引用本文： 張彬, 沈師, 鮮海, 代永靜, 郭維民, 李旭, 張學亮, 王振勇, 李浩江, 彭禮慶, 羅旭江, 劉舒云, 魯曉波, 郭全義. 3D 打印制備 PLGA/脫細胞軟骨細胞外基質支架材料及其理化特性研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(8): 1011-1018. doi: 10.7507/1002-1892.201901082 復制
關節軟骨由于無血液供應、神經支配和淋巴循環的特殊結構，導致其損傷后難以自我修復[1]。關節軟骨損傷隨著時間發展逐漸累及軟骨下骨，最終導致骨關節炎的發生[2]。臨床治療關節軟骨缺損的方法包括微骨折術、自體移植或同種異體移植等，但均不能完全滿足臨床以及患者預后的運動要求[3-6]。與傳統治療方法相比，組織工程再生醫學為軟骨損傷提供了一種非常有前景的替代治療方法[7]。支架、細胞因子和種子細胞是組織工程再生醫學 3 個關鍵要素[8]。恰當合理地選擇支架材料，對軟骨組織工程尤為重要。大量研究表明，脫細胞軟骨細胞外基質（decellularized articular cartilage extracellular matrix，DACECM）是用于軟骨再生的優良生物材料之一[9-11]，然而 DACECM 作為支架缺乏足夠的力學性能。人工合成聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］具有良好的生物力學性能和可控的生物降解速率[12-13]，但疏水性和內在生物活性的缺乏限制了其應用。
軟骨組織工程支架傳統的制備工藝普遍存在支架形狀局限、孔徑大小難以控制、力學強度不足等缺點。3D 打印技術可以克服傳統支架制造方法在形態和工藝一致性方面的限制，實現高精密度支架的制備[14-16]。此外，低溫沉積 3D 打印技術可在不破壞 PLGA 材料微觀結構的條件下，實現 PLGA 溶液的快速成型[17-18]。
本研究采用低溫沉積 3D 打印技術制備 PLGA 支架，進而將 DACECM 灌注于 3D 打印 PLGA 支架中，通過冷凍干燥、物理化學交聯制備具有軟骨仿生性結構的 PLGA/DACECM 取向支架，以期獲得既具有良好力學性能，又有利于軟骨細胞黏附、增殖及細胞表型維持的組織工程軟骨支架材料。同時，對支架理化特性進行檢測，為下一步動物體內實驗奠定研究基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
市售健康新鮮家豬膝關節。健康 1 月齡 SD 大鼠 12 只，體質量約 200 g；健康 1 月齡新西蘭大白兔 3 只，體質量 0.5～0.6 kg；均購自解放軍總醫院實驗動物中心。鼠 L-929 成纖維細胞（上海斯信生科科技有限公司）。
PLGA（聚乳酸∶聚羥基乙酸=75∶25，相對分子質量 10.2 萬；山東濟南岱罡生物科技有限公司）；1，4-二氧六環（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膠原酶、胰蛋白酶粉劑、DNase 粉劑、RNase 粉劑（Sigma 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基（Corning 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；Triton X-100（J.T.Baker 公司，美國）。
3D 生物打印機、3D-Bioplotter 軟件（青島尤尼科技有限公司）；計算機輔助設計軟件 UG（Siemens 公司，德國）；九陽家用粉碎機（山東九陽股份有限公司）；Beckman J-25 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；FD-1 冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Bio-link 紫外交聯儀（北京博威興業科技發展有限公司）；BOSE 5100 生物力學試驗機（BOSE 公司，美國）；CO2 培養箱（Heraeus 公司，德國）；BCPCAS-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；BH-2 生物顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 各支架制備方法
1.2.1 PLGA 支架
根據預實驗結果，準確稱取 PLGA 4.0 g，加入 10 mL 1，4-二氧六環溶液中，磁力攪拌至 PLGA 完全溶解，制備 40%PLGA 溶液。通過體外組織學、生物力學等多角度綜合分析研究軟骨不同層次參數，將所得參數通過計算機輔助設計軟件設計所需要形狀，利用 3D-Bioplotter 軟件調用上述數據文件，設定支架層-層之間的排列角度和孔徑大小，打印出仿生軟骨微結構的 PLGA 軟骨組織工程仿生支架。
3D 打印參數：平臺成型溫度?20℃，打印層厚 0.1 mm，打印速度 10 mm/s。具體步驟：① 使用 3D 打印機將 PLGA 溶液按照設定的打印參數進行打印，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h 得到 PLGA 支架初步成型結構。② 將 PLGA 支架經 10%NaOH 溶液浸泡 2 h，PBS 反復清洗至 pH7.0，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h。③ 將支架置于紫外交聯儀中，調節波長至 258 nm 交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 20 mmol/L NHS 無水乙醇溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。④ 支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.2.2 DACECM 取向支架
