引用本文： 李星瑋, 莎茹拉, 鮑丙波, 高濤, 林俊卿, 鄭憲友. 大鼠坐骨神經延長術對疼痛影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(7): 894-900. doi: 10.7507/1002-1892.2018120912 復制
隨著社會進步與交通事業的發展，高能量創傷患者比例日趨增高，其中不乏周圍神經損傷的患者。據報道[1]，交通傷合并周圍神經損傷患者約占 5%，但修復后功能完全恢復者僅占 12%。周圍神經缺損是指肢體于功能位恢復其神經干“生物彈性”后，神經斷端間仍然存在間距[2-3]。神經缺損患者普遍存在功能喪失，嚴重者甚至喪失生活自理能力，加重家庭及社會的負擔。所以，神經缺損的診治是臨床上亟待解決的問題。
目前，周圍神經缺損的治療方法較多，但總體修復效果不甚理想。主要治療方法包括自體神經移植、同種異體神經移植、神經轉位等[4-5]。目前臨床認為神經移植是神經缺損修復的“金標準”[6]，但在實施神經移植術的過程中存在許多問題，如犧牲自體神經、移植神經無血供、神經移植需經歷兩次吻合、自體神經來源較有限等。神經轉位同樣是一種犧牲供區神經和功能的方法，且對神經缺損部位要求嚴格。同種異體神經移植雖解決了供區神經的問題，但存在組織排斥及生長緩慢、術后功能恢復差等問題。而組織工程神經以及細胞自噬[7]在周圍神經修復領域尚處于科研階段，無法應用于臨床。
研究發現神經斷端具有一定的抵抗張力作用，經過一定力牽拉后可促進軸索的發芽[8]。成人軸突在 2 mm/d 以下速率進行延長時，神經元細胞能維持形態、結構及功能的完整[9]。早在 1987 年便有學者提出了神經延長術[10]。神經延長術指對周圍神經進行一定范圍延長，使得神經缺損能夠直接進行縫合，達到修復周圍神經的目的[11]；隨后研究者不斷完善相關研究[12-13]。神經延長術具有不受自體神經限制、無人工神經免疫排斥風險、手術操作簡便等優點；然而，神經延長術中是否產生疼痛一直是學者存疑的焦點，亦是限制其臨床應用的瓶頸。另一方面，大量研究表明，自傷行為評分[14]可以量化大鼠神經缺損后疼痛程度，TNF-α 與疼痛的發展有著密切關系[15]，脊髓后角 c-Fos 蛋白的大量表達可作為疼痛的標志[16-17]。目前針對神經延長術與延長過程中產生的疼痛相關研究較少，本研究選取上述指標，擬探討大鼠神經延長過程中是否產生疼痛，進而為神經延長術的臨床應用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
SPF 級成年雄性 Wistar 大鼠 36 只，體質量 250～300 g，由上海斯萊克動物實驗責任有限公司提供。
直徑 1 mm、尖端帶螺紋的自制克氏針，自制神經延長外固定架。外固定架通過 2 枚克氏針固定于大鼠股骨中段，神經斷端縫入神經套環，通過牽引線固定于支架上的游碼，以達到延長神經的目的。見圖 1。
圖1
自制神經延長外固定架示意圖
Figure1.
