引用本文： 張利鋒, 郭川, 申巧巧, 孔清泉, 吳錦榮, 楊進, 王玉, 吳浩, 彭智愚, 晏玉清. 魚鰾膜的制備及其理化特性的研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(4): 486-491. doi: 10.7507/1002-1892.201809100 復制
硬膜破損是脊柱外科及神經外科手術常見并發癥，發生率為 4%～17.4%[1]。如處理不當會導致腦脊液漏、腦膜炎、椎管或顱內感染，甚至死亡等嚴重并發癥[2]。因此，術中及時發現并修復硬膜缺損十分重要。既往認為硬膜破損后不具備再生性[3]，但近年研究發現硬膜破損后可以修復，主要修復機制為缺損邊緣的成纖維細胞遷徙以及增殖分泌Ⅰ型膠原，但該修復過程緩慢[4]。體外實驗證實，當有支架覆蓋于缺損硬膜邊緣時，成纖維細胞可生長、遷徙至支架材料中完成硬膜修復[5]。目前用于硬膜修復的材料大致分為自體組織、同種異體組織、合成材料、生物膜材料 4 種，這些材料存在生物相容性差、增加感染風險、機械性能不佳、改良工藝復雜等不足，限制了進一步應用研究[6]。
目前市售的硬膜修復材料天義福生物膜（天新福醫療器械有限公司）是牛或豬跟腱酶解后的Ⅰ型膠原提純物。因酶解提純破壞了Ⅰ型膠原結構，導致該修復材料力學性能差，抗縫合能力弱[7-8]。而且取材于哺乳動物（如豬、牛、羊）的材料，有潛在傳播疾病風險[9]。魚鰾主要成分為Ⅰ型膠原，與哺乳動物來源Ⅰ型膠原相比，魚鰾具有變性溫度高、密封性能好、生物相容性良好的優點[10-12]。而且魚鰾來源于水生生物，相較于陸地生物污染小、安全性更高，迄今尚無魚類病毒與人畜共患傳播的報道。此外還可有效規避伊斯蘭等地區使用豬相關產品的宗教壁壘問題[13]。而且魚鰾獲取方便、來源廣泛，將其作為硬膜修復材料具有潛在應用前景。本研究我們擬利用交聯方法改善魚鰾性能，同時進行表面制孔，以期獲得既能滿足硬膜修復材料所需要的理化性質和生物相容性，又價格低廉、來源廣泛的修復材料。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH（成都市科龍化工試劑廠）；Triton X-100、碳二亞胺［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸［2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES］（北京百靈威科技有限公司）；上述試劑均為國產分析純。細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（同仁研究所，日本）。
FD-1A-80 冷凍干燥機 （北京博醫康實驗儀器有限公司）；JSM-7500 掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；電子游標卡尺（上海量具刃具廠）；電子萬能材料試驗機（Instron 公司，美國）；光學接觸角測定儀（Dataphysics 公司，德國）；Nicolet iS50 傅立葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher 公司，美國）；自動酶標檢測儀（Sunrise 公司，澳大利亞）。
1.2 實驗方法
1.2.1 魚鰾脫細胞處理
本實驗采用花鰱魚鰾（花鰱魚產自簡陽三岔湖水庫，體質量約 2.5 kg）。用 NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH 配制的 PBS 緩沖液（pH7.4）清洗魚鰾表面纖維及血液、脂肪等組織，置于 1%Triton X-100 溶液中，常溫避光放置 24 h 進行脫細胞處理。
1.2.2 實驗分組及方法
將脫細胞處理后的魚鰾隨機分為未交聯組及交聯組。交聯組：首先采用 EDC/NHS 法進行交聯處理。用 MES 緩沖液配制 EDC 與 NHS 摩爾比為 4∶1 的交聯溶液，放入脫細胞魚鰾，于常溫避光放置 12 h 后取出；置于 PBS 溶液中，超聲條件下反復清洗 3 次。然后進行表面制孔，將魚鰾平鋪于聚苯乙烯泡沫盒中，加入去離子水，用保鮮膜封住開口處，置于–20℃ 冰箱 1 d，取出室溫下解凍。最后，置于冷凍干燥機凍干處理 3 d，取出后以環氧乙烷滅菌處理，常溫下儲存備用。見圖 1。