采用改良式物理、化學脫細胞方法制備 DACECM 漿料[19-20]。具體操作如下：常規消毒豬膝關節，在無菌條件下打開膝關節，切取透明軟骨組織，并將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 的薄片，置入無菌容器內，加入過氧化氫漂洗 3 次（5 min/次），然后用無菌 PBS 溶液反復漂洗 3 次（5 min/次）。在無菌攪拌機中加入適量無菌去離子水，置入漂洗后的軟骨薄片反復進行濕法粉碎，最終形成軟骨勻漿。使用無菌去離子水充分稀釋軟骨勻漿后進行差速離心（離心半徑 13 cm）：低轉速 1 500 r/min 離心 5 min，分離沉淀，保留上清液；取上清液分別以 2 000 r/min 離心 15 min，6 000 r/min 離心 20 min，取上清液，保留沉淀；取上清液以 10 000 r/min 離心 30 min，收集沉淀。在最終所得沉淀中先后加入 3%Triton X-100 和 0.25% 胰蛋白酶，充分攪拌，4℃ 條件下進行脫細胞處理各 12 h，然后用無菌 PBS 反復清洗；再于 37℃ 條件下分別加入 1 U/mL RNase 與 50 U/mL DNase，攪拌均勻以去除核物質；處理完成后再次用無菌去離子水與 PBS 液反復清洗，最后以離心半徑 13 cm、10 000 r/min 離心 30 min，所得沉淀即為 DACECM。使用無菌去離子水將 DACECM 配制為 3%（M/V）混懸液，于 4℃ 無菌條件下保存備用。
將 DACECM 混懸液置入特定模具中，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h。將支架置于紫外交聯儀中，調節波長至 258 nm 交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 20 mmol/L NHS 無水乙醇溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.2.3 PLGA/DACECM 取向支架
將 3D 打印 PLGA 支架經 10%NaOH 溶液浸泡 2 h，PBS 反復清洗至 pH7.0；將 3%DACECM 混懸液均勻灌注于 3D 打印的 PLGA 支架內，4℃ 下過夜，?20℃ 預凍 2 h，轉移至冷凍干燥機中升華干燥 24 h。取出支架在距離光源 5 cm、波長 258 nm 處紫外線交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 14 mmol/L NHS 水溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 支架大體及微觀結構觀察
取 3 種支架觀察大體結構；清洗、固定、梯度乙醇脫水等處理后，室溫干燥，樣品噴金后掃描電鏡觀察微觀結構。
1.3.2 DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學定性分析
取 DACECM 取向支架，包埋后行冰凍切片（8 μm 厚），無水乙醇室溫下固定 30 min，室溫干燥后的切片分別行 HE 染色、甲苯胺藍染色、番紅 O 染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。
1.3.3 支架生物力學檢測
將凍干后的 3 種支架樣本裁剪為 5 mm×10 mm×10 mm 大小，室溫下浸泡于 PBS 緩沖液中至完全浸潤后取出，使用 BOSE 5100 生物力學試驗機進行力學檢測。預壓縮 5%，以恒定的壓縮速率（5 mm/min）進行壓縮，當應變達到 20% 時停止檢測，獲得應力-應變曲線，計算壓縮模量。
1.3.4 支架的免疫排斥分析
取 SD 大鼠 12 只，隨機分為 3 組，每組 4 只，分別為 PLGA 組、DACECM 組和 PLGA/DACECM 組。大鼠以腹腔注射 0.3% 戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉后，常規背部備皮。于背部取長約 0.5 cm 切口，切開皮膚，游離皮下組織，將制備的統一規格（5 mm×5 mm×1 mm）無菌 PLGA 支架、DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架，分別按照組別植入大鼠皮下。術后 2、4、8 周過量麻醉處死大鼠取材，常規行 HE 染色，觀察炎性細胞浸潤情況。
1.3.5 支架細胞毒性的體外評估
① 兔軟骨細胞的分離和培養：取 1 月齡新西蘭大白兔，氯胺酮與速眠新Ⅱ號按照 1∶1（V/V）比例混合后，肌肉注射（0.5 mL/kg）麻醉。無菌條件下，分離培養軟骨細胞并傳代培養[21]。取凍干后 3 種支架，裁剪為 3.5 mm×3.5 mm×1.5 mm 大小，60Co消毒后轉移至無菌 24 孔板中備用。取第 2 代兔軟骨細胞制備濃度為 1×106個/mL 的細胞懸液，吸取 100 μL 細胞懸液分別接種于 3 種支架上。置入 37℃、5%CO2 培養箱中孵育 4 h，加入 DMEM 培養液，培養 3 d 后取出細胞-支架復合物，以 2.5% 戊二醛 4℃ 恒溫下固定 24 h。支架經清洗、固定、梯度乙醇脫水等處理后，室溫干燥，樣品噴金，掃描電鏡觀察細胞-支架復合物中細胞黏附及生長情況。
② 支架 CCK-8 細胞毒性檢測：按照 ISO 10993-12（2009）標準，將凍干后的 3 種支架按照 3 cm2/mL 加入 DMEM 培養液中，37℃ 下溫育 3 d。收集浸提液，于浸提液中加入 FBS 至濃度為 10%（V/V）、雙抗（青霉素-鏈霉素）至濃度為 1%（V/V），得到 3 種支架的浸提液培養基。在 96 孔板中每孔接種 3×103個鼠 L-929 成纖維細胞，每組設置 3 孔樣本，分別加入 3 種支架的浸提液培養基各 100 μL；對照組用正常 DMEM 培養基培養細胞。于 37℃、5%CO2 培養箱內培養 1、3、5 d 后，分別加入 10 μL CCK-8 試劑，孵育 2 h 后用酶標儀測量 450 nm 波長處的吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架形態及微觀結構觀察