Schematic diagram of self-made external fixation for nerve elongation
兔抗人 TNF-α 抗體（Chemicon 公司，美國）；生物素標記的山羊抗兔 IgG、生物素標記的馬抗小鼠 IgG、親和素-生物素-過氧化物酶復合物（Vector Laboratories 公司，美國）；DAB（Dako 公司，日本）；快速硬化封片劑 EUKITT（Kindler 公司，德國）；單克隆抗 S-100 抗體（Abcam 公司，英國）。
1.2 實驗分組及方法
取 18 只 Wistar 大鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，分別為坐骨神經延長組（A 組）、單純外支架固定非延長組（B 組）、神經切斷結扎組（C 組）。3 組大鼠均于術前 12 h 開始禁食、水，然后腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，單側大腿備皮，取側臥位，固定四肢。
將 3 組大鼠于無菌條件下沿右股骨上緣作一長約 4 cm 橫切口，后于股骨后外側肌間隙暴露坐骨神經，切除大腿中段坐骨神經 10 mm，以建立坐骨神經缺損模型。C 組直接用 4-0 絲線結扎斷端神經，聚維酮碘溶液、生理鹽水沖洗后，逐層縫合關閉切口。A、B 組暴露右側股骨，于股骨中段置入 2 枚自制克氏針，在克氏針上安裝神經延長外固定架。于神經遠近斷端分別套入自制神經套環，并使用 4-0 絲線將神經斷端縫合固定于神經套環內。套環預先穿入 2-0 縫線作為牽引線，牽引線通過彎型導管固定于外固定架的滑動模塊上。調整牽引線預留長度以調節神經張力。聚維酮碘溶液、生理鹽水沖洗后，逐層縫合關閉切口。A 組于術后第 1 天開始，右側坐骨神經遠近端以 1 mm/d 速度進行神經延長，共延長 14 d；術后每日傷口護理，注意觀察有無感染跡象。B 組術后不作神經延長，僅作外支架固定。
另取 18 只大鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，分別為坐骨神經延長組（A1 組），單純外支架固定非延長組（B1 組）、陽性對照組（C1 組），每組 6 只。A1、B1 組同 A、B 組方法建立 10 mm 長坐骨神經缺損模型后進行外支架固定，術后 3 d A1 組于無麻醉狀態下延長坐骨神經近端 1 mm，B1 組不作神經延長。C1 組不作造模處理，于足趾部注射 20 μL 2.5% 甲醛。
1.3 觀測指標
1.3.1 自傷行為評分
造模術后 3、7、10、14 d 采用 Wall 等[14]設計的自傷行為評分量表評價 A、B、C 組大鼠足部損傷情況。若 1 個或更多足趾指甲受到攻擊得 1 分；若受到攻擊的遠半截足趾每增加 1 個，增加 1 分；若受到攻擊的近半截足趾每增加 1 個，再增加 1 分；若所有腳趾都受到攻擊，則得分為 11 分。
1.3.2 TNF-α 免疫組織化學染色觀察
術后 14 d A、B、C 組各取 6 只動物，麻醉后予以多聚甲醛心臟灌注處死。然后取 L4～S1 脊髓背根神經節（dorsal root ganglia，DRG），石蠟切片，片厚 5 μm。切片以室溫風扇吹干，4% 多聚甲醛固定 30 min；在 0.3%H2O2-甲醇溶液中室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；1.5%（V/V）正常山羊血清室溫孵育 30 min 以阻斷非特異性結合；后加入兔抗人 TNF-α 一抗（1∶400），4℃ 過夜，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；將切片與生物素標記的山羊抗兔 IgG 二抗（1∶150）室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入親和素-生物素-過氧化物酶復合物 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；使用 DAB 對切片進行免疫組織化學染色，浸入蘇木精中 10 s 對比染色，光鏡密切監測，控制顯色時間。再次 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，并將之置入 EUKITT 中。陰性對照組用純血清代替一抗處理標本。光鏡觀察各組 TNF-α 陽性染色情況。
1.3.3 c-Fos 免疫組織化學染色觀察
術后 3 d A1、B1、C1 組進行相應操作 90 min 后，取 4 組大鼠 L4～S1 節段脊髓后角，同 1.3.2 方法制作切片。將各組切片于 PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；在 0.3%H2O2-甲醇溶液中室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；1.5%（V/V）正常馬血清中室溫孵育 20 min，以阻斷非特異性結合；后加入小鼠單克隆抗 S-100 抗體（1∶400），PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；將切片與生物素標記的馬抗小鼠 IgG 二抗（1∶150）室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入親和素-生物素-過氧化物酶復合物室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；使用 DAB 對切片進行免疫組織化學染色，光鏡密切監測，控制顯色時間；再次沖洗切片，并置入 EUKITT 中，光鏡下觀察棕褐色顆粒陽性表達。陰性對照組使用純血清代替一抗處理標本。于 100 倍放大視野下隨機取 5 個視野計數 c-Fos 陽性細胞數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 自傷行為評分
隨術后時間延長，B、C 組大鼠自傷行為評分均逐漸增加，A 組較穩定維持在（0.25±0.50）分。術后各時間點 C 組評分均顯著高于 A、B 組，術后 10、14 d 時 A 組評分顯著低于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠自傷行為評分比較（n=6，
）
Table1.