圖1
交聯組魚鰾膜制備大體觀察
a. 新鮮魚鰾；b. 交聯后魚鰾；c. 凍干后魚鰾
Figure1. General observation on the preparation of the fish swim bladder membrane in crosslinking groupa. Fresh swim bladder; b. After crosslinked; c. After freeze-dried
非交聯組：除不作交聯處理外，同交聯組方法對魚鰾進行表面制孔及凍干處理。
1.3 觀測指標
1.3.1 理化性能檢測
① 掃描電鏡觀察：將兩組材料噴金后，置于掃描電鏡下觀察材料表面及斷面的微觀結構。同時，取未作表面制孔處理的交聯魚鰾觀察，作為對照。
② 力學性能檢測：用裁刀將兩組材料裁成啞鈴形，電子游標卡尺測量其中間部分寬度和厚度。然后，將啞鈴形樣品固定于電子萬能材料試驗機夾具上，以拉伸速率 100 mm/min 進行拉伸測試，直至斷裂。記錄拉伸強度和斷裂伸長率。每組測試 5 個樣品。
③ 親水性及孔隙率測試：將兩組材料制備成 1 cm×2 cm 大小后，將 1 μL 去離子水滴至樣品上，采用光學接觸角測定儀測量接觸角。每組測試 5 個樣品。
采用乙醇浸潤法測定材料孔隙率。將兩組材料制備成 1 cm×2 cm 大小，電子游標卡尺測量厚度。首先測定材料質量（W0），然后置于乙醇浸泡 10 min 后測量質量（W1）。按以下公式計算孔隙率：（W1－W0）/ρV，其中 V 為材料體積，ρ 為乙醇密度。每組測量 5 個樣品。
④ 體外降解性能檢測：稱取兩組材料質量（M0），然后置于 PBS 溶液（pH7.4）中，置于恒溫水浴震蕩箱中浸泡，分別于第 7、14、21、28 天取出材料（每個時間點每組各取 5 個樣本），凍干后稱取質量（M1）。按以下公式計算降解率：（M0－M1）/M0×100%。
⑤ 熱穩定性檢測：稱取兩組質量 3～5 mg 材料，采用差示掃描量熱法測試材料熱穩定性，檢測材料變性溫度。測試起始溫度為 0℃，結束溫度為 100℃，升溫速率為 10 K/min。每組測量 5 個樣品。
⑥ 紅外光譜分析：為判斷魚鰾內部分子是否交聯，以全反射模式進行紅外光譜分析，觀察其基團情況。為排除因魚鰾厚度對結果的影響，實驗均取來自同一個魚鰾的兩組樣品（大小均為 10 mm×10 mm）夾在樣品臺上。
1.3.2 細胞毒性檢測
按照 4 cm2∶1 mL 比例，將兩組材料分別加入含 10%FBS 的 H-DMEM 培養液，于 37℃、5%CO2 培養箱浸泡 24 h，取浸提液備用。取小鼠成纖維細胞 L929（四川大學華西醫院移植免疫實驗室提供），按 1×104個/孔密度接種至 96 孔板。于 37℃、5%CO2 培養箱培養，待細胞貼壁后分別加入交聯組及非交聯組材料浸提液，每孔 100 μL。另外，以單純含 10%FBS 的 H-DMEM 培養液作為陽性對照，含 0.5% 苯酚的培養基作為陰性對照。于培養 24、48、72 h，各組取 5 孔，加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育 4 h。于自動酶標檢測儀測定 450 nm 處吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
交聯組和未交聯組材料均可見斷面疏松多孔結構；與未行表面制孔處理的交聯組材料相比，其表面有凹凸不平的粗糙多孔結構，有利于成纖維細胞黏附生長。其中，交聯組材料斷面相對未交聯組塌陷，但孔隙數量增加。見圖 2。
圖2
各組材料掃描電鏡觀察
a. 未交聯組材料斷面（×1 000）；b. 交聯組材料斷面（×1 000）；c. 未交聯組材料表面（×3 000）；d. 交聯組材料表面（×3 000）；e. 未行表面制孔的交聯組材料表面（×3 000）
