引用本文： 張憶, 梁艷, 笪琳萃, 解慧琪. 一種用于復合材料觀察的快速病理制片方法研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(1): 80-84. doi: 10.7507/1002-1892.201806094 復制
結合天然細胞外基質和高分子材料的優點，通過物理或化學的方法將這兩類材料進行復合，制備更符合臨床需求的復合材料，是目前組織工程支架材料的研究熱點[1-3]。這類復合材料已用作食管、神經、腹壁以及心室壁等組織修復重建的支架材料，并取得較好的修復效果[4-6]。我們在前期研究中制備了具有多孔結構的聚氨酯-小腸黏膜下層（polyurethane/small intestinal submucosa，PU/SIS）復合材料，并證實其兼具合成材料和生物源性材料的優點，既具有優異的回彈性能、降解性能，還具有良好的細胞相容性和組織相容性，并能在一定程度上促進血管新生，在組織工程領域具有廣闊的應用前景[7]。在實驗研究中我們發現，傳統的病理制片方法不僅會對高分子合成材料的形態結構造成溶解和破壞，而且無法用于觀察復合材料兩種組分的分布情況。而復合材料中各組分的分布情況對其質量控制以及治療效果有重要意義，尋找一種可行的病理制片方法對這類復合材料進行表征具有重要意義。我們結合前期的制片經驗，摸索出一套簡便快捷的制片方法，該方法不僅可用于觀察復合材料中細胞外基質成分的分布情況，還有望應用于其他含有高分子合成材料的復合材料的組織學評價。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
伊紅（MERCK 公司，德國）；無水乙醇（成都科隆化學品有限公司）；TO 型生物透明劑（廣西岑溪市天興林化有限公司）；中性快干膠（無錫市江原實業技貿總公司）；OCT 冰凍切片包埋劑（Tissue-Tek 公司，美國）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；明場顯微鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 PU/SIS 復合材料的制備
按照文獻［7］方法制備復合材料，具體如下：① 將豬小腸清洗干凈，分離 SIS。經脫脂、脫細胞和低溫粉碎后，過 200 目篩，消毒滅菌備用。② 將聚四氫呋喃 1000（33.33 g，33.33 mmol）、異佛爾酮二異氰酸酯（21.48 g，96.67 mmol）和辛酸亞錫（0.02 mL）加入三口燒瓶中，于 74℃ 油浴鍋中反應 3 h。加入 2，2-二羥甲基丁酸（4.94 g，33.33 mmol）于 54℃ 下反應 3 h。為使反應平穩進行，必要時可使用丙酮調節體系黏度。加入三乙胺（7 mL），在室溫下攪拌 20 min。將反應產物緩慢滴加至丙酮水溶液（丙酮∶去離子水=1∶4）中，以1 300 r/min 攪拌 2 h 得到 PU 乳液。③ 將 0.3 g SIS 粉末加入至 10 g 固含量為 21% 的 PU 乳液中，攪拌 2.5 h。將制備的共混體系倒入模具中，于–80℃低溫冰箱中預凍后，冷凍干燥 24 h。將上述材料浸泡在 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺溶液中，37℃ 下避光反應 36 h。PBS 洗滌 5 次，每次 30 min，再用去離子水洗滌 3 次，凍干備用。
1.3 實驗方法
1.3.1 冰凍切片制備及觀察
將制備的 PU/SIS 復合材料在常溫下置于 PBS，充分復水后浸泡 OCT 包埋劑，用眼科鑷擠壓材料，排除多孔材料內的空氣，在材料恢復形狀過程中 OCT 包埋劑可填充材料多孔空隙，反復數次，待無空氣溢出后進行包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大體觀察切片完整性。
1.3.2 伊紅染色及觀察
將切片置于用 70% 乙醇配制的水溶性伊紅染液（伊紅濃度 1%）中染色 1 min，去離子水快速清洗切片上的多余染料。明場顯微鏡下觀察復合材料上色效果及多孔結構。
