚合材料構建了一種三維支架，研究表明該支架有利于血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）長入及增殖，具有潛在促血管生成的能力。
另外，在支架材料表面可以添加一些促進成血管細胞增殖、黏附的物質，如層粘連蛋白、纖維結合素及膠原纖維等。Kemp 等[18]認識到血管化對神經修復的重要性，采用膠原來源神經導管修復周圍神經缺損，促進了軸突生長、雪旺細胞增殖及移植物早期血管化。蔣良福等[19]采用 VEGF 納米微囊對去細胞神經支架進行修飾，促進組織工程神經預血管化。在材料表面修飾方面，通過在組織工程神經內植入緩釋生長因子，可以誘導成血管相關的細胞向支架材料內部遷移、增殖，進而形成毛細血管網。
肝素用于生物材料修飾已有 50 余年，最初研究者們試圖通過離子交互作用將肝素錨定在生物材料表面，減輕材料致凝性并獲得成功[20]。隨著對生物材料研究的深入，為了增加材料的生物相容性以及對細胞的黏附性等生物特性，藥物緩釋系統成為研究熱點，而肝素具備與多種蛋白結合的能力，基于肝素的藥物緩釋系統被證明可以裝載各種生物效應迥異的生長因子[21]。本課題組利用肝素作為緩釋載體，制備了能夠緩釋 VEGF 的組織工程周圍神經，促進了組織工程周圍神經形成血管的能力，實現了組織工程周圍神經的血管化[22]。
3 種子細胞
ECs 是血管形成、再生中的主要細胞[23]。劉春曉等[24]在體外成功建立了人臍靜脈內皮細胞與 BMSCs 共培養體系。高宏陽等[9]將胎兔 ECs 與雪旺細胞共培養后，植入脫細胞神經支架中修復兔坐骨神經缺損，結果優于單純植入雪旺細胞的脫細胞神經支架。
但 ECs 為終末細胞，增殖速度緩慢[25]，短時間內促進血管新生的能力較弱，故應用 ECs 來促進周圍神經修復過程中血供的重建及血管的再生較難實現。而血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為 ECs 的前體細胞，是出生后機體血管形成最主要的干/祖細胞類型[26]。EPCs 不僅參與了胚胎發育過程中的血管形成，也參與了出生后的血管形成[27]。EPCs 可有效地促進周圍神經缺損區域的血管再生，并能明顯增強周圍神經修復和再生能力[28]。在很多種缺血性疾病動物實驗中，外源性注入 EPCs 能明顯改善損傷組織局部血流供應，增強缺血組織局部的新生血管生成，進而促進組織修復[29]。當機體發生創傷、缺血等病理變化時，存在于循環血液中的 EPCs 能夠遷移并定植在損傷缺血部位，分泌促血管生成因子，促進側支血管生長至缺血組織，參與組織血管新生，促進組織修復[30]。EPCs 能夠促進骨修復過程中的血管形成，將 MSCs 與 EPCs 共同作為種子細胞，能夠加快骨缺損的修復[31]。Zigdon-Giladi 等[32]采用人外周血來源內皮祖細胞修復鼠顱骨缺損，促進血管形成及骨形成。對于周圍神經而言，傷后 1 周左右是周圍神經缺損修復重建過程中血管生成的關鍵時期，如果錯過了這個時期，新生血管的生成效率和速度會明顯降低，進而影響神經修復重建的速度。所以對于組織工程周圍神經而言，早期血管化至關重要。
因此，本課題組認為將具有血管形成能力的內皮祖細胞與神經細胞或干細胞聯合應用，是血管化組織工程周圍神經最有前景的方法之一。
4 自體血管束的植入
臨床上，隨著顯微外科技術的發展，有學者采用帶血管的神經移植物修復大段神經缺損，取得了較好臨床效果。早在 1976 年，Taylor 等[33]為了改善神經移植物的血供，提出吻合血管的神經移植，采用攜帶橈動脈及橈靜脈的橈神經淺支成功修復了正中神經缺損。受其啟發，在進行組織工程神經移植的同時，可以尋找 1 根血管固定于組織工程神經周圍，形成帶血管蒂的組織工程周圍神經，這樣可以維持移植物穩定，并且有持續的血液供應，實現組織工程周圍神經早期血管化，最終達到促進周圍神經再生及軸突生長的目的。