Figure2. Scanning electron microscopy observation of each groupa. Cross section of material in non-crosslinking group (×1 000); b. Cross section of material in crosslinking group (×1 000); c. Surface of material in non-crosslinking group (×3 000); d. Surface of material in crosslinking group (×3 000); e. Surface of non-porous material in crosslinking group (×3 000)
2.2 力學性能檢測
交聯組及未交聯組拉伸強度分別為（15.91±1.52）、（12.25±1.59）MPa，斷裂伸長率分別為 38.42%±2.89%、58.70%±2.10%。與未交聯組相比，交聯組拉伸強度明顯增高，斷裂伸長率明顯降低，差異有統計學意義（t=3.389，P=0.028；t=9.280，P=0.001）。
2.3 親水性及孔隙率測試
交聯組及未交聯組接觸角分別為（80.1±0.9）、（78.3±1.8）°，孔隙率分別 73.6%±2.8%、69.3%±1.2%。交聯組接觸角及孔隙率均大于未交聯組，其中接觸角組間差異無統計學意義（t=2.370，P=0.077），孔隙率差異有統計學意義（t=4.447，P=0.011）。
2.4 體外降解性能及熱穩定性檢測
兩組材料降解趨勢一致，最初 7 d 內降解較快，之后趨于平緩。未交聯組各時間點降解率均顯著高于交聯組，差異均有統計學意義（t=27.310，P=0.000；t=26.160，P=0.000；t=19.150，P=0.000；t=18.490，P=0.000）。見圖 3。
圖3
兩組體外降解率比較
Figure3.
Comparison of degradation rates in vitro between the two groups
差示掃描量熱法檢測顯示，交聯組材料變性溫度為（75.2±1.3）℃，高于未交聯組的（68.5±0.4）℃，差異有統計學意義（t=4.586，P=0.002）。見圖 4。
圖4
兩組差示掃描量熱圖
a. 未交聯組；b. 交聯組
Figure4. Differential scanning calorimeter of two groupsa. Non-crosslinking group; b. Crosslinking group
2.5 紅外光譜分析
與未交聯組相比，交聯組材料可見 1 635 cm–1處 C=O 伸縮振動峰，3 280 cm–1處 N-H 鍵伸縮振動峰吸收明顯增加，表明生成了酰胺鍵中新的 C=O 鍵和 N-H 鍵，并且未引入其他新的基團。見圖 5。
圖5
兩組傅里葉紅外光譜圖
Figure5.
Fourier transform infrared spectroscopy of two groups
2.6 細胞毒性檢測
培養后各時間點，交聯組及未交聯組 A 值與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
兩組細胞增殖檢測
Figure6.
The cell proliferations in each group
3 討論
目前，關于魚鰾脫細胞材料的研究較少，EDC/NHS 交聯制備魚鰾膜尚無報道。我們前期預實驗中選擇了草魚及花鰱的魚鰾進行比較，結果發現花鰱魚鰾孔隙大小及密度均優于草魚，故本研究選擇花鰱魚鰾進行實驗。交聯是通過物理或化學方法使膠原蛋白基團發生反應，封閉其裸露在外的活性基團以維持其在植入期間的穩定性，降低免疫原性，增加抗降解性能，提升力學性能[14]。物理方法主要通過紫外光、高熱等處理，使膠原蛋白分子間發生交聯反應。但該方法交聯不徹底，常作為化學交聯的輔助方法。化學方法是利用各種化學試劑，如醛類、EDC、環氧化物等，對膠原進行交聯[15]。國內學者張更申等[16]利用戊二醛對鯉魚魚鰾進行處理后，成功修復兔缺損腦膜，但戊二醛交聯存在醛基殘留等問題。Kumar 等[10]報道用 1，4-丁二醇二縮水甘油醚對魚鰾進行交聯處理并修復皮膚，也存在交聯劑殘留毒性的問題。本研究選擇 EDC 進行交聯處理，與其他化學交聯試劑不同，在交聯過程中 EDC 的作用類似于一種催化劑，催化膠原分子間進行反應，膠原反應后不會引入其他新的基團，而且交聯處理后經 PBS 洗滌，材料無交聯劑殘留。