1.3.3 封片分組及觀察
根據封片方法不同，將染色后的切片隨機分為 5 組。A 組：用甘油明膠直接濕封；B 組：切片經無水乙醇脫水后，TO 型生物透明劑透明，中性快干膠封片；C 組：切片經去離子水浸泡分色后風干，中性快干膠封片；D 組：切片經風干后，TO 型生物透明劑透明，中性快干膠封片；E 組：切片風干后直接用中性快干膠封片。將各組切片置于明場顯微鏡下觀察復合材料組分分布情況。
2 結果
2.1 冰凍切片大體觀察
實驗制備的復合材料冰凍切片厚度均為 6 μm，大體觀察見切片連續均勻，材料內部空隙被 OCT 包埋劑完全填充，切片內部無空洞出現，保持其完整性。見圖 1。
圖1
PU/SIS 復合材料 OCT 包埋、冰凍切片大體觀察
a. PU/SIS 復合材料；b. OCT 浸泡；c. 制備冰凍切片；d. 裱片后材料連續完整
Figure1. Gross observation of PU/SIS which was OCT-embedded, sliced into sections by frozen section technologya. Composite of PU/SIS; b. OCT-embedded; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous
2.2 伊紅染色后明場顯微鏡觀察
明場顯微鏡觀察示，伊紅染色 1 min 后，復合材料整體顏色鮮紅，輪廓清晰，多孔結構清晰可見，但無法辨認復合材料兩種組分的分布情況。見圖 2。
圖2
伊紅染色后明場顯微鏡觀察
從左至右分別為放大倍數 100、200、400 倍 a. 大孔徑復合材料；b. 小孔徑復合材料
Figure2. Brightfield microscopy observation after dyed with eosinFrom left to right for the amplification of 100, 200, and 400 times, respectively a. Large aperture composite materials; b. Small aperture composite materials
2.3 封片后分組觀察
A 組：復合材料伊紅整體動態褪色，直至灰色透明，最終兩種組分無對比度。B 組：材料輪廓消失，PU 組分溶解變形。C 組：材料輪廓清晰完整，PU 與 SIS 兩種組分同時出現褪色，但褪色程度無明顯差異，能分辨兩種組分分布，但有一定難度。D 組：材料輪廓清晰完整，SIS 顏色鮮紅，PU 褪色至灰色透明，兩者顏色對比度明顯，能清晰顯示組分分布情況。E 組：結果同 D 組一致。見圖 3、4。
圖3
各組大孔徑復合材料封片后明場顯微鏡觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure3. Brightfield microscopy observation of large aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
圖4
各組小孔徑復合材料封片后明場顯微鏡觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. Brightfield microscopy observation of small aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
3 討論
石蠟切片、冰凍切片、HE 染色是病理技術中的常規制片方法，在組織形態學評價方面具有重要作用[8-10]。此外，在組織工程領域，HE 染色還可用于觀察材料的細胞相容性、組織相容性、降解及促進組織再生情況等[11-16]。但常用的石蠟切片方法對于部分合成材料，如本研究中采用的聚氨酯等，因溫度和試劑性質的原因，常無法觀察到完整的材料形態[7]。所以，本實驗選擇低溫且不接觸有機溶劑的冰凍切片方法，保護了復合材料中 PU 的結構完整性[17-19]。考慮到 PU/SIS 復合材料在常溫和–20℃ 條件下具有彈性形變，我們在冰凍切片前對材料進行了預處理，即對材料進行復水和 OCT 浸潤，使其在冰凍切片環境溫度下保持較大的剛度，確保切片厚度準確。染色過程中，伊紅采用低濃度乙醇配制，既可以保護 PU 不受破壞，又能使 SIS 顏色鮮紅明亮，易與 PU 形成對比[20-21]。