正常情況下，周圍神經與血管存在伴行且距離較近的關系，將血管束植入移植神經符合上述供血關系。1994 年，Cavadas 等[34]進行了植入血管束預制血管化周圍神經的研究。此外，有研究表明，大網膜脂肪細胞能夠合成 VEGF，大網膜微血管內皮細胞能夠合成 bFGF[35]，VEGF 及 bFGF 具有促血管生成的作用。有學者將帶蒂的大網膜移位包裹人工神經移植物修復周圍神經缺損，術后 3 d 即出現了血管化，修復效果明顯好于單純人工神經移植[36]。
以上方法通過增加移植神經血供，達到了促進人工神經移植物血管化的目的，取得了較好療效。但上述方法存在一個共同問題，即在損傷神經周圍不一定存在適合吻合、轉移且穩定的血管，并且對顯微外科技術要求較高，限制了臨床應用。
5 促血管因子
多種細胞因子及生長因子能夠促進 EPCs 或 ECs 增殖，促進新生血管生成，進而促進組織血管化。VEGF、bFGF、PDGF 等均具有間接或直接促血管生成的作用，其中以 VEGF 應用最為廣泛。
VEGF 是目前已知最強的血管生成誘導劑，它可以特異性地作用于內皮細胞，促進內皮細胞增殖和血管形成，促進內皮祖細胞分化為 ECs。有學者將 VEGF 用于神經組織工程研究中，將攜帶 VEGF165 基因的質粒或病毒載體植入組織內，但該方法不能在局部緩釋而起到有效的誘導血管生成作用[37]。VEGF 的使用可促進血管生成，但因半衰期短，局部直接應用效果欠佳。采用合適的基因轉染技術將 VEGF 基因轉染到細胞中，使細胞持續表達具有生物活性的生長因子[38]，可以促進新生血管形成，加速神經修復與重建。
6 展望
目前，組織工程周圍神經血管化方面的研究，主要集中于利用各種生長因子、成血管細胞、支架材料表面修飾、基因轉染生長因子技術、血管植入等技術來促進神經移植物血管形成。但每種方法均有一定局限性，都不能完美解決組織工程周圍神經血管化的問題。VEGF165 基因與 EPCs 聯合應用能夠達到事半功倍的效果。因此，我們認為，采用轉染技術將 VEGF165 基因轉染 EPCs，并與 ADSCs 誘導后的類雪旺細胞共同作為神經組織工程種子細胞，能夠促進組織工程周圍神經早期血管化，進而提高動物體內神經移植修復效果。
作者貢獻：趙斌負責科研實施及文章撰寫，馬劍雄負責文獻檢索，馬信龍負責科研設計及指導。
利益沖突：所有作者聲明，在本課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突，經費支持沒有影響文章觀點。
臨床上，由于創傷、腫瘤等原因造成的周圍神經缺損非常多見，周圍神經損傷已成為全球所面臨的健康問題之一[1]。目前，臨床修復周圍神經缺損的主要方法是自體神經移植，但存在自體神經來源有限、供區神經功能喪失及神經直徑難以匹配等問題。同種異體神經或異種神經是理想的神經來源，但因存在嚴重免疫排斥反應常導致治療失敗[2]。因此需要進一步研究理想的永久性修復材料。
近年來，隨著材料科學、細胞生物學的進步，采用組織工程技術構建組織工程周圍神經，為神經損傷的修復帶來了新希望。但構建的組織工程周圍神經修復大段周圍神經缺損還存在諸多問題，尤其是組織工程周圍神經的血管化問題成為限制其發揮生物學效能的一個“瓶頸”[3-4]。組織工程周圍神經早期血管化問題日益受到學者們的關注。組織工程周圍神經血管化的研究主要包括以下 5 個方面：周圍神經再生局部微環境及血供特點、支架材料修飾、種子細胞、自體血管束的植入、促血管因子。本文將圍繞上述 5 個方面進行文獻回顧及總結。
1 周圍神經再生局部微環境及血供特點
眾所周知，周圍神經主干結構是由神經纖維束及其周圍包括血管在內的結締組織構成[5]。神經移植后，移植段神經血管再形成大致有兩種形式：① 神經內形式，即內部叢狀血管，可持續 24 周；② 神經外形式，即外部縱行血管，出現在移植后 3～6 周內。有研究表明[6]，不帶血管的神經移植后 3 d 內為缺血狀態，1 周左右開始出現血流急劇增加；而帶血管的神經移植后早期雖有血流增加，但基本處于平穩狀態，這對于維持周圍神經微環境的穩定具有一定意義。局部微環境及神經再生所需要的各種營養物質對周圍神經的修復再生非常重要，而這些都與局部血供有重要關系[7]。神經移植物早期血管化，可以為移植的各種細胞提供足夠營養，進而促進軸突生長、神經再生；另一方面，可以減少體內膠原纖維形成，便于新生軸突通過。另外，神經移植物早期的血管化還可以聚集來源于血液中的巨噬細胞[8]，以利于快速清除周圍神經損傷后軸突、髓鞘的各種潰變產物，從而為新生軸突向遠端生長提供良好的通道[9]。