本研究顯示，魚鰾經交聯后具有疏松多孔結構，有利于細胞遷移生長。與對照組相比，交聯組魚鰾膜拉伸性能得到一定提高，斷裂伸長率降低，提示交聯處理提高了材料的韌性。人體硬膜力學拉伸最大應力為 3～9 MPa，而交聯組材料拉伸強度達（15.91±1.52）MPa，超過人體最大應力范圍。目前市售的天義福生物膜力學性能很弱，有報道甚至未檢測出相關力學指標[17-18]。我們認為該生物膜雖主要成分為Ⅰ型膠原，但其為水解后提純的膠原纖維，水解過程中破壞了原膠原排列結構，導致力學性能差。近年來，隨著電紡技術的發展，有研究聯合Ⅰ型膠原復合高分子聚合物（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸）制備生物膜，結合了膠原良好的生物相容性和聚合物良好的力學性能[18]，早期動物實驗結果良好，但未見長期體內轉歸實驗報道。此外，電紡技術操作復雜，成本較高，也會影響相關生物膜的廣泛應用。
體外降解研究結果顯示，交聯處理顯著提高了魚鰾膜的抗降解性能。既往研究報道魚皮膠原材料的變性溫度約為 30℃，即使通過交聯等方式也難以提升其變性溫度[19]。本研究結果顯示，交聯處理后的魚鰾膜其熱變性溫度為（75.2±1.3）℃，顯著高于人體正常體溫，提示材料熱穩定性也符合人體硬膜修復材料的要求。此外，由于交聯原理是使分子間基團發生反應，因此紅外光譜分析結果顯示新形成的 N-H 鍵、C=O 鍵特征性吸收峰明顯增強，表明交聯起到了催化膠原蛋白裸露的基團發生反應，生成新的酰胺鍵作用。交聯后魚鰾膜接觸角稍增大，我們認為可能是交聯使親水基團發生反應減少所致，但總體未顯著降低膠原親水性[20]。
綜上述，通過脫細胞、EDC/NHS 法處理獲得的魚鰾膜材料具有良好的理化性能，無細胞毒性，有望作為硬膜修復材料。下一步我們將檢測魚鰾膜材料外源性細胞/DNA 的殘留及其生物相容性，為其作為硬膜缺損修復材料提供更多實驗依據。
硬膜破損是脊柱外科及神經外科手術常見并發癥，發生率為 4%～17.4%[1]。如處理不當會導致腦脊液漏、腦膜炎、椎管或顱內感染，甚至死亡等嚴重并發癥[2]。因此，術中及時發現并修復硬膜缺損十分重要。既往認為硬膜破損后不具備再生性[3]，但近年研究發現硬膜破損后可以修復，主要修復機制為缺損邊緣的成纖維細胞遷徙以及增殖分泌Ⅰ型膠原，但該修復過程緩慢[4]。體外實驗證實，當有支架覆蓋于缺損硬膜邊緣時，成纖維細胞可生長、遷徙至支架材料中完成硬膜修復[5]。目前用于硬膜修復的材料大致分為自體組織、同種異體組織、合成材料、生物膜材料 4 種，這些材料存在生物相容性差、增加感染風險、機械性能不佳、改良工藝復雜等不足，限制了進一步應用研究[6]。
目前市售的硬膜修復材料天義福生物膜（天新福醫療器械有限公司）是牛或豬跟腱酶解后的Ⅰ型膠原提純物。因酶解提純破壞了Ⅰ型膠原結構，導致該修復材料力學性能差，抗縫合能力弱[7-8]。而且取材于哺乳動物（如豬、牛、羊）的材料，有潛在傳播疾病風險[9]。魚鰾主要成分為Ⅰ型膠原，與哺乳動物來源Ⅰ型膠原相比，魚鰾具有變性溫度高、密封性能好、生物相容性良好的優點[10-12]。而且魚鰾來源于水生生物，相較于陸地生物污染小、安全性更高，迄今尚無魚類病毒與人畜共患傳播的報道。此外還可有效規避伊斯蘭等地區使用豬相關產品的宗教壁壘問題[13]。而且魚鰾獲取方便、來源廣泛，將其作為硬膜修復材料具有潛在應用前景。本研究我們擬利用交聯方法改善魚鰾性能，同時進行表面制孔，以期獲得既能滿足硬膜修復材料所需要的理化性質和生物相容性，又價格低廉、來源廣泛的修復材料。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH（成都市科龍化工試劑廠）；Triton X-100、碳二亞胺［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸［2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES］（北京百靈威科技有限公司）；上述試劑均為國產分析純。細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（同仁研究所，日本）。
