引用本文： 何宏燕, 郜彭陽, 喬忠乾, 屈雪, 劉昌勝. 鈦金屬表面微納結構協同抗菌肽的抗菌性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(9): 1116-1122. doi: 10.7507/1002-1892.201805022 復制
近年來由于植入器械（如骨科材料和牙種植體）的鈦材化，使得鈦基材植入器械的國產化成為研究熱點[1-5]。鈦及其合金植入人體后，極易引起細菌等微生物在其表面黏附，從而導致感染的發生。感染一旦出現，可能引起局部組織破壞和植入物失效，也可能導致嚴重的疾病和并發癥。感染和炎癥的發生主要與細菌在植入體表面形成生物膜有關，生物膜的形成顯著增強了膜內細菌對機體免疫系統、抗生素以及化學殺菌劑的抵抗力[6-8]，細菌生物膜類感染的根除極具挑戰性。因此，抑制感染的重點集中在避免細菌生物膜的形成，減少細菌污染的可能和完善生物材料表面的性能。有學者提出，生物植入材料表面需具備抗細菌黏附和持久的抗菌性能[9-10]。賦予金屬植入材料抑菌、抗菌能力的常用方法有兩種：調控材料表面的理化性質來抑制細菌的黏附；采用物理共混、表面涂覆、化學鍵合等方式加載抗生素/抗菌元素[11-12]。抗生素的應用受限于細菌的耐藥性[13-14]，抗菌元素如納米銀[15]和抗菌肽[16-17]由于具有廣譜高效的抗菌活性成為研究熱點。
抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子多肽，其耐熱、耐酸性強，水溶性好，具有高速的殺菌能力和廣譜的抗菌活性。已有學者采用物理吸附、層層自組裝或聚多巴胺鍵合的方法將抗菌肽載至鈦片表面[18-20]，使鈦片具有抗菌作用。相比抗生素和納米銀而言，抗菌肽的價格相對較高，如何高效又便捷地將抗菌肽載于金屬表面顯得尤為重要。本研究采用于材料表面制備微納結構與涂覆抗菌肽相結合的策略，以期實現鈦植入材料有效、持久的抗菌效果。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
鈦片由威海威高潔麗康生物材料有限公司提供，為直徑 10 mm、厚 1 mm 的圓片。無水乙醇、丙酮、鹽酸、NaOH、氯化鈉、無水乙醇（分析純）、2.5% 戊二醛溶液（上海凌峰化學試劑有限公司）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心）；營養肉湯（上海創賽科技有限公司）。
高溫馬弗爐（河南鑫科儀器有限公司）；恒溫干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）；AL104 電子天平［梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司］；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；DHP-9012 恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；S4800 場發射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；QUANTAX 400-30 型能譜儀（Bruker AXS 公司，德國）；SPECTRAmax 84 酶標儀（Molecular Devices 公司，美國）；KW-4B 臺式勻膠儀（北京賽德凱斯電子有限公司）。
1.2 鈦片表面微納結構制備
① 鈦片表面前處理：取鈦片行噴砂酸蝕（sandblasted large-grit acid-etched，SLA）處理后，分別用去離子水、無水乙醇、丙酮超聲清洗表面 20 min，除去表面油污和雜質，再用去離子水清洗后烘干備用。② 鈦片表面納米結構化：將 SLA 處理后的鈦片進一步行堿熱處理（alkali-heat treatment，AHT）。在錐形瓶中配制 5 mol/L NaOH 溶液 200 mL，放入 SLA 處理后的鈦片，超聲 2 min 除去材料表面氣泡，然后放入 60℃ 恒溫箱中 24 h，取出后去離子水清洗 3 次，37℃ 下干燥 48 h。將堿蝕后的材料裝進坩堝中，放入馬弗爐，以 5℃/min 速率從室溫升溫至 600℃，保持 60 min，最后自然降至室溫。各步驟處理后，采用掃描電鏡觀察鈦片表面改變情況。
1.3 鈦片抗菌表面的制備
稱取 8 mg 依據文獻[17]方法合成的抗菌肽，用 4 mL 超純水溶解，制成濃度為 2 mg/mL 的抗菌肽聚合物溶液。將臺式勻膠儀置于超凈臺中，用鑷子夾取 1.2 中經 SLA+AHT 處理后的鈦片放置在勻膠儀轉盤上，打開真空泵開關，按下固定按鈕，樣品固定在轉盤上。將抗菌肽聚合物溶液滴至鈦片上，設定轉盤轉速為 80 r/min，2 min 后待表面液體鋪展均勻，提高轉速至 200 r/min，1 min 后取下樣品，置于 24 孔板內，確認旋涂處理的樣品表面朝上。按照以上方法制備表面載有 10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片，備用。