Comparisons of autotomy scores of rats in each group at different time points after operation (n=6, 
)
2.2 TNF-α 免疫組織化學染色觀察
光鏡觀察示，A 組 TNF-α 表達微弱，呈輕微陽性（+/?），接近陰性對照組；B 組 TNF-α 呈陽性表達（+）；C 組出現大量棕黃色顆粒，TNF-α 呈強陽性表達（++）；陰性對照組 DRG 無 TNF-α 表達（?）。見圖 2。
圖2
術后 14 d 各組大鼠 L4～S1 節段 DRG 中 TNF-α 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. 陰性對照組
Figure2. Immunohistochemical staining of TNF-α in L4-S1 segment DRG of rats in each group at 14 days after operation (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Negative control group
2.3 c-Fos 免疫組織化學染色觀察
光鏡觀察示，A1、B1 組偶見棕褐色顆粒，呈弱陽性表達；C1 組可見大量棕褐色顆粒定位于細胞核，呈圓形或卵圓形，細胞質和核仁均不染色，呈明顯的強陽性表達；陰性對照組無 c-Fos 陽性表達。見圖 3。A1、B1、C1 組和陰性對照組 c-Fos 陽性細胞數分別為（21.5±6.6）、（19.3±8.1）、（95.6±7.4）和 0 個/視野，C1 組顯著高于 A1、B1 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
術后 3 d 各組大鼠 L4～S1 節段脊髓后角中 c-Fos 免疫組織化學染色觀察（×100）
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. 陰性對照組
Figure3. Immunohistochemical staining of c-Fos in the dorsal horn of spinal cord of L4-S1 segments of rats in each group at 3 days after operation (×100)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Negative control group
3 討論
周圍神經缺損是骨科尚未解決的難題之一。目前在臨床上，自體神經移植仍是治療周圍神經缺損的“金標準”，但存在諸多缺點。神經延長術外科操作便利，神經延長后可使神經外膜直接進行無張力縫合，在外科手術中較易實施，其臨床應用前景較好。既往研究曾通過使鄰近關節屈曲位來縮短神經缺損長度，減小直接縫合神經的張力，術后逐漸伸展關節來延長神經的方法[18]，以達到不使用神經移植來修復周圍神經缺損的目的[19-20]。但該神經牽拉法并非直線延長，且延長過程中牽引方向有可能因為關節屈曲角度變化而一直發生變化，并不能保證神經沿自身縱軸直線延長，同時可能會受到其他周圍組織的卡壓；另一方面，牽拉速度也會隨關節屈曲角度變化而變化，并非勻速牽引，速度不易控制。