FD-1A-80 冷凍干燥機 （北京博醫康實驗儀器有限公司）；JSM-7500 掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；電子游標卡尺（上海量具刃具廠）；電子萬能材料試驗機（Instron 公司，美國）；光學接觸角測定儀（Dataphysics 公司，德國）；Nicolet iS50 傅立葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher 公司，美國）；自動酶標檢測儀（Sunrise 公司，澳大利亞）。
1.2 實驗方法
1.2.1 魚鰾脫細胞處理
本實驗采用花鰱魚鰾（花鰱魚產自簡陽三岔湖水庫，體質量約 2.5 kg）。用 NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH 配制的 PBS 緩沖液（pH7.4）清洗魚鰾表面纖維及血液、脂肪等組織，置于 1%Triton X-100 溶液中，常溫避光放置 24 h 進行脫細胞處理。
1.2.2 實驗分組及方法
將脫細胞處理后的魚鰾隨機分為未交聯組及交聯組。交聯組：首先采用 EDC/NHS 法進行交聯處理。用 MES 緩沖液配制 EDC 與 NHS 摩爾比為 4∶1 的交聯溶液，放入脫細胞魚鰾，于常溫避光放置 12 h 后取出；置于 PBS 溶液中，超聲條件下反復清洗 3 次。然后進行表面制孔，將魚鰾平鋪于聚苯乙烯泡沫盒中，加入去離子水，用保鮮膜封住開口處，置于–20℃ 冰箱 1 d，取出室溫下解凍。最后，置于冷凍干燥機凍干處理 3 d，取出后以環氧乙烷滅菌處理，常溫下儲存備用。見圖 1。
圖1
交聯組魚鰾膜制備大體觀察
a. 新鮮魚鰾；b. 交聯后魚鰾；c. 凍干后魚鰾
Figure1. General observation on the preparation of the fish swim bladder membrane in crosslinking groupa. Fresh swim bladder; b. After crosslinked; c. After freeze-dried
非交聯組：除不作交聯處理外，同交聯組方法對魚鰾進行表面制孔及凍干處理。
1.3 觀測指標
1.3.1 理化性能檢測
① 掃描電鏡觀察：將兩組材料噴金后，置于掃描電鏡下觀察材料表面及斷面的微觀結構。同時，取未作表面制孔處理的交聯魚鰾觀察，作為對照。
② 力學性能檢測：用裁刀將兩組材料裁成啞鈴形，電子游標卡尺測量其中間部分寬度和厚度。然后，將啞鈴形樣品固定于電子萬能材料試驗機夾具上，以拉伸速率 100 mm/min 進行拉伸測試，直至斷裂。記錄拉伸強度和斷裂伸長率。每組測試 5 個樣品。
③ 親水性及孔隙率測試：將兩組材料制備成 1 cm×2 cm 大小后，將 1 μL 去離子水滴至樣品上，采用光學接觸角測定儀測量接觸角。每組測試 5 個樣品。
采用乙醇浸潤法測定材料孔隙率。將兩組材料制備成 1 cm×2 cm 大小，電子游標卡尺測量厚度。首先測定材料質量（W0），然后置于乙醇浸泡 10 min 后測量質量（W1）。按以下公式計算孔隙率：（W1－W0）/ρV，其中 V 為材料體積，ρ 為乙醇密度。每組測量 5 個樣品。
④ 體外降解性能檢測：稱取兩組材料質量（M0），然后置于 PBS 溶液（pH7.4）中，置于恒溫水浴震蕩箱中浸泡，分別于第 7、14、21、28 天取出材料（每個時間點每組各取 5 個樣本），凍干后稱取質量（M1）。按以下公式計算降解率：（M0－M1）/M0×100%。
⑤ 熱穩定性檢測：稱取兩組質量 3～5 mg 材料，采用差示掃描量熱法測試材料熱穩定性，檢測材料變性溫度。測試起始溫度為 0℃，結束溫度為 100℃，升溫速率為 10 K/min。每組測量 5 個樣品。
⑥ 紅外光譜分析：為判斷魚鰾內部分子是否交聯，以全反射模式進行紅外光譜分析，觀察其基團情況。為排除因魚鰾厚度對結果的影響，實驗均取來自同一個魚鰾的兩組樣品（大小均為 10 mm×10 mm）夾在樣品臺上。
1.3.2 細胞毒性檢測