大體觀察示，3 種支架均呈圓形結構，DACECM 均勻附著于 PLGA 支架孔隙中。見圖 1。掃描電鏡觀察示，PLGA 支架表面較光滑，可見大孔；DACECM 取向支架表面粗糙，為疏松多孔相互連通的三維立體結構；PLGA/DACECM 取向支架表面粗糙，大孔與小孔相互連通，具有垂直三維立體結構。見圖 2。
圖1
3 種支架大體觀察
1：PLGA 支架 2：PLGA/DACECM 取向支架 3：DACECM 取向支架
Figure1. General observation of three scaffolds1: PLGA scaffold; 2: PLGA/DACECM oriented scaffold; 3: DACECM oriented scaffold
圖2
3 種支架掃描電鏡觀察（×50）
a. PLGA 支架；b. DACECM 取向支架；c. PLGA/DACECM 取向支架
Figure2. Scanning electron microscope observation of three scaffolds (×50)a. PLGA scaffold; b. DACECM oriented scaffold; c. PLGA/DACECM oriented scaffold
2.2 DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學定性分析
HE 染色未見細胞核物質；甲苯胺藍和番紅 O 染色陽性，提示 DACECM 中含有糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）成分；免疫組織化學染色示 DACECM 中有Ⅱ型膠原蛋白。見圖 3。
圖3
DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學染色觀察（×200）
a. HE 染色；b. 甲苯胺藍染色；c. 番紅 O 染色；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure3. Histological and immunohistochemical staining observations of DACECM oriented scaffold (×200)a. HE staining; b. Toluidine blue staining; c. Safranin O staining; d. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ
2.3 支架生物力學檢測
PLGA 支架、DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架的壓縮模量分別為（4.34±0.82）、（0.11±0.04）和（3.39±0.85）MPa，DACECM 取向支架壓縮模量顯著低于其余 2 種支架，差異有統計學意義（P<0.05）；PLGA 支架和 PLGA/DACECM 取向支架間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 支架的免疫排斥分析
HE 染色示，術后 2、4 周 3 組支架炎性細胞浸潤情況均較嚴重，浸潤程度由輕到重依次為 DACECM 組、PLGA/DACECM 組、PLGA 組。隨著時間延長，各組炎性細胞浸潤情況均明顯減輕，8 周時 3 組支架周圍均未見明顯炎性反應。見圖 4。
圖4
3 組支架大鼠皮下包埋各時間點 HE 染色觀察（×200）
從左至右依次為 PLGA 組、DACECM 組和 PLGA/DACECM 組 a.2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure4. HE staining at different time points of subcutaneous embedding in three groups of rats (×200)From left to right for PLGA group, DACECM group, and PLGA/DACECM group, respectively a. Two weeks; b. Four weeks; c. Eight weeks
2.5 支架細胞毒性的體外評估
細胞-支架復合物掃描電鏡觀察示，軟骨細胞在 PLGA 支架上未見明顯黏附；大量軟骨細胞在 PLGA/DACECM 取向支架和 DACECM 取向支架表面黏附、生長，兩種支架軟骨細胞的黏附、生長無明顯區別。見圖 5。
圖5
3 種細胞-支架復合物掃描電鏡觀察
從左至右依次為 PLGA 支架-細胞復合物、DACECM 取向支架-細胞復合物、PLGA/DACECM 取向支架-細胞復合物 a. ×150；b. ×300
Figure5. Scanning electron microscope observation of three cell-scaffold complexesFrom left to right for PLGA scaffold-cell complex, DACECM scaffold-cell complex, and PLGA/DACECM scaffold-cell complex a. ×150; b. ×300
CCK-8 檢測示，3 種支架浸提液培養的細胞以及對照組細胞隨培養時間延長，細胞數量呈遞增趨勢。各時間點各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測各組細胞毒性
Figure6.