1.4 鈦片表面的特性表征
取載有 10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片，噴金 30 s 后掃描電鏡觀察表面形貌，電壓 10.0 kV。同時采用能譜儀對鈦片表面進行元素分析，選取樣品中心區域，記錄 C、N、O、Ti 4 種元素含量比例。
1.5 鈦片抑菌及抗菌性能評價
1.5.1 抑菌圈實驗
將 200 μL 1×106CFU/mL 金黃色葡萄球菌菌液滴在固體瓊脂平板上，L 型涂布棒均勻涂抹，將載有不同抗菌肽聚合物（10、30、50、70、90 μg）的鈦片置于瓊脂層上，旋涂處理面向下。于 37℃ 恒溫培養箱內培養 24 h 后取出，觀察抑菌圈形成情況，并用刻度尺測量抑菌圈直徑，各取 3 個樣本進行測量。
1.5.2 滴液染菌實驗
將處理前、SLA 處理、SLA+ AHT 處理、載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片樣品分別置于 24 孔板中，旋涂處理面朝上。分別將 50 μL 1×107CFU/mL 大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌菌液滴加至樣品表面，將樣品孔周圍所有孔內加入 1 mL 生理鹽水，置于 37℃ 恒溫培養箱培養 3 h。取出樣品，1 mL 生理鹽水沖洗，置于 2.5% 戊二醛溶液浸泡 20 min，超純水清洗，50%、60%、75%、85%、100% 乙醇脫水，干燥，掃描電鏡下觀察兩種細菌在鈦片表面的黏附情況，并計算表面細菌黏附數量。各取 3 個樣本進行檢測。
1.5.3 菌懸液濃度測定
將處理前、SLA 處理、SLA+AHT 處理、載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片置于 24 孔板中，旋涂處理面朝上。分別將 50 μL 1×107 CFU/mL 大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液滴加至樣品表面，加入 950 μL 營養肉湯緩慢混合均勻后，置于 37℃ 恒溫培養箱培養 3、6、9、12、24 h 后，采用酶標儀測定菌液的吸光度（ A ）值。以未加鈦片的 50 μL 1×107CFU/mL 菌液和 950 μL 營養肉湯的混合液作為空白對照。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 JMP 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 鈦片表面形貌及特性表征
2.1.1 表面形貌
掃描電鏡觀察，處理前的鈦片表面平整，金屬加工紋路清晰可見； SLA 處理后的鈦片表面遍布二級孔洞結構，孔徑分別為 2～5 μm 和 20～30 μm；SLA+AHT 處理后鈦片表面在維持一定微米結構基礎上，遍布孔徑約 200 nm 的納米壁薄孔洞，與“泡發銀耳”結構類似，提示采用 SLA+AHT 處理方法可在鈦片表面構建包含微米及納米級孔洞的多級結構（圖 1、2）。
采用旋涂方式將抗菌肽聚合物均勻地涂覆于 SLA+AHT 處理后的鈦片表面，與未涂覆抗菌肽聚合物的鈦片相比，鈦片表面孔壁明顯增厚，表面孔徑<200 nm 的孔洞幾乎被抗菌肽覆蓋，孔徑>500 nm 的孔洞結構仍保留。提示通過旋涂方式可以將抗菌聚合物涂覆至納米尺度的孔洞中（圖 3）。
2.1.2 表面特性表征
抗菌肽的特征元素是 C、N。元素分析顯示，隨著抗菌肽聚合物旋涂量的增加，C 元素含量不斷增加；其中，50、70、90 μg 鈦片的 C 含量明顯大于 10、30 μg 鈦片，70、90 μg 鈦片大于 50 μg 鈦片，90 μg 鈦片大于 70 μg 鈦片，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。而直至抗菌肽聚合物旋涂量達 70 μg 時才檢測到微量 N 元素，當含量增加到 90 μg 時，N 元素含量略有增加，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.2 抑菌及抗菌性能評價
2.2.1 抑菌圈實驗
培養 24 h，與對照樣品（0 μg）相比，載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片周圍均表現出明顯抑菌圈，且抑菌圈隨著抗菌肽聚合物量的增加而擴大。其中，50、70、90 μg 鈦片抑菌圈直徑明顯大于 10、30 μg 鈦片，70、90 μg 鈦片大于 50 μg 鈦片，90 μg 鈦片大于 70 μg 鈦片，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