近年來，隨著組織工程學迅速發展，應用組織工程周圍神經修復神經缺損已成為研究趨勢[10]。對于大段神經缺損，血管化不足是制約其修復成功的關鍵因素。組織工程周圍神經不能早期血管化，不能早期在體內建立血液循環，制約了其進一步向臨床應用[11]。有研究表明，細胞在血管周圍 150～200 μm 內才能夠通過彌散作用來維持存活，否則移植體內部的細胞將難以通過滲透作用獲得養分及營養的支持[12]。因此，移植物早期血管化對組織工程周圍神經在體內存活起重要作用。
2 支架材料修飾
組織工程周圍神經血管化的最終目的是在移植物周圍形成功能化的血管網[13]，這就要求組織工程神經的支架材料與成血管相關細胞具有良好的組織相容性，以便血管長入。對支架材料的修飾，包括外部多孔狀結構的構建及內部支架的建立。適宜的外部及內部結構可以支持種子細胞黏附、促進種子細胞分化、生長及軸突再生，防止結締組織長入。有研究報道[14]，適宜細胞生長的三維支架材料孔徑應介于 50～400 μm。Chiu 等[15]研究了不同孔徑聚乙二醇多孔支架對移植物血管化的影響，結果表明大孔徑支架比小孔徑支架更有利于血管長入，且孔徑越大血管化程度越高。Bai 等[16]研究了不同孔徑對多孔生物陶瓷材料血管化的影響，結果表明隨著孔徑尺寸的增加，長入的血管逐漸增多。Sun 等[17]利用高分子聚合材料構建了一種三維支架，研究表明該支架有利于血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）長入及增殖，具有潛在促血管生成的能力。
另外，在支架材料表面可以添加一些促進成血管細胞增殖、黏附的物質，如層粘連蛋白、纖維結合素及膠原纖維等。Kemp 等[18]認識到血管化對神經修復的重要性，采用膠原來源神經導管修復周圍神經缺損，促進了軸突生長、雪旺細胞增殖及移植物早期血管化。蔣良福等[19]采用 VEGF 納米微囊對去細胞神經支架進行修飾，促進組織工程神經預血管化。在材料表面修飾方面，通過在組織工程神經內植入緩釋生長因子，可以誘導成血管相關的細胞向支架材料內部遷移、增殖，進而形成毛細血管網。
肝素用于生物材料修飾已有 50 余年，最初研究者們試圖通過離子交互作用將肝素錨定在生物材料表面，減輕材料致凝性并獲得成功[20]。隨著對生物材料研究的深入，為了增加材料的生物相容性以及對細胞的黏附性等生物特性，藥物緩釋系統成為研究熱點，而肝素具備與多種蛋白結合的能力，基于肝素的藥物緩釋系統被證明可以裝載各種生物效應迥異的生長因子[21]。本課題組利用肝素作為緩釋載體，制備了能夠緩釋 VEGF 的組織工程周圍神經，促進了組織工程周圍神經形成血管的能力，實現了組織工程周圍神經的血管化[22]。
3 種子細胞
ECs 是血管形成、再生中的主要細胞[23]。劉春曉等[24]在體外成功建立了人臍靜脈內皮細胞與 BMSCs 共培養體系。高宏陽等[9]將胎兔 ECs 與雪旺細胞共培養后，植入脫細胞神經支架中修復兔坐骨神經缺損，結果優于單純植入雪旺細胞的脫細胞神經支架。
但 ECs 為終末細胞，增殖速度緩慢[25]，短時間內促進血管新生的能力較弱，故應用 ECs 來促進周圍神經修復過程中血供的重建及血管的再生較難實現。而血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為 ECs 的前體細胞，是出生后機體血管形成最主要的干/祖細胞類型[26]。EPCs 不僅參與了胚胎發育過程中的血管形成，也參與了出生后的血管形成[27]。EPCs 可有效地促進周圍神經缺損區域的血管再生，并能明顯增強周圍神經修復和再生能力[28]。在很多種缺血性疾病動物實驗中，外源性注入 EPCs 能明顯改善損傷組織局部血流供應，增強缺血組織局部的新生血管生成，進而促進組織修復[29]。