本研究中的神經延長系周圍神經缺損斷端的直接、緩慢延長，可通過外固定架上的游碼實現對周圍神經延長速度的精確控制，遠近端均以 1 mm/d 速度延長。既往在離體實驗[9]、動物實驗[21-22]，甚至在人體肢體延長[23]中發現，以 1 mm/d 速度延長周圍神經安全可靠，并且與周圍神經的生長速度[24]相比，神經延長速度并不會超過生理上的神經生長速度，因此延長過程中不會對周圍神經產生過大張力，并不會出現纖維化。Kubota 等[22]研究表明，于 1 mm/d 速度延長神經，僅在延長后短時間內出現脫髓鞘現象，而后較快修復，神經傳導速度及復合神經動作電位的持續時間可恢復至空白對照組水平。亦有研究[11]提出組織擴張器也可延長神經，但其方向和速度均不可控，且會因局部壓力過大壓迫神經，影響神經血運。而本研究中采用的方法并不對神經產生直接壓迫，對神經的血運不會有影響。
神經延長術將會成為神經組織修復的創新方法之一，但同時也存在一些局限性，限制了神經延長術在臨床方面的使用。其一，由于需要長時間被動牽拉神經延長，導致治療時間延長，感染風險增加；其二，神經延長術后為了吻合神經，需要進行二次手術；其三，神經延長術后是否會引起疼痛，需要進一步研究[25]。Jeudy 等[26]研究認為，在進行神經延長術延長過程中疼痛較為明顯，延長的神經吻合后疼痛感覺顯著下降。但延長時疼痛產生的具體機制仍不清楚。
Wall 等[14]于 1979 年發明了大小鼠神經缺損疼痛評分量表，廣泛應用于相關研究中，通過自傷行為評分可以量化大鼠神經缺損后疼痛程度。本研究結果顯示，隨術后時間延長，B 組自傷行為評分逐漸增加，說明大鼠產生了一定水平的疼痛；A 組大鼠術后 1 d 即出現了自傷行為，但在隨后的神經延長過程中評分并未增加，提示可能是神經切斷導致的疼痛；而 C 組自傷行為評分隨時間延長逐漸增加。比較發現，神經延長非但不引起疼痛，同時可能起到了緩解和治療疼痛的作用。
目前研究認為，TNF-α 與疼痛的發展有著密切關系。TNF-α 主要由單核巨噬細胞分泌，其與周圍組織破壞、慢性關節炎癥及疼痛密切相關[15, 27]。TNF-α 產生疼痛的主要機制有許多，包括促進前列腺素 E2 及白三烯的形成，引起緩激肽的釋放，促進去甲腎上腺神經元釋放去甲腎上腺素等來誘導機體產生疼痛。Murata 等[27]研究認為 TNF-α 能夠作用于周圍或中樞神經組織，并引起結構及功能出現變化，促進炎性介質的產生，導致疼痛進一步發展。對于急性期疼痛，目前研究認為主要是由巨噬細胞等炎性細胞分泌多種炎性介質所啟動。而 Emshoff 等[28]研究認為對于慢性疼痛患者，TNF-α 的表達水平也有所升高。本研究中，通過對大鼠 L4～S1 的 DRG 進行 TNF-α 免疫組織化學染色顯示，A 組 TNF-α 陽性表達輕微（+/?），明顯弱于 C 組，較 B 組也有所降低，與自傷行為評分結果相吻合，提示神經延長整個過程中并不產生明顯的疼痛刺激。
大量研究表明[16-17]，機體遭受外周傷害性刺激后，在相應節段脊髓后角可檢測到 c-Fos 蛋白的大量表達，c-Fos 可作為疼痛的標志物。因此，本研究選取 c-Fos 作為急性疼痛的指標，研究神經延長時是否產生疼痛刺激。c-Fos 基因是一種原癌基因，被稱為即刻早期基因，正常生理狀態下在很多種類包括神經細胞中表達水平均很低；一旦接受內外源性刺激短時間（90 min）內即呈大量表達，產生 c-Fos 蛋白。因此 c-Fos 蛋白的表達又被視為細胞活化的標志[16]。脊髓是聯系外周與大腦中樞神經系統的中轉站，是感覺疼痛的重要結構。接受傷害性刺激后，c-Fos 蛋白表達于 30～60 min 開始增加，90 min 達高峰。本研究中，C1 組 c-Fos 染色見大量棕褐色顆粒，呈強陽性表達；而無麻醉狀態下進行神經延長的 A1 組和未延長的 B1 組均無明顯表達，提示神經延長時不會引起明顯的疼痛刺激。