2.2.2 滴液染菌實驗
掃描電鏡下觀察，處理前以及 SLA+AHT 處理后的鈦片表面留存的金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌均較少，而 SLA 處理后的鈦片表面黏附了大量細菌。載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片表面僅有極少量金黃色葡萄球菌，幾乎未見到大腸桿菌；并且黏附的金黃色葡萄球菌表面出現褶皺，提示細菌為死亡狀態，在后續處理中脫水變形（圖 6）。各鈦片表面兩種細菌黏附數量見圖 7。相比于處理前鈦片，SLA 處理后的鈦片表面兩種細菌黏附數量明顯增加，載抗菌肽聚合物的鈦片表面明顯減少；相比于 SLA 處理后鈦片，SLA+AHT 處理后和載抗菌肽聚合物的鈦片表面細菌黏附量明顯減少；載抗菌肽聚合物的鈦片表面細菌黏附量較 SLA+AHT 處理后鈦片明顯減少；以上比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 菌液濃度測定
金黃色葡萄球菌觀察：隨培養時間延長，空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片菌液的 A 值明顯增加，提示金黃色葡萄球菌數目增多，但 12 h 后 A 值增加趨勢減緩；而隨培養時間增加，載抗菌肽聚合物鈦片菌液的 A 值僅略增加，提示金黃色葡萄球菌數量無明顯增加。除培養 3 h 外，其余各時間點空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05），但均高于載有抗菌肽聚合物的鈦片（P<0.05）。見圖 8a。
大腸桿菌觀察：隨培養時間延長，空白菌液、處理前、SLA+AHT 處理后以及載抗菌肽聚合物鈦片菌液 A 值總體呈增加趨勢，其中 SLA 處理后和載抗菌肽聚合物鈦片的 A 值先增加，至 12 h 后減少。培養 3、6、9 h，空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片的 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。12 h，SLA 處理后鈦片菌液A 值最高、載抗菌肽聚合物鈦片最低，與其他組比較差異有統計學意義（P<0.05）；而 SLA+AHT 處理后鈦片低于處理前鈦片和空白菌液（P<0.05），處理前鈦片和空白菌液間比較差異無統計學意義（P>0.05）。24 h，空白菌液、處理前、SLA 處理后鈦片的A 值差異無統計學意義（P>0.05），高于 SLA+AHT 處理及載抗菌肽聚合物鈦片（P<0.05）；而 SLA+AHT 處理后鈦片高于載抗菌肽聚合物鈦片（P<0.05）。見圖 8b。
3 討論
為避免植入材料相關感染的發生，一方面要保證植入過程中嚴格遵守無菌原則，另一方面則應改善材料的表面性能，進而掐斷生物膜形成的源頭。植入材料表面的抗菌改性包含減少甚至避免細菌的黏附和有效地殺死細菌兩方面。前者可以通過改變材料表面的物化性質（如親水性、吸水率、表面自由能、表面潤濕性）、表面電性質（表面電荷、ζ 電位）、表面形貌等來抑制細菌的黏附；后者則需要在表面引入抗菌分子（如金屬離子、抗生素類、非抗生素類有機分子）[13-14, 18-21]。
SLA 處理有利于材料表面粗糙化和微米孔洞的形成，進而利于成骨細胞的黏附、增殖和分化[22]。同時，表面的粗糙化結構及疏水特性（接觸角約為 110°）明顯地增強了細菌的黏附。為了維持材料表面與成骨細胞的緊密接觸，同時又減少細菌的黏附，表面親疏水特性調控是最為簡便的方式。聚乙二醇是目前研究較多的親水化合物，已有研究表明，密集的聚乙二醇鏈具有高度親水性，能在生物材料表面形成空間和滲透壓屏障，能有效地減少細菌的吸附 [7, 23-24]。本研究采用了 AHT 處理方式進行納米結構的構建和親水化調控，處理后表面呈現超親水特性（去離子水滴加于表面立刻浸潤平鋪），鈦片表面金黃色葡萄球菌和大腸桿菌黏附數量比 SLA 處理后鈦片表面的黏附量有不同程度減少。但是，SLA+AHT 處理后鈦片表面對溶液中大腸桿菌的增長有一定的抑制作用，表現為 SLA+AHT 處理后鈦片樣品 A 值明顯低于空白菌液、處理前、SLA 處理后鈦片樣品；SLA+AHT 處理后鈦片表面對溶液中金黃色葡萄球菌的增殖沒有顯著作用，空白菌液、處理前、SLA 處理以及 SLA+AHT 處理后鈦片樣品的 A 值無統計學差異。由此可見，AHT 處理對降低細菌的表面黏附量具有顯著作用，但是很難殺死細菌懸液中細菌，僅僅依靠表面親疏水性的調控很難掐斷生物膜形成的源頭。因此，本研究在對鈦片表面進行納米結構調控外，結合了旋涂抗菌肽的策略。