按照 4 cm2∶1 mL 比例，將兩組材料分別加入含 10%FBS 的 H-DMEM 培養液，于 37℃、5%CO2 培養箱浸泡 24 h，取浸提液備用。取小鼠成纖維細胞 L929（四川大學華西醫院移植免疫實驗室提供），按 1×104個/孔密度接種至 96 孔板。于 37℃、5%CO2 培養箱培養，待細胞貼壁后分別加入交聯組及非交聯組材料浸提液，每孔 100 μL。另外，以單純含 10%FBS 的 H-DMEM 培養液作為陽性對照，含 0.5% 苯酚的培養基作為陰性對照。于培養 24、48、72 h，各組取 5 孔，加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育 4 h。于自動酶標檢測儀測定 450 nm 處吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
交聯組和未交聯組材料均可見斷面疏松多孔結構；與未行表面制孔處理的交聯組材料相比，其表面有凹凸不平的粗糙多孔結構，有利于成纖維細胞黏附生長。其中，交聯組材料斷面相對未交聯組塌陷，但孔隙數量增加。見圖 2。
圖2
各組材料掃描電鏡觀察
a. 未交聯組材料斷面（×1 000）；b. 交聯組材料斷面（×1 000）；c. 未交聯組材料表面（×3 000）；d. 交聯組材料表面（×3 000）；e. 未行表面制孔的交聯組材料表面（×3 000）
Figure2. Scanning electron microscopy observation of each groupa. Cross section of material in non-crosslinking group (×1 000); b. Cross section of material in crosslinking group (×1 000); c. Surface of material in non-crosslinking group (×3 000); d. Surface of material in crosslinking group (×3 000); e. Surface of non-porous material in crosslinking group (×3 000)
2.2 力學性能檢測
交聯組及未交聯組拉伸強度分別為（15.91±1.52）、（12.25±1.59）MPa，斷裂伸長率分別為 38.42%±2.89%、58.70%±2.10%。與未交聯組相比，交聯組拉伸強度明顯增高，斷裂伸長率明顯降低，差異有統計學意義（t=3.389，P=0.028；t=9.280，P=0.001）。
2.3 親水性及孔隙率測試
交聯組及未交聯組接觸角分別為（80.1±0.9）、（78.3±1.8）°，孔隙率分別 73.6%±2.8%、69.3%±1.2%。交聯組接觸角及孔隙率均大于未交聯組，其中接觸角組間差異無統計學意義（t=2.370，P=0.077），孔隙率差異有統計學意義（t=4.447，P=0.011）。
2.4 體外降解性能及熱穩定性檢測
兩組材料降解趨勢一致，最初 7 d 內降解較快，之后趨于平緩。未交聯組各時間點降解率均顯著高于交聯組，差異均有統計學意義（t=27.310，P=0.000；t=26.160，P=0.000；t=19.150，P=0.000；t=18.490，P=0.000）。見圖 3。
圖3
兩組體外降解率比較
Figure3.
Comparison of degradation rates in vitro between the two groups
差示掃描量熱法檢測顯示，交聯組材料變性溫度為（75.2±1.3）℃，高于未交聯組的（68.5±0.4）℃，差異有統計學意義（t=4.586，P=0.002）。見圖 4。
圖4
兩組差示掃描量熱圖
a. 未交聯組；b. 交聯組
Figure4. Differential scanning calorimeter of two groupsa. Non-crosslinking group; b. Crosslinking group
2.5 紅外光譜分析
與未交聯組相比，交聯組材料可見 1 635 cm–1處 C=O 伸縮振動峰，3 280 cm–1處 N-H 鍵伸縮振動峰吸收明顯增加，表明生成了酰胺鍵中新的 C=O 鍵和 N-H 鍵，并且未引入其他新的基團。見圖 5。
圖5
兩組傅里葉紅外光譜圖
Figure5.