Detection of cytotoxicity in each group by CCK-8 method
3 討論
組織工程軟骨支架不僅必須為組織再生提供合適的微環境，還必須具有生物力學性能以抵抗正常的應力。支架的細胞親和性對于組織再生很重要，本研究掃描電鏡觀察和 CCK-8 檢測結果表明，DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架比 PLGA 支架更有利于細胞黏附和增殖。這可能與 PLGA 的疏水性能有關，DACECM 與 PLGA 結合后，復合支架親水性明顯增加。此外，復合支架多孔隙且表面粗糙的結構可顯著促進細胞的增殖、分化、黏附[22-23]。支架的免疫排斥實驗說明 3 種支架均具有較低的免疫原性。研究表明力學強度差的支架材料很難承載軟骨活動的壓縮應力，高力學強度的支架不僅起到暫時力學支撐替代作用，而且適當的應力刺激還能促進細胞的增殖、分化以及與周圍正常軟骨區域的整合[24-28]。本研究生物力學檢測示，PLGA 支架壓縮模量與 PLGA/DACECM 取向支架比較差異無統計學意義，均顯著高于 DACECM 取向支架。
本研究顯示，DACECM 保留了關節軟骨細胞外基質中的主要成分 GAGs 和Ⅱ型膠原。其良好的生物學特性可有效地誘導與維持關節腔內 MSCs 成軟骨分化[10, 29-33]。PLGA/DACECM 取向支架一方面可以利用 PLGA 提供力學支撐，而且其降解緩慢，可長期存在于膝關節內，為新生組織的成熟提供一個時間窗口[12]；另一方面，DACECM 具有良好的生物相容性，可以使支架具有更好的軟骨誘導性特點；此外，仿生的軟骨環境條件及垂直取向結構又可以進一步誘導軟骨功能蛋白的累積和天然結構的再生，使其發揮正常的軟骨功能[21]。PLGA/DACECM 取向支架可以充分利用兩種材料的優勢，達到優勢互補。所以我們認為，PLGA/DACECM 取向支架比單純 PLGA 支架和 DACECM 取向支架更適合軟骨的再生修復。
綜上述，本研究采用低溫沉積 3D 打印技術和改良式物理、化學脫細胞法、冷凍干燥、物理化學法交聯技術等，立足于滿足軟骨再生修復不同階段（誘導分化階段、成熟階段）的關鍵要素，成功構建了新型組織工程軟骨仿生支架。在誘導分化階段利用軟骨細胞外基質誘導干細胞向軟骨方向分化；成熟階段利用 3D 打印 PLGA 取向支架，為新生軟骨成熟提供良好的力學條件及仿生微結構。PLGA/DACECM 取向支架具有良好的生物學與力學特性，有作為軟骨缺損修復替代材料的潛力。但 PLGA/DACECM 取向支架在募集內源性干細胞功能方面有所欠缺。針對組織工程軟骨支架研究現狀，通過整合傳統與新型組織工程支架制備工藝，構建既能募集內源性干細胞，又能仿生軟骨天然微環境及微結構，且有利于新生組織成熟的組織工程軟骨支架，轉變傳統的首先經過體外構建細胞支架復合體、再植入體內進行軟骨修復的模式，將是組織工程軟骨修復研究新方向。
作者貢獻：張彬參與實驗設計，數據收集、整理、分析，撰寫文章；沈師、鮮海參與實驗設計，動物實驗，收集實驗原始數據；代永靜、劉舒云、魯曉波參與指導實驗設計，文章撰寫及修改；郭維民參與指導實驗設計，統計分析，文章撰寫及修改；李旭參與實驗設計，動物實驗，英文翻譯；張學亮、王振勇、李浩江參與實驗設計，原材料的收集及制備；彭禮慶、羅旭江參與實驗設計，原材料的收集及制備，實驗細胞的培養；郭全義指導實驗設計、統籌實驗進度、文章撰寫及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍總醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物使用許可證批準號：SYXK（軍）2015-0003。
關節軟骨由于無血液供應、神經支配和淋巴循環的特殊結構，導致其損傷后難以自我修復[1]。關節軟骨損傷隨著時間發展逐漸累及軟骨下骨，最終導致骨關節炎的發生[2]。臨床治療關節軟骨缺損的方法包括微骨折術、自體移植或同種異體移植等，但均不能完全滿足臨床以及患者預后的運動要求[3-6]。與傳統治療方法相比，組織工程再生醫學為軟骨損傷提供了一種非常有前景的替代治療方法[7]。支架、細胞因子和種子細胞是組織工程再生醫學 3 個關鍵要素[8]。恰當合理地選擇支架材料，對軟骨組織工程尤為重要。大量研究表明，脫細胞軟骨細胞外基質（decellularized articular cartilage extracellular matrix，DACECM）是用于軟骨再生的優良生物材料之一[9-11]，然而 DACECM 作為支架缺乏足夠的力學性能。人工合成聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］具有良好的生物力學性能和可控的生物降解速率[12-13]，但疏水性和內在生物活性的缺乏限制了其應用。
軟骨組織工程支架傳統的制備工藝普遍存在支架形狀局限、孔徑大小難以控制、力學強度不足等缺點。3D 打印技術可以克服傳統支架制造方法在形態和工藝一致性方面的限制，實現高精密度支架的制備[14-16]。此外，低溫沉積 3D 打印技術可在不破壞 PLGA 材料微觀結構的條件下，實現 PLGA 溶液的快速成型[17-18]。