本研究結果顯示，A 組自傷行為評分并未隨延長過程而逐漸增加，TNF-α 表達輕微，A1 組 c-Fos 蛋白未見明顯表達。由此可見，對于神經斷端本來生長雜亂無章的雪旺細胞，牽引神經給予了一個較為有序的生長環境，使神經修復有了引導和方向，而以 1 mm/d 速度延長并不會超過生理上的神經生長速度[24]，因此延長過程中不會對周圍神經產生過大張力，從而避免了神經瘤形成及疼痛的產生。這可能是周圍神經延長不引起疼痛，反而治療疼痛的原因。
綜上述，對損傷神經進行延長操作時以及整個延長過程中并不產生明顯的疼痛反應，這為神經延長術的臨床應用提供了夯實的實驗及理論基礎。本研究著眼于神經延長對疼痛的影響，但其底層機制問題尚不明確，這也是運用外固定架進行神經延長的下一步研究方向。
作者貢獻：李星瑋負責科研設計、實驗操作、數據收集整理、文章撰寫；莎茹拉負責科研設計、實驗操作、統計分析；鮑丙波負責數據收集整理、統計分析；高濤負責實驗操作、數據收集整理；林俊卿：實驗操作、數據收集整理；鄭憲友負責科研設計、統計分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗均經上海市第六人民醫院動物福利倫理委員會批準（DWLL2019-0271 號），實驗動物使用許可證批準號：SYXK2016-0020。
隨著社會進步與交通事業的發展，高能量創傷患者比例日趨增高，其中不乏周圍神經損傷的患者。據報道[1]，交通傷合并周圍神經損傷患者約占 5%，但修復后功能完全恢復者僅占 12%。周圍神經缺損是指肢體于功能位恢復其神經干“生物彈性”后，神經斷端間仍然存在間距[2-3]。神經缺損患者普遍存在功能喪失，嚴重者甚至喪失生活自理能力，加重家庭及社會的負擔。所以，神經缺損的診治是臨床上亟待解決的問題。
目前，周圍神經缺損的治療方法較多，但總體修復效果不甚理想。主要治療方法包括自體神經移植、同種異體神經移植、神經轉位等[4-5]。目前臨床認為神經移植是神經缺損修復的“金標準”[6]，但在實施神經移植術的過程中存在許多問題，如犧牲自體神經、移植神經無血供、神經移植需經歷兩次吻合、自體神經來源較有限等。神經轉位同樣是一種犧牲供區神經和功能的方法，且對神經缺損部位要求嚴格。同種異體神經移植雖解決了供區神經的問題，但存在組織排斥及生長緩慢、術后功能恢復差等問題。而組織工程神經以及細胞自噬[7]在周圍神經修復領域尚處于科研階段，無法應用于臨床。
研究發現神經斷端具有一定的抵抗張力作用，經過一定力牽拉后可促進軸索的發芽[8]。成人軸突在 2 mm/d 以下速率進行延長時，神經元細胞能維持形態、結構及功能的完整[9]。早在 1987 年便有學者提出了神經延長術[10]。神經延長術指對周圍神經進行一定范圍延長，使得神經缺損能夠直接進行縫合，達到修復周圍神經的目的[11]；隨后研究者不斷完善相關研究[12-13]。神經延長術具有不受自體神經限制、無人工神經免疫排斥風險、手術操作簡便等優點；然而，神經延長術中是否產生疼痛一直是學者存疑的焦點，亦是限制其臨床應用的瓶頸。另一方面，大量研究表明，自傷行為評分[14]可以量化大鼠神經缺損后疼痛程度，TNF-α 與疼痛的發展有著密切關系[15]，脊髓后角 c-Fos 蛋白的大量表達可作為疼痛的標志[16-17]。目前針對神經延長術與延長過程中產生的疼痛相關研究較少，本研究選取上述指標，擬探討大鼠神經延長過程中是否產生疼痛，進而為神經延長術的臨床應用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
SPF 級成年雄性 Wistar 大鼠 36 只，體質量 250～300 g，由上海斯萊克動物實驗責任有限公司提供。
直徑 1 mm、尖端帶螺紋的自制克氏針，自制神經延長外固定架。外固定架通過 2 枚克氏針固定于大鼠股骨中段，神經斷端縫入神經套環，通過牽引線固定于支架上的游碼，以達到延長神經的目的。見圖 1。
圖1
自制神經延長外固定架示意圖
Figure1.