Fourier transform infrared spectroscopy of two groups
2.6 細胞毒性檢測
培養后各時間點，交聯組及未交聯組 A 值與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
兩組細胞增殖檢測
Figure6.
The cell proliferations in each group
3 討論
目前，關于魚鰾脫細胞材料的研究較少，EDC/NHS 交聯制備魚鰾膜尚無報道。我們前期預實驗中選擇了草魚及花鰱的魚鰾進行比較，結果發現花鰱魚鰾孔隙大小及密度均優于草魚，故本研究選擇花鰱魚鰾進行實驗。交聯是通過物理或化學方法使膠原蛋白基團發生反應，封閉其裸露在外的活性基團以維持其在植入期間的穩定性，降低免疫原性，增加抗降解性能，提升力學性能[14]。物理方法主要通過紫外光、高熱等處理，使膠原蛋白分子間發生交聯反應。但該方法交聯不徹底，常作為化學交聯的輔助方法。化學方法是利用各種化學試劑，如醛類、EDC、環氧化物等，對膠原進行交聯[15]。國內學者張更申等[16]利用戊二醛對鯉魚魚鰾進行處理后，成功修復兔缺損腦膜，但戊二醛交聯存在醛基殘留等問題。Kumar 等[10]報道用 1，4-丁二醇二縮水甘油醚對魚鰾進行交聯處理并修復皮膚，也存在交聯劑殘留毒性的問題。本研究選擇 EDC 進行交聯處理，與其他化學交聯試劑不同，在交聯過程中 EDC 的作用類似于一種催化劑，催化膠原分子間進行反應，膠原反應后不會引入其他新的基團，而且交聯處理后經 PBS 洗滌，材料無交聯劑殘留。
本研究顯示，魚鰾經交聯后具有疏松多孔結構，有利于細胞遷移生長。與對照組相比，交聯組魚鰾膜拉伸性能得到一定提高，斷裂伸長率降低，提示交聯處理提高了材料的韌性。人體硬膜力學拉伸最大應力為 3～9 MPa，而交聯組材料拉伸強度達（15.91±1.52）MPa，超過人體最大應力范圍。目前市售的天義福生物膜力學性能很弱，有報道甚至未檢測出相關力學指標[17-18]。我們認為該生物膜雖主要成分為Ⅰ型膠原，但其為水解后提純的膠原纖維，水解過程中破壞了原膠原排列結構，導致力學性能差。近年來，隨著電紡技術的發展，有研究聯合Ⅰ型膠原復合高分子聚合物（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸）制備生物膜，結合了膠原良好的生物相容性和聚合物良好的力學性能[18]，早期動物實驗結果良好，但未見長期體內轉歸實驗報道。此外，電紡技術操作復雜，成本較高，也會影響相關生物膜的廣泛應用。
體外降解研究結果顯示，交聯處理顯著提高了魚鰾膜的抗降解性能。既往研究報道魚皮膠原材料的變性溫度約為 30℃，即使通過交聯等方式也難以提升其變性溫度[19]。本研究結果顯示，交聯處理后的魚鰾膜其熱變性溫度為（75.2±1.3）℃，顯著高于人體正常體溫，提示材料熱穩定性也符合人體硬膜修復材料的要求。此外，由于交聯原理是使分子間基團發生反應，因此紅外光譜分析結果顯示新形成的 N-H 鍵、C=O 鍵特征性吸收峰明顯增強，表明交聯起到了催化膠原蛋白裸露的基團發生反應，生成新的酰胺鍵作用。交聯后魚鰾膜接觸角稍增大，我們認為可能是交聯使親水基團發生反應減少所致，但總體未顯著降低膠原親水性[20]。
綜上述，通過脫細胞、EDC/NHS 法處理獲得的魚鰾膜材料具有良好的理化性能，無細胞毒性，有望作為硬膜修復材料。下一步我們將檢測魚鰾膜材料外源性細胞/DNA 的殘留及其生物相容性，為其作為硬膜缺損修復材料提供更多實驗依據。