本研究采用低溫沉積 3D 打印技術制備 PLGA 支架，進而將 DACECM 灌注于 3D 打印 PLGA 支架中，通過冷凍干燥、物理化學交聯制備具有軟骨仿生性結構的 PLGA/DACECM 取向支架，以期獲得既具有良好力學性能，又有利于軟骨細胞黏附、增殖及細胞表型維持的組織工程軟骨支架材料。同時，對支架理化特性進行檢測，為下一步動物體內實驗奠定研究基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
市售健康新鮮家豬膝關節。健康 1 月齡 SD 大鼠 12 只，體質量約 200 g；健康 1 月齡新西蘭大白兔 3 只，體質量 0.5～0.6 kg；均購自解放軍總醫院實驗動物中心。鼠 L-929 成纖維細胞（上海斯信生科科技有限公司）。
PLGA（聚乳酸∶聚羥基乙酸=75∶25，相對分子質量 10.2 萬；山東濟南岱罡生物科技有限公司）；1，4-二氧六環（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膠原酶、胰蛋白酶粉劑、DNase 粉劑、RNase 粉劑（Sigma 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基（Corning 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；Triton X-100（J.T.Baker 公司，美國）。
3D 生物打印機、3D-Bioplotter 軟件（青島尤尼科技有限公司）；計算機輔助設計軟件 UG（Siemens 公司，德國）；九陽家用粉碎機（山東九陽股份有限公司）；Beckman J-25 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；FD-1 冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Bio-link 紫外交聯儀（北京博威興業科技發展有限公司）；BOSE 5100 生物力學試驗機（BOSE 公司，美國）；CO2 培養箱（Heraeus 公司，德國）；BCPCAS-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；BH-2 生物顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 各支架制備方法
1.2.1 PLGA 支架
根據預實驗結果，準確稱取 PLGA 4.0 g，加入 10 mL 1，4-二氧六環溶液中，磁力攪拌至 PLGA 完全溶解，制備 40%PLGA 溶液。通過體外組織學、生物力學等多角度綜合分析研究軟骨不同層次參數，將所得參數通過計算機輔助設計軟件設計所需要形狀，利用 3D-Bioplotter 軟件調用上述數據文件，設定支架層-層之間的排列角度和孔徑大小，打印出仿生軟骨微結構的 PLGA 軟骨組織工程仿生支架。
3D 打印參數：平臺成型溫度?20℃，打印層厚 0.1 mm，打印速度 10 mm/s。具體步驟：① 使用 3D 打印機將 PLGA 溶液按照設定的打印參數進行打印，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h 得到 PLGA 支架初步成型結構。② 將 PLGA 支架經 10%NaOH 溶液浸泡 2 h，PBS 反復清洗至 pH7.0，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h。③ 將支架置于紫外交聯儀中，調節波長至 258 nm 交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 20 mmol/L NHS 無水乙醇溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。④ 支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.2.2 DACECM 取向支架
采用改良式物理、化學脫細胞方法制備 DACECM 漿料[19-20]。具體操作如下：常規消毒豬膝關節，在無菌條件下打開膝關節，切取透明軟骨組織，并將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 的薄片，置入無菌容器內，加入過氧化氫漂洗 3 次（5 min/次），然后用無菌 PBS 溶液反復漂洗 3 次（5 min/次）。在無菌攪拌機中加入適量無菌去離子水，置入漂洗后的軟骨薄片反復進行濕法粉碎，最終形成軟骨勻漿。使用無菌去離子水充分稀釋軟骨勻漿后進行差速離心（離心半徑 13 cm）：低轉速 1 500 r/min 離心 5 min，分離沉淀，保留上清液；取上清液分別以 2 000 r/min 離心 15 min，6 000 r/min 離心 20 min，取上清液，保留沉淀；取上清液以 10 000 r/min 離心 30 min，收集沉淀。在最終所得沉淀中先后加入 3%Triton X-100 和 0.25% 胰蛋白酶，充分攪拌，4℃ 條件下進行脫細胞處理各 12 h，然后用無菌 PBS 反復清洗；再于 37℃ 條件下分別加入 1 U/mL RNase 與 50 U/mL DNase，攪拌均勻以去除核物質；處理完成后再次用無菌去離子水與 PBS 液反復清洗，最后以離心半徑 13 cm、10 000 r/min 離心 30 min，所得沉淀即為 DACECM。使用無菌去離子水將 DACECM 配制為 3%（M/V）混懸液，于 4℃ 無菌條件下保存備用。