Schematic diagram of self-made external fixation for nerve elongation
兔抗人 TNF-α 抗體（Chemicon 公司，美國）；生物素標記的山羊抗兔 IgG、生物素標記的馬抗小鼠 IgG、親和素-生物素-過氧化物酶復合物（Vector Laboratories 公司，美國）；DAB（Dako 公司，日本）；快速硬化封片劑 EUKITT（Kindler 公司，德國）；單克隆抗 S-100 抗體（Abcam 公司，英國）。
1.2 實驗分組及方法
取 18 只 Wistar 大鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，分別為坐骨神經延長組（A 組）、單純外支架固定非延長組（B 組）、神經切斷結扎組（C 組）。3 組大鼠均于術前 12 h 開始禁食、水，然后腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，單側大腿備皮，取側臥位，固定四肢。
將 3 組大鼠于無菌條件下沿右股骨上緣作一長約 4 cm 橫切口，后于股骨后外側肌間隙暴露坐骨神經，切除大腿中段坐骨神經 10 mm，以建立坐骨神經缺損模型。C 組直接用 4-0 絲線結扎斷端神經，聚維酮碘溶液、生理鹽水沖洗后，逐層縫合關閉切口。A、B 組暴露右側股骨，于股骨中段置入 2 枚自制克氏針，在克氏針上安裝神經延長外固定架。于神經遠近斷端分別套入自制神經套環，并使用 4-0 絲線將神經斷端縫合固定于神經套環內。套環預先穿入 2-0 縫線作為牽引線，牽引線通過彎型導管固定于外固定架的滑動模塊上。調整牽引線預留長度以調節神經張力。聚維酮碘溶液、生理鹽水沖洗后，逐層縫合關閉切口。A 組于術后第 1 天開始，右側坐骨神經遠近端以 1 mm/d 速度進行神經延長，共延長 14 d；術后每日傷口護理，注意觀察有無感染跡象。B 組術后不作神經延長，僅作外支架固定。
另取 18 只大鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，分別為坐骨神經延長組（A1 組），單純外支架固定非延長組（B1 組）、陽性對照組（C1 組），每組 6 只。A1、B1 組同 A、B 組方法建立 10 mm 長坐骨神經缺損模型后進行外支架固定，術后 3 d A1 組于無麻醉狀態下延長坐骨神經近端 1 mm，B1 組不作神經延長。C1 組不作造模處理，于足趾部注射 20 μL 2.5% 甲醛。
1.3 觀測指標
1.3.1 自傷行為評分
造模術后 3、7、10、14 d 采用 Wall 等[14]設計的自傷行為評分量表評價 A、B、C 組大鼠足部損傷情況。若 1 個或更多足趾指甲受到攻擊得 1 分；若受到攻擊的遠半截足趾每增加 1 個，增加 1 分；若受到攻擊的近半截足趾每增加 1 個，再增加 1 分；若所有腳趾都受到攻擊，則得分為 11 分。
1.3.2 TNF-α 免疫組織化學染色觀察
術后 14 d A、B、C 組各取 6 只動物，麻醉后予以多聚甲醛心臟灌注處死。然后取 L4～S1 脊髓背根神經節（dorsal root ganglia，DRG），石蠟切片，片厚 5 μm。切片以室溫風扇吹干，4% 多聚甲醛固定 30 min；在 0.3%H2O2-甲醇溶液中室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；1.5%（V/V）正常山羊血清室溫孵育 30 min 以阻斷非特異性結合；后加入兔抗人 TNF-α 一抗（1∶400），4℃ 過夜，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；將切片與生物素標記的山羊抗兔 IgG 二抗（1∶150）室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入親和素-生物素-過氧化物酶復合物 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；使用 DAB 對切片進行免疫組織化學染色，浸入蘇木精中 10 s 對比染色，光鏡密切監測，控制顯色時間。再次 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，并將之置入 EUKITT 中。陰性對照組用純血清代替一抗處理標本。光鏡觀察各組 TNF-α 陽性染色情況。
1.3.3 c-Fos 免疫組織化學染色觀察
術后 3 d A1、B1、C1 組進行相應操作 90 min 后，取 4 組大鼠 L4～S1 節段脊髓后角，同 1.3.2 方法制作切片。將各組切片于 PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；在 0.3%H2O2-甲醇溶液中室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；1.5%（V/V）正常馬血清中室溫孵育 20 min，以阻斷非特異性結合；后加入小鼠單克隆抗 S-100 抗體（1∶400），PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；將切片與生物素標記的馬抗小鼠 IgG 二抗（1∶150）室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入親和素-生物素-過氧化物酶復合物室溫孵育 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；使用 DAB 對切片進行免疫組織化學染色，光鏡密切監測，控制顯色時間；再次沖洗切片，并置入 EUKITT 中，光鏡下觀察棕褐色顆粒陽性表達。陰性對照組使用純血清代替一抗處理標本。于 100 倍放大視野下隨機取 5 個視野計數 c-Fos 陽性細胞數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 自傷行為評分
隨術后時間延長，B、C 組大鼠自傷行為評分均逐漸增加，A 組較穩定維持在（0.25±0.50）分。術后各時間點 C 組評分均顯著高于 A、B 組，術后 10、14 d 時 A 組評分顯著低于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠自傷行為評分比較（n=6，）
Table1.