在封片處理過程中，A 組是常規的水溶性封片法，但甘油和明膠配制的封片劑極易溶解水溶性較強的伊紅染料，導致整個材料褪色至無色透明。B 組是常規的有機溶劑封片法，但無水乙醇在對切片脫水過程中溶解了 PU，導致材料形態結構被嚴重破壞。鏡下觀察發現，A 組伊紅染料從 PU/SIS 復合材料上褪色的速度有所差異，PU 褪色速度比 SIS 稍快。所以 C 組擬利用伊紅易溶于水的特性，將結合力有差別的兩種組分進行分色[22]。但該方法對分色時間的要求較為嚴格，極難把控，同時由于 SIS 組分的褪色使其呈現淡紅色，兩組分對比度較差。
復合材料經伊紅染色后觀察到 PU 與 SIS 都呈現紅色，說明兩組分都被伊紅染色。但在分色過程中又出現兩組分褪色速度有所差異的現象，考慮伊紅是否對兩組分的染色原理有所不同。SIS 屬于細胞外基質，大量的氨基基團在常溫常壓下很容易與帶負電荷的伊紅形成化學鍵[23-25]。PU 的側鏈基團在常溫常壓下幾乎沒有與伊紅形成化學鍵的可能，分析 PU 能被染色是由于材料空間結構的原因，物理性地吸附了伊紅分子。同時又考慮到伊紅難溶于強非極性的有機溶劑，并且 PU 含有大量的異氰酸酯鍵，具有耐受有機溶劑的特性。所以 D 組通過將切片置于 TO 有機溶劑中透明，與 SIS 結合的伊紅不會溶于有機溶劑，但與 PU 結合的伊紅在透明劑的作用下出現褪色，并且復合材料始終保持形態完好，鏡下能觀察到兩組分具有較高的對比度。E 組采用以二甲苯等強非極性有機試劑為溶劑的中性快干膠進行封片，所以其染色效果與 D 組相近，是操作最為簡便、耗時最短、染色效果最佳的制片方法。
綜上述，本實驗通過冰凍切片、伊紅染色 1 min，風干后直接用中性快干膠封片的方法能對 PU/SIS 復合材料進行組分差異化染色。該方法有望應用于由高分子合成材料與細胞外基質材料制備的復合材料的組織學評價。
結合天然細胞外基質和高分子材料的優點，通過物理或化學的方法將這兩類材料進行復合，制備更符合臨床需求的復合材料，是目前組織工程支架材料的研究熱點[1-3]。這類復合材料已用作食管、神經、腹壁以及心室壁等組織修復重建的支架材料，并取得較好的修復效果[4-6]。我們在前期研究中制備了具有多孔結構的聚氨酯-小腸黏膜下層（polyurethane/small intestinal submucosa，PU/SIS）復合材料，并證實其兼具合成材料和生物源性材料的優點，既具有優異的回彈性能、降解性能，還具有良好的細胞相容性和組織相容性，并能在一定程度上促進血管新生，在組織工程領域具有廣闊的應用前景[7]。在實驗研究中我們發現，傳統的病理制片方法不僅會對高分子合成材料的形態結構造成溶解和破壞，而且無法用于觀察復合材料兩種組分的分布情況。而復合材料中各組分的分布情況對其質量控制以及治療效果有重要意義，尋找一種可行的病理制片方法對這類復合材料進行表征具有重要意義。我們結合前期的制片經驗，摸索出一套簡便快捷的制片方法，該方法不僅可用于觀察復合材料中細胞外基質成分的分布情況，還有望應用于其他含有高分子合成材料的復合材料的組織學評價。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
伊紅（MERCK 公司，德國）；無水乙醇（成都科隆化學品有限公司）；TO 型生物透明劑（廣西岑溪市天興林化有限公司）；中性快干膠（無錫市江原實業技貿總公司）；OCT 冰凍切片包埋劑（Tissue-Tek 公司，美國）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；明場顯微鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 PU/SIS 復合材料的制備