抗菌肽的合成、應用及其抗菌機制是近期研究的熱點之一，陽離子抗菌肽接枝到鈦金屬材料表面或將聚乙二醇-賴氨酸自組裝到鈦金屬材料表面均賦予其明顯抗菌作用。本研究采用的抗菌肽具有陽離子單元、親疏水性可控的特性。抗菌鈦片樣品制備過程中，當涂覆量<50 μg 時，旋涂過程抗菌肽聚合物溶液幾乎沒有損失（沒有溶液甩落在樣品表面以外）。當超過該劑量時，每增加 10 μg 溶液，體積都會有少許離心損失，當旋涂量增加到 100 μg 時，離心損失量不可忽略。因此，后續實驗中我們選擇鈦片表面最大旋涂量為 90 μg。SLA 和 AHT 處理處理后，成功在鈦片表面構建了微米、納米多級結構，旋涂抗菌肽聚合物溶液后可以將其加載于納米孔洞中。不僅如此，具有陽離子單元的抗菌肽與 AHT 的負電表面有較強的靜電作用。因此，載有抗菌肽聚合物的鈦片表面表現出顯著的殺菌作用，載抗菌肽聚合物鈦片樣品A 值顯著低于其他處理后鈦片。相比 SLA 處理和 SLA+AHT 處理后鈦片，載有抗菌肽聚合物的鈦片不僅表現出良好的減少細菌黏附作用，同時也表現出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的優良抑制作用。
綜上述，采用 SLA 和 AHT 處理方法，有效地增強了鈦片表面親水性，一定程度上阻止大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的黏附；通過旋涂方法在納米結構表面成功裝載抗菌肽，其在瓊脂中和菌液中均有良好的釋放和擴散，殺菌效果明顯。表明通過調控材料表面結構及結合抗菌肽的策略可以有效地減少或避免植入材料表面細菌生物膜的形成。
圖1
不同處理后鈦片表面大體觀察
a. 處理前；b. SLA 處理后；c. SLA+AHT 處理后
Figure1. The macroscopic observation of the Ti disks after different treatmentsa. Untreated; b. After SLA treatment; c. After SLA+AHT treatment
圖2
掃描電鏡觀察不同處理后鈦片表面形貌
a. 處理前（×1 000）；b. SLA 處理后（×10 k）；c. SLA+AHT 處理后（×10 k）
Figure2. Surface morphology of the Ti disks observed by SEMa. Untreated (×1 000); b. After SLA treatment (×10 k); c. After SLA+AHT treatment (×10 k)
圖3
掃描電鏡觀察抗菌肽聚合物涂覆前后鈦片表面形貌
左：旋涂前；右：旋涂后 a. ×2 000；b. ×80 k
Figure3. Surface morphology of the Ti disks observed by SEMLeft: Before spin-coating; Right: After spin-coating a. ×2 000; b. ×80 k
圖4
載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片表面元素含量分析
Figure4.
EDS analysis on the Ti disks with different AMPs loading after SLA+AHT treatment
圖5
培養 24 h 后載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片周圍抑菌圈觀察
a～f. 載有 0、10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片抑菌圈；g. 抑菌圈直徑比較
Figure5. Observation of the inhibition zone on the Ti disks with different AMPs loading after 24 hours culturea～f. 0, 10, 30, 50, 70, and 90 μg-loaded samples; g. Diameter comparison of the inhibition zone
圖6
掃描電鏡觀察不同處理后鈦片表面的細菌黏附情況（×10 k）
從左至右分別為處理前、SLA 處理、SLA+AHT 處理、載抗菌肽聚合物鈦片 a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure6. Observation of bacterial attachment on Ti disks surfaces with different treatments (×10 k)From left to right for untreated, SLA treatment, SLA+AHT treatment, and AMP-loaded Ti disks a. Attachment of S. aureus; b. Attachment of E. coli
圖7
不同處理后鈦片表面的兩種細菌黏附量比較
Figure7.