Comparisons of autotomy scores of rats in each group at different time points after operation (n=6, )
2.2 TNF-α 免疫組織化學染色觀察
光鏡觀察示，A 組 TNF-α 表達微弱，呈輕微陽性（+/?），接近陰性對照組；B 組 TNF-α 呈陽性表達（+）；C 組出現大量棕黃色顆粒，TNF-α 呈強陽性表達（++）；陰性對照組 DRG 無 TNF-α 表達（?）。見圖 2。
圖2
術后 14 d 各組大鼠 L4～S1 節段 DRG 中 TNF-α 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. 陰性對照組
Figure2. Immunohistochemical staining of TNF-α in L4-S1 segment DRG of rats in each group at 14 days after operation (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Negative control group
2.3 c-Fos 免疫組織化學染色觀察
光鏡觀察示，A1、B1 組偶見棕褐色顆粒，呈弱陽性表達；C1 組可見大量棕褐色顆粒定位于細胞核，呈圓形或卵圓形，細胞質和核仁均不染色，呈明顯的強陽性表達；陰性對照組無 c-Fos 陽性表達。見圖 3。A1、B1、C1 組和陰性對照組 c-Fos 陽性細胞數分別為（21.5±6.6）、（19.3±8.1）、（95.6±7.4）和 0 個/視野，C1 組顯著高于 A1、B1 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
術后 3 d 各組大鼠 L4～S1 節段脊髓后角中 c-Fos 免疫組織化學染色觀察（×100）
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. 陰性對照組
Figure3. Immunohistochemical staining of c-Fos in the dorsal horn of spinal cord of L4-S1 segments of rats in each group at 3 days after operation (×100)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Negative control group
3 討論
周圍神經缺損是骨科尚未解決的難題之一。目前在臨床上，自體神經移植仍是治療周圍神經缺損的“金標準”，但存在諸多缺點。神經延長術外科操作便利，神經延長后可使神經外膜直接進行無張力縫合，在外科手術中較易實施，其臨床應用前景較好。既往研究曾通過使鄰近關節屈曲位來縮短神經缺損長度，減小直接縫合神經的張力，術后逐漸伸展關節來延長神經的方法[18]，以達到不使用神經移植來修復周圍神經缺損的目的[19-20]。但該神經牽拉法并非直線延長，且延長過程中牽引方向有可能因為關節屈曲角度變化而一直發生變化，并不能保證神經沿自身縱軸直線延長，同時可能會受到其他周圍組織的卡壓；另一方面，牽拉速度也會隨關節屈曲角度變化而變化，并非勻速牽引，速度不易控制。
本研究中的神經延長系周圍神經缺損斷端的直接、緩慢延長，可通過外固定架上的游碼實現對周圍神經延長速度的精確控制，遠近端均以 1 mm/d 速度延長。既往在離體實驗[9]、動物實驗[21-22]，甚至在人體肢體延長[23]中發現，以 1 mm/d 速度延長周圍神經安全可靠，并且與周圍神經的生長速度[24]相比，神經延長速度并不會超過生理上的神經生長速度，因此延長過程中不會對周圍神經產生過大張力，并不會出現纖維化。Kubota 等[22]研究表明，于 1 mm/d 速度延長神經，僅在延長后短時間內出現脫髓鞘現象，而后較快修復，神經傳導速度及復合神經動作電位的持續時間可恢復至空白對照組水平。亦有研究[11]提出組織擴張器也可延長神經，但其方向和速度均不可控，且會因局部壓力過大壓迫神經，影響神經血運。而本研究中采用的方法并不對神經產生直接壓迫，對神經的血運不會有影響。