按照文獻［7］方法制備復合材料，具體如下：① 將豬小腸清洗干凈，分離 SIS。經脫脂、脫細胞和低溫粉碎后，過 200 目篩，消毒滅菌備用。② 將聚四氫呋喃 1000（33.33 g，33.33 mmol）、異佛爾酮二異氰酸酯（21.48 g，96.67 mmol）和辛酸亞錫（0.02 mL）加入三口燒瓶中，于 74℃ 油浴鍋中反應 3 h。加入 2，2-二羥甲基丁酸（4.94 g，33.33 mmol）于 54℃ 下反應 3 h。為使反應平穩進行，必要時可使用丙酮調節體系黏度。加入三乙胺（7 mL），在室溫下攪拌 20 min。將反應產物緩慢滴加至丙酮水溶液（丙酮∶去離子水=1∶4）中，以1 300 r/min 攪拌 2 h 得到 PU 乳液。③ 將 0.3 g SIS 粉末加入至 10 g 固含量為 21% 的 PU 乳液中，攪拌 2.5 h。將制備的共混體系倒入模具中，于–80℃低溫冰箱中預凍后，冷凍干燥 24 h。將上述材料浸泡在 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺溶液中，37℃ 下避光反應 36 h。PBS 洗滌 5 次，每次 30 min，再用去離子水洗滌 3 次，凍干備用。
1.3 實驗方法
1.3.1 冰凍切片制備及觀察
將制備的 PU/SIS 復合材料在常溫下置于 PBS，充分復水后浸泡 OCT 包埋劑，用眼科鑷擠壓材料，排除多孔材料內的空氣，在材料恢復形狀過程中 OCT 包埋劑可填充材料多孔空隙，反復數次，待無空氣溢出后進行包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大體觀察切片完整性。
1.3.2 伊紅染色及觀察
將切片置于用 70% 乙醇配制的水溶性伊紅染液（伊紅濃度 1%）中染色 1 min，去離子水快速清洗切片上的多余染料。明場顯微鏡下觀察復合材料上色效果及多孔結構。
1.3.3 封片分組及觀察
根據封片方法不同，將染色后的切片隨機分為 5 組。A 組：用甘油明膠直接濕封；B 組：切片經無水乙醇脫水后，TO 型生物透明劑透明，中性快干膠封片；C 組：切片經去離子水浸泡分色后風干，中性快干膠封片；D 組：切片經風干后，TO 型生物透明劑透明，中性快干膠封片；E 組：切片風干后直接用中性快干膠封片。將各組切片置于明場顯微鏡下觀察復合材料組分分布情況。
2 結果
2.1 冰凍切片大體觀察
實驗制備的復合材料冰凍切片厚度均為 6 μm，大體觀察見切片連續均勻，材料內部空隙被 OCT 包埋劑完全填充，切片內部無空洞出現，保持其完整性。見圖 1。
圖1
PU/SIS 復合材料 OCT 包埋、冰凍切片大體觀察
a. PU/SIS 復合材料；b. OCT 浸泡；c. 制備冰凍切片；d. 裱片后材料連續完整
Figure1. Gross observation of PU/SIS which was OCT-embedded, sliced into sections by frozen section technologya. Composite of PU/SIS; b. OCT-embedded; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous
2.2 伊紅染色后明場顯微鏡觀察
明場顯微鏡觀察示，伊紅染色 1 min 后，復合材料整體顏色鮮紅，輪廓清晰，多孔結構清晰可見，但無法辨認復合材料兩種組分的分布情況。見圖 2。
圖2
伊紅染色后明場顯微鏡觀察
從左至右分別為放大倍數 100、200、400 倍 a. 大孔徑復合材料；b. 小孔徑復合材料
Figure2. Brightfield microscopy observation after dyed with eosinFrom left to right for the amplification of 100, 200, and 400 times, respectively a. Large aperture composite materials; b. Small aperture composite materials