Bacterial amounts attached on the different Ti disks
圖8
兩種菌液不同時間點 A 值比較
a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure8. Comparison of A values of bacterial solutions with immersed different Ti disksa. S. aureus; b. E.coli
近年來由于植入器械（如骨科材料和牙種植體）的鈦材化，使得鈦基材植入器械的國產化成為研究熱點[1-5]。鈦及其合金植入人體后，極易引起細菌等微生物在其表面黏附，從而導致感染的發生。感染一旦出現，可能引起局部組織破壞和植入物失效，也可能導致嚴重的疾病和并發癥。感染和炎癥的發生主要與細菌在植入體表面形成生物膜有關，生物膜的形成顯著增強了膜內細菌對機體免疫系統、抗生素以及化學殺菌劑的抵抗力[6-8]，細菌生物膜類感染的根除極具挑戰性。因此，抑制感染的重點集中在避免細菌生物膜的形成，減少細菌污染的可能和完善生物材料表面的性能。有學者提出，生物植入材料表面需具備抗細菌黏附和持久的抗菌性能[9-10]。賦予金屬植入材料抑菌、抗菌能力的常用方法有兩種：調控材料表面的理化性質來抑制細菌的黏附；采用物理共混、表面涂覆、化學鍵合等方式加載抗生素/抗菌元素[11-12]。抗生素的應用受限于細菌的耐藥性[13-14]，抗菌元素如納米銀[15]和抗菌肽[16-17]由于具有廣譜高效的抗菌活性成為研究熱點。
抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子多肽，其耐熱、耐酸性強，水溶性好，具有高速的殺菌能力和廣譜的抗菌活性。已有學者采用物理吸附、層層自組裝或聚多巴胺鍵合的方法將抗菌肽載至鈦片表面[18-20]，使鈦片具有抗菌作用。相比抗生素和納米銀而言，抗菌肽的價格相對較高，如何高效又便捷地將抗菌肽載于金屬表面顯得尤為重要。本研究采用于材料表面制備微納結構與涂覆抗菌肽相結合的策略，以期實現鈦植入材料有效、持久的抗菌效果。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
鈦片由威海威高潔麗康生物材料有限公司提供，為直徑 10 mm、厚 1 mm 的圓片。無水乙醇、丙酮、鹽酸、NaOH、氯化鈉、無水乙醇（分析純）、2.5% 戊二醛溶液（上海凌峰化學試劑有限公司）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心）；營養肉湯（上海創賽科技有限公司）。
高溫馬弗爐（河南鑫科儀器有限公司）；恒溫干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）；AL104 電子天平［梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司］；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；DHP-9012 恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；S4800 場發射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；QUANTAX 400-30 型能譜儀（Bruker AXS 公司，德國）；SPECTRAmax 84 酶標儀（Molecular Devices 公司，美國）；KW-4B 臺式勻膠儀（北京賽德凱斯電子有限公司）。
1.2 鈦片表面微納結構制備
① 鈦片表面前處理：取鈦片行噴砂酸蝕（sandblasted large-grit acid-etched，SLA）處理后，分別用去離子水、無水乙醇、丙酮超聲清洗表面 20 min，除去表面油污和雜質，再用去離子水清洗后烘干備用。② 鈦片表面納米結構化：將 SLA 處理后的鈦片進一步行堿熱處理（alkali-heat treatment，AHT）。在錐形瓶中配制 5 mol/L NaOH 溶液 200 mL，放入 SLA 處理后的鈦片，超聲 2 min 除去材料表面氣泡，然后放入 60℃ 恒溫箱中 24 h，取出后去離子水清洗 3 次，37℃ 下干燥 48 h。將堿蝕后的材料裝進坩堝中，放入馬弗爐，以 5℃/min 速率從室溫升溫至 600℃，保持 60 min，最后自然降至室溫。各步驟處理后，采用掃描電鏡觀察鈦片表面改變情況。
1.3 鈦片抗菌表面的制備