神經延長術將會成為神經組織修復的創新方法之一，但同時也存在一些局限性，限制了神經延長術在臨床方面的使用。其一，由于需要長時間被動牽拉神經延長，導致治療時間延長，感染風險增加；其二，神經延長術后為了吻合神經，需要進行二次手術；其三，神經延長術后是否會引起疼痛，需要進一步研究[25]。Jeudy 等[26]研究認為，在進行神經延長術延長過程中疼痛較為明顯，延長的神經吻合后疼痛感覺顯著下降。但延長時疼痛產生的具體機制仍不清楚。
Wall 等[14]于 1979 年發明了大小鼠神經缺損疼痛評分量表，廣泛應用于相關研究中，通過自傷行為評分可以量化大鼠神經缺損后疼痛程度。本研究結果顯示，隨術后時間延長，B 組自傷行為評分逐漸增加，說明大鼠產生了一定水平的疼痛；A 組大鼠術后 1 d 即出現了自傷行為，但在隨后的神經延長過程中評分并未增加，提示可能是神經切斷導致的疼痛；而 C 組自傷行為評分隨時間延長逐漸增加。比較發現，神經延長非但不引起疼痛，同時可能起到了緩解和治療疼痛的作用。
目前研究認為，TNF-α 與疼痛的發展有著密切關系。TNF-α 主要由單核巨噬細胞分泌，其與周圍組織破壞、慢性關節炎癥及疼痛密切相關[15, 27]。TNF-α 產生疼痛的主要機制有許多，包括促進前列腺素 E2 及白三烯的形成，引起緩激肽的釋放，促進去甲腎上腺神經元釋放去甲腎上腺素等來誘導機體產生疼痛。Murata 等[27]研究認為 TNF-α 能夠作用于周圍或中樞神經組織，并引起結構及功能出現變化，促進炎性介質的產生，導致疼痛進一步發展。對于急性期疼痛，目前研究認為主要是由巨噬細胞等炎性細胞分泌多種炎性介質所啟動。而 Emshoff 等[28]研究認為對于慢性疼痛患者，TNF-α 的表達水平也有所升高。本研究中，通過對大鼠 L4～S1 的 DRG 進行 TNF-α 免疫組織化學染色顯示，A 組 TNF-α 陽性表達輕微（+/?），明顯弱于 C 組，較 B 組也有所降低，與自傷行為評分結果相吻合，提示神經延長整個過程中并不產生明顯的疼痛刺激。
大量研究表明[16-17]，機體遭受外周傷害性刺激后，在相應節段脊髓后角可檢測到 c-Fos 蛋白的大量表達，c-Fos 可作為疼痛的標志物。因此，本研究選取 c-Fos 作為急性疼痛的指標，研究神經延長時是否產生疼痛刺激。c-Fos 基因是一種原癌基因，被稱為即刻早期基因，正常生理狀態下在很多種類包括神經細胞中表達水平均很低；一旦接受內外源性刺激短時間（90 min）內即呈大量表達，產生 c-Fos 蛋白。因此 c-Fos 蛋白的表達又被視為細胞活化的標志[16]。脊髓是聯系外周與大腦中樞神經系統的中轉站，是感覺疼痛的重要結構。接受傷害性刺激后，c-Fos 蛋白表達于 30～60 min 開始增加，90 min 達高峰。本研究中，C1 組 c-Fos 染色見大量棕褐色顆粒，呈強陽性表達；而無麻醉狀態下進行神經延長的 A1 組和未延長的 B1 組均無明顯表達，提示神經延長時不會引起明顯的疼痛刺激。
本研究結果顯示，A 組自傷行為評分并未隨延長過程而逐漸增加，TNF-α 表達輕微，A1 組 c-Fos 蛋白未見明顯表達。由此可見，對于神經斷端本來生長雜亂無章的雪旺細胞，牽引神經給予了一個較為有序的生長環境，使神經修復有了引導和方向，而以 1 mm/d 速度延長并不會超過生理上的神經生長速度[24]，因此延長過程中不會對周圍神經產生過大張力，從而避免了神經瘤形成及疼痛的產生。這可能是周圍神經延長不引起疼痛，反而治療疼痛的原因。
綜上述，對損傷神經進行延長操作時以及整個延長過程中并不產生明顯的疼痛反應，這為神經延長術的臨床應用提供了夯實的實驗及理論基礎。本研究著眼于神經延長對疼痛的影響，但其底層機制問題尚不明確，這也是運用外固定架進行神經延長的下一步研究方向。
作者貢獻：李星瑋負責科研設計、實驗操作、數據收集整理、文章撰寫；莎茹拉負責科研設計、實驗操作、統計分析；鮑丙波負責數據收集整理、統計分析；高濤負責實驗操作、數據收集整理；林俊卿：實驗操作、數據收集整理；鄭憲友負責科研設計、統計分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗均經上海市第六人民醫院動物福利倫理委員會批準（DWLL2019-0271 號），實驗動物使用許可證批準號：SYXK2016-0020。