將 DACECM 混懸液置入特定模具中，?20℃ 預凍 2 h，置于冷凍干燥機中干燥升華 24 h。將支架置于紫外交聯儀中，調節波長至 258 nm 交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 20 mmol/L NHS 無水乙醇溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.2.3 PLGA/DACECM 取向支架
將 3D 打印 PLGA 支架經 10%NaOH 溶液浸泡 2 h，PBS 反復清洗至 pH7.0；將 3%DACECM 混懸液均勻灌注于 3D 打印的 PLGA 支架內，4℃ 下過夜，?20℃ 預凍 2 h，轉移至冷凍干燥機中升華干燥 24 h。取出支架在距離光源 5 cm、波長 258 nm 處紫外線交聯 4 h。用 50 mmol/L EDAC 與 14 mmol/L NHS 水溶液 4℃ 下交聯 24 h 后，無菌 PBS、三蒸水反復漂洗。支架再次冷凍干燥后密封，60Co消毒，4℃ 下保存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 支架大體及微觀結構觀察
取 3 種支架觀察大體結構；清洗、固定、梯度乙醇脫水等處理后，室溫干燥，樣品噴金后掃描電鏡觀察微觀結構。
1.3.2 DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學定性分析
取 DACECM 取向支架，包埋后行冰凍切片（8 μm 厚），無水乙醇室溫下固定 30 min，室溫干燥后的切片分別行 HE 染色、甲苯胺藍染色、番紅 O 染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。
1.3.3 支架生物力學檢測
將凍干后的 3 種支架樣本裁剪為 5 mm×10 mm×10 mm 大小，室溫下浸泡于 PBS 緩沖液中至完全浸潤后取出，使用 BOSE 5100 生物力學試驗機進行力學檢測。預壓縮 5%，以恒定的壓縮速率（5 mm/min）進行壓縮，當應變達到 20% 時停止檢測，獲得應力-應變曲線，計算壓縮模量。
1.3.4 支架的免疫排斥分析
取 SD 大鼠 12 只，隨機分為 3 組，每組 4 只，分別為 PLGA 組、DACECM 組和 PLGA/DACECM 組。大鼠以腹腔注射 0.3% 戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉后，常規背部備皮。于背部取長約 0.5 cm 切口，切開皮膚，游離皮下組織，將制備的統一規格（5 mm×5 mm×1 mm）無菌 PLGA 支架、DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架，分別按照組別植入大鼠皮下。術后 2、4、8 周過量麻醉處死大鼠取材，常規行 HE 染色，觀察炎性細胞浸潤情況。
1.3.5 支架細胞毒性的體外評估
① 兔軟骨細胞的分離和培養：取 1 月齡新西蘭大白兔，氯胺酮與速眠新Ⅱ號按照 1∶1（V/V）比例混合后，肌肉注射（0.5 mL/kg）麻醉。無菌條件下，分離培養軟骨細胞并傳代培養[21]。取凍干后 3 種支架，裁剪為 3.5 mm×3.5 mm×1.5 mm 大小，60Co消毒后轉移至無菌 24 孔板中備用。取第 2 代兔軟骨細胞制備濃度為 1×106個/mL 的細胞懸液，吸取 100 μL 細胞懸液分別接種于 3 種支架上。置入 37℃、5%CO2 培養箱中孵育 4 h，加入 DMEM 培養液，培養 3 d 后取出細胞-支架復合物，以 2.5% 戊二醛 4℃ 恒溫下固定 24 h。支架經清洗、固定、梯度乙醇脫水等處理后，室溫干燥，樣品噴金，掃描電鏡觀察細胞-支架復合物中細胞黏附及生長情況。
② 支架 CCK-8 細胞毒性檢測：按照 ISO 10993-12（2009）標準，將凍干后的 3 種支架按照 3 cm2/mL 加入 DMEM 培養液中，37℃ 下溫育 3 d。收集浸提液，于浸提液中加入 FBS 至濃度為 10%（V/V）、雙抗（青霉素-鏈霉素）至濃度為 1%（V/V），得到 3 種支架的浸提液培養基。在 96 孔板中每孔接種 3×103個鼠 L-929 成纖維細胞，每組設置 3 孔樣本，分別加入 3 種支架的浸提液培養基各 100 μL；對照組用正常 DMEM 培養基培養細胞。于 37℃、5%CO2 培養箱內培養 1、3、5 d 后，分別加入 10 μL CCK-8 試劑，孵育 2 h 后用酶標儀測量 450 nm 波長處的吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架形態及微觀結構觀察
大體觀察示，3 種支架均呈圓形結構，DACECM 均勻附著于 PLGA 支架孔隙中。見圖 1。掃描電鏡觀察示，PLGA 支架表面較光滑，可見大孔；DACECM 取向支架表面粗糙，為疏松多孔相互連通的三維立體結構；PLGA/DACECM 取向支架表面粗糙，大孔與小孔相互連通，具有垂直三維立體結構。見圖 2。