當機體發生創傷、缺血等病理變化時，存在于循環血液中的 EPCs 能夠遷移并定植在損傷缺血部位，分泌促血管生成因子，促進側支血管生長至缺血組織，參與組織血管新生，促進組織修復[30]。EPCs 能夠促進骨修復過程中的血管形成，將 MSCs 與 EPCs 共同作為種子細胞，能夠加快骨缺損的修復[31]。Zigdon-Giladi 等[32]采用人外周血來源內皮祖細胞修復鼠顱骨缺損，促進血管形成及骨形成。對于周圍神經而言，傷后 1 周左右是周圍神經缺損修復重建過程中血管生成的關鍵時期，如果錯過了這個時期，新生血管的生成效率和速度會明顯降低，進而影響神經修復重建的速度。所以對于組織工程周圍神經而言，早期血管化至關重要。
因此，本課題組認為將具有血管形成能力的內皮祖細胞與神經細胞或干細胞聯合應用，是血管化組織工程周圍神經最有前景的方法之一。
4 自體血管束的植入
臨床上，隨著顯微外科技術的發展，有學者采用帶血管的神經移植物修復大段神經缺損，取得了較好臨床效果。早在 1976 年，Taylor 等[33]為了改善神經移植物的血供，提出吻合血管的神經移植，采用攜帶橈動脈及橈靜脈的橈神經淺支成功修復了正中神經缺損。受其啟發，在進行組織工程神經移植的同時，可以尋找 1 根血管固定于組織工程神經周圍，形成帶血管蒂的組織工程周圍神經，這樣可以維持移植物穩定，并且有持續的血液供應，實現組織工程周圍神經早期血管化，最終達到促進周圍神經再生及軸突生長的目的。
正常情況下，周圍神經與血管存在伴行且距離較近的關系，將血管束植入移植神經符合上述供血關系。1994 年，Cavadas 等[34]進行了植入血管束預制血管化周圍神經的研究。此外，有研究表明，大網膜脂肪細胞能夠合成 VEGF，大網膜微血管內皮細胞能夠合成 bFGF[35]，VEGF 及 bFGF 具有促血管生成的作用。有學者將帶蒂的大網膜移位包裹人工神經移植物修復周圍神經缺損，術后 3 d 即出現了血管化，修復效果明顯好于單純人工神經移植[36]。
以上方法通過增加移植神經血供，達到了促進人工神經移植物血管化的目的，取得了較好療效。但上述方法存在一個共同問題，即在損傷神經周圍不一定存在適合吻合、轉移且穩定的血管，并且對顯微外科技術要求較高，限制了臨床應用。
5 促血管因子
多種細胞因子及生長因子能夠促進 EPCs 或 ECs 增殖，促進新生血管生成，進而促進組織血管化。VEGF、bFGF、PDGF 等均具有間接或直接促血管生成的作用，其中以 VEGF 應用最為廣泛。
VEGF 是目前已知最強的血管生成誘導劑，它可以特異性地作用于內皮細胞，促進內皮細胞增殖和血管形成，促進內皮祖細胞分化為 ECs。有學者將 VEGF 用于神經組織工程研究中，將攜帶 VEGF165 基因的質粒或病毒載體植入組織內，但該方法不能在局部緩釋而起到有效的誘導血管生成作用[37]。VEGF 的使用可促進血管生成，但因半衰期短，局部直接應用效果欠佳。采用合適的基因轉染技術將 VEGF 基因轉染到細胞中，使細胞持續表達具有生物活性的生長因子[38]，可以促進新生血管形成，加速神經修復與重建。
6 展望
目前，組織工程周圍神經血管化方面的研究，主要集中于利用各種生長因子、成血管細胞、支架材料表面修飾、基因轉染生長因子技術、血管植入等技術來促進神經移植物血管形成。但每種方法均有一定局限性，都不能完美解決組織工程周圍神經血管化的問題。VEGF165 基因與 EPCs 聯合應用能夠達到事半功倍的效果。因此，我們認為，采用轉染技術將 VEGF165 基因轉染 EPCs，并與 ADSCs 誘導后的類雪旺細胞共同作為神經組織工程種子細胞，能夠促進組織工程周圍神經早期血管化，進而提高動物體內神經移植修復效果。
作者貢獻：趙斌負責科研實施及文章撰寫，馬劍雄負責文獻檢索，馬信龍負責科研設計及指導。
利益沖突：所有作者聲明，在本課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突，經費支持沒有影響文章觀點。