稱取 8 mg 依據文獻[17]方法合成的抗菌肽，用 4 mL 超純水溶解，制成濃度為 2 mg/mL 的抗菌肽聚合物溶液。將臺式勻膠儀置于超凈臺中，用鑷子夾取 1.2 中經 SLA+AHT 處理后的鈦片放置在勻膠儀轉盤上，打開真空泵開關，按下固定按鈕，樣品固定在轉盤上。將抗菌肽聚合物溶液滴至鈦片上，設定轉盤轉速為 80 r/min，2 min 后待表面液體鋪展均勻，提高轉速至 200 r/min，1 min 后取下樣品，置于 24 孔板內，確認旋涂處理的樣品表面朝上。按照以上方法制備表面載有 10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片，備用。
1.4 鈦片表面的特性表征
取載有 10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片，噴金 30 s 后掃描電鏡觀察表面形貌，電壓 10.0 kV。同時采用能譜儀對鈦片表面進行元素分析，選取樣品中心區域，記錄 C、N、O、Ti 4 種元素含量比例。
1.5 鈦片抑菌及抗菌性能評價
1.5.1 抑菌圈實驗
將 200 μL 1×106CFU/mL 金黃色葡萄球菌菌液滴在固體瓊脂平板上，L 型涂布棒均勻涂抹，將載有不同抗菌肽聚合物（10、30、50、70、90 μg）的鈦片置于瓊脂層上，旋涂處理面向下。于 37℃ 恒溫培養箱內培養 24 h 后取出，觀察抑菌圈形成情況，并用刻度尺測量抑菌圈直徑，各取 3 個樣本進行測量。
1.5.2 滴液染菌實驗
將處理前、SLA 處理、SLA+ AHT 處理、載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片樣品分別置于 24 孔板中，旋涂處理面朝上。分別將 50 μL 1×107CFU/mL 大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌菌液滴加至樣品表面，將樣品孔周圍所有孔內加入 1 mL 生理鹽水，置于 37℃ 恒溫培養箱培養 3 h。取出樣品，1 mL 生理鹽水沖洗，置于 2.5% 戊二醛溶液浸泡 20 min，超純水清洗，50%、60%、75%、85%、100% 乙醇脫水，干燥，掃描電鏡下觀察兩種細菌在鈦片表面的黏附情況，并計算表面細菌黏附數量。各取 3 個樣本進行檢測。
1.5.3 菌懸液濃度測定
將處理前、SLA 處理、SLA+AHT 處理、載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片置于 24 孔板中，旋涂處理面朝上。分別將 50 μL 1×107 CFU/mL 大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液滴加至樣品表面，加入 950 μL 營養肉湯緩慢混合均勻后，置于 37℃ 恒溫培養箱培養 3、6、9、12、24 h 后，采用酶標儀測定菌液的吸光度（ A ）值。以未加鈦片的 50 μL 1×107CFU/mL 菌液和 950 μL 營養肉湯的混合液作為空白對照。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 JMP 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 鈦片表面形貌及特性表征
2.1.1 表面形貌
掃描電鏡觀察，處理前的鈦片表面平整，金屬加工紋路清晰可見； SLA 處理后的鈦片表面遍布二級孔洞結構，孔徑分別為 2～5 μm 和 20～30 μm；SLA+AHT 處理后鈦片表面在維持一定微米結構基礎上，遍布孔徑約 200 nm 的納米壁薄孔洞，與“泡發銀耳”結構類似，提示采用 SLA+AHT 處理方法可在鈦片表面構建包含微米及納米級孔洞的多級結構（圖 1、2）。
采用旋涂方式將抗菌肽聚合物均勻地涂覆于 SLA+AHT 處理后的鈦片表面，與未涂覆抗菌肽聚合物的鈦片相比，鈦片表面孔壁明顯增厚，表面孔徑<200 nm 的孔洞幾乎被抗菌肽覆蓋，孔徑>500 nm 的孔洞結構仍保留。提示通過旋涂方式可以將抗菌聚合物涂覆至納米尺度的孔洞中（圖 3）。
2.1.2 表面特性表征
抗菌肽的特征元素是 C、N。元素分析顯示，隨著抗菌肽聚合物旋涂量的增加，C 元素含量不斷增加；其中，50、70、90 μg 鈦片的 C 含量明顯大于 10、30 μg 鈦片，70、90 μg 鈦片大于 50 μg 鈦片，90 μg 鈦片大于 70 μg 鈦片，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。而直至抗菌肽聚合物旋涂量達 70 μg 時才檢測到微量 N 元素，當含量增加到 90 μg 時，N 元素含量略有增加，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.2 抑