圖1
3 種支架大體觀察
1：PLGA 支架 2：PLGA/DACECM 取向支架 3：DACECM 取向支架
Figure1. General observation of three scaffolds1: PLGA scaffold; 2: PLGA/DACECM oriented scaffold; 3: DACECM oriented scaffold
圖2
3 種支架掃描電鏡觀察（×50）
a. PLGA 支架；b. DACECM 取向支架；c. PLGA/DACECM 取向支架
Figure2. Scanning electron microscope observation of three scaffolds (×50)a. PLGA scaffold; b. DACECM oriented scaffold; c. PLGA/DACECM oriented scaffold
2.2 DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學定性分析
HE 染色未見細胞核物質；甲苯胺藍和番紅 O 染色陽性，提示 DACECM 中含有糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）成分；免疫組織化學染色示 DACECM 中有Ⅱ型膠原蛋白。見圖 3。
圖3
DACECM 取向支架的組織學及免疫組織化學染色觀察（×200）
a. HE 染色；b. 甲苯胺藍染色；c. 番紅 O 染色；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure3. Histological and immunohistochemical staining observations of DACECM oriented scaffold (×200)a. HE staining; b. Toluidine blue staining; c. Safranin O staining; d. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ
2.3 支架生物力學檢測
PLGA 支架、DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架的壓縮模量分別為（4.34±0.82）、（0.11±0.04）和（3.39±0.85）MPa，DACECM 取向支架壓縮模量顯著低于其余 2 種支架，差異有統計學意義（P<0.05）；PLGA 支架和 PLGA/DACECM 取向支架間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 支架的免疫排斥分析
HE 染色示，術后 2、4 周 3 組支架炎性細胞浸潤情況均較嚴重，浸潤程度由輕到重依次為 DACECM 組、PLGA/DACECM 組、PLGA 組。隨著時間延長，各組炎性細胞浸潤情況均明顯減輕，8 周時 3 組支架周圍均未見明顯炎性反應。見圖 4。
圖4
3 組支架大鼠皮下包埋各時間點 HE 染色觀察（×200）
從左至右依次為 PLGA 組、DACECM 組和 PLGA/DACECM 組 a.2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure4. HE staining at different time points of subcutaneous embedding in three groups of rats (×200)From left to right for PLGA group, DACECM group, and PLGA/DACECM group, respectively a. Two weeks; b. Four weeks; c. Eight weeks
2.5 支架細胞毒性的體外評估
細胞-支架復合物掃描電鏡觀察示，軟骨細胞在 PLGA 支架上未見明顯黏附；大量軟骨細胞在 PLGA/DACECM 取向支架和 DACECM 取向支架表面黏附、生長，兩種支架軟骨細胞的黏附、生長無明顯區別。見圖 5。
圖5
3 種細胞-支架復合物掃描電鏡觀察
從左至右依次為 PLGA 支架-細胞復合物、DACECM 取向支架-細胞復合物、PLGA/DACECM 取向支架-細胞復合物 a. ×150；b. ×300
Figure5. Scanning electron microscope observation of three cell-scaffold complexesFrom left to right for PLGA scaffold-cell complex, DACECM scaffold-cell complex, and PLGA/DACECM scaffold-cell complex a. ×150; b. ×300
CCK-8 檢測示，3 種支架浸提液培養的細胞以及對照組細胞隨培養時間延長，細胞數量呈遞增趨勢。各時間點各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測各組細胞毒性
Figure6.