2.3 封片后分組觀察
A 組：復合材料伊紅整體動態褪色，直至灰色透明，最終兩種組分無對比度。B 組：材料輪廓消失，PU 組分溶解變形。C 組：材料輪廓清晰完整，PU 與 SIS 兩種組分同時出現褪色，但褪色程度無明顯差異，能分辨兩種組分分布，但有一定難度。D 組：材料輪廓清晰完整，SIS 顏色鮮紅，PU 褪色至灰色透明，兩者顏色對比度明顯，能清晰顯示組分分布情況。E 組：結果同 D 組一致。見圖 3、4。
圖3
各組大孔徑復合材料封片后明場顯微鏡觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure3. Brightfield microscopy observation of large aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
圖4
各組小孔徑復合材料封片后明場顯微鏡觀察（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. Brightfield microscopy observation of small aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
3 討論
石蠟切片、冰凍切片、HE 染色是病理技術中的常規制片方法，在組織形態學評價方面具有重要作用[8-10]。此外，在組織工程領域，HE 染色還可用于觀察材料的細胞相容性、組織相容性、降解及促進組織再生情況等[11-16]。但常用的石蠟切片方法對于部分合成材料，如本研究中采用的聚氨酯等，因溫度和試劑性質的原因，常無法觀察到完整的材料形態[7]。所以，本實驗選擇低溫且不接觸有機溶劑的冰凍切片方法，保護了復合材料中 PU 的結構完整性[17-19]。考慮到 PU/SIS 復合材料在常溫和–20℃ 條件下具有彈性形變，我們在冰凍切片前對材料進行了預處理，即對材料進行復水和 OCT 浸潤，使其在冰凍切片環境溫度下保持較大的剛度，確保切片厚度準確。染色過程中，伊紅采用低濃度乙醇配制，既可以保護 PU 不受破壞，又能使 SIS 顏色鮮紅明亮，易與 PU 形成對比[20-21]。
在封片處理過程中，A 組是常規的水溶性封片法，但甘油和明膠配制的封片劑極易溶解水溶性較強的伊紅染料，導致整個材料褪色至無色透明。B 組是常規的有機溶劑封片法，但無水乙醇在對切片脫水過程中溶解了 PU，導致材料形態結構被嚴重破壞。鏡下觀察發現，A 組伊紅染料從 PU/SIS 復合材料上褪色的速度有所差異，PU 褪色速度比 SIS 稍快。所以 C 組擬利用伊紅易溶于水的特性，將結合力有差別的兩種組分進行分色[22]。但該方法對分色時間的要求較為嚴格，極難把控，同時由于 SIS 組分的褪色使其呈現淡紅色，兩組分對比度較差。
復合材料經伊紅染色后觀察到 PU 與 SIS 都呈現紅色，說明兩組分都被伊紅染色。但在分色過程中又出現兩組分褪色速度有所差異的現象，考慮伊紅是否對兩組分的染色原理有所不同。SIS 屬于細胞外基質，大量的氨基基團在常溫常壓下很容易與帶負電荷的伊紅形成化學鍵[23-25]。PU 的側鏈基團在常溫常壓下幾乎沒有與伊紅形成化學鍵的可能，分析 PU 能被染色是由于材料空間結構的原因，物理性地吸附了伊紅分子。同時又考慮到伊紅難溶于強非極性的有機溶劑，并且 PU 含有大量的異氰酸酯鍵，具有耐受有機溶劑的特性。所以 D 組通過將切片置于 TO 有機溶劑中透明，與 SIS 結合的伊紅不會溶于有機溶劑，但與 PU 結合的伊紅在透明劑的作用下出現褪色，并且復合材料始終保持形態完好，鏡下能觀察到兩組分具有較高的對比度。E 組采用以二甲苯等強非極性有機試劑為溶劑的中性快干膠進行封片，所以其染色效果與 D 組相近，是操作最為簡便、耗時最短、染色效果最佳的制片方法。
綜上述，本實驗通過冰凍切片、伊紅染色 1 min，風干后直接用中性快干膠封片的方法能對 PU/SIS 復合材料進行組分差異化染色。該方法有望應用于由高分子合成材料與細胞外基質材料制備的復合材料的組織學評價。