Detection of cytotoxicity in each group by CCK-8 method
3 討論
組織工程軟骨支架不僅必須為組織再生提供合適的微環境，還必須具有生物力學性能以抵抗正常的應力。支架的細胞親和性對于組織再生很重要，本研究掃描電鏡觀察和 CCK-8 檢測結果表明，DACECM 取向支架和 PLGA/DACECM 取向支架比 PLGA 支架更有利于細胞黏附和增殖。這可能與 PLGA 的疏水性能有關，DACECM 與 PLGA 結合后，復合支架親水性明顯增加。此外，復合支架多孔隙且表面粗糙的結構可顯著促進細胞的增殖、分化、黏附[22-23]。支架的免疫排斥實驗說明 3 種支架均具有較低的免疫原性。研究表明力學強度差的支架材料很難承載軟骨活動的壓縮應力，高力學強度的支架不僅起到暫時力學支撐替代作用，而且適當的應力刺激還能促進細胞的增殖、分化以及與周圍正常軟骨區域的整合[24-28]。本研究生物力學檢測示，PLGA 支架壓縮模量與 PLGA/DACECM 取向支架比較差異無統計學意義，均顯著高于 DACECM 取向支架。
本研究顯示，DACECM 保留了關節軟骨細胞外基質中的主要成分 GAGs 和Ⅱ型膠原。其良好的生物學特性可有效地誘導與維持關節腔內 MSCs 成軟骨分化[10, 29-33]。PLGA/DACECM 取向支架一方面可以利用 PLGA 提供力學支撐，而且其降解緩慢，可長期存在于膝關節內，為新生組織的成熟提供一個時間窗口[12]；另一方面，DACECM 具有良好的生物相容性，可以使支架具有更好的軟骨誘導性特點；此外，仿生的軟骨環境條件及垂直取向結構又可以進一步誘導軟骨功能蛋白的累積和天然結構的再生，使其發揮正常的軟骨功能[21]。PLGA/DACECM 取向支架可以充分利用兩種材料的優勢，達到優勢互補。所以我們認為，PLGA/DACECM 取向支架比單純 PLGA 支架和 DACECM 取向支架更適合軟骨的再生修復。
綜上述，本研究采用低溫沉積 3D 打印技術和改良式物理、化學脫細胞法、冷凍干燥、物理化學法交聯技術等，立足于滿足軟骨再生修復不同階段（誘導分化階段、成熟階段）的關鍵要素，成功構建了新型組織工程軟骨仿生支架。在誘導分化階段利用軟骨細胞外基質誘導干細胞向軟骨方向分化；成熟階段利用 3D 打印 PLGA 取向支架，為新生軟骨成熟提供良好的力學條件及仿生微結構。PLGA/DACECM 取向支架具有良好的生物學與力學特性，有作為軟骨缺損修復替代材料的潛力。但 PLGA/DACECM 取向支架在募集內源性干細胞功能方面有所欠缺。針對組織工程軟骨支架研究現狀，通過整合傳統與新型組織工程支架制備工藝，構建既能募集內源性干細胞，又能仿生軟骨天然微環境及微結構，且有利于新生組織成熟的組織工程軟骨支架，轉變傳統的首先經過體外構建細胞支架復合體、再植入體內進行軟骨修復的模式，將是組織工程軟骨修復研究新方向。
作者貢獻：張彬參與實驗設計，數據收集、整理、分析，撰寫文章；沈師、鮮海參與實驗設計，動物實驗，收集實驗原始數據；代永靜、劉舒云、魯曉波參與指導實驗設計，文章撰寫及修改；郭維民參與指導實驗設計，統計分析，文章撰寫及修改；李旭參與實驗設計，動物實驗，英文翻譯；張學亮、王振勇、李浩江參與實驗設計，原材料的收集及制備；彭禮慶、羅旭江參與實驗設計，原材料的收集及制備，實驗細胞的培養；郭全義指導實驗設計、統籌實驗進度、文章撰寫及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍總醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物使用許可證批準號：SYXK（軍）2015-0003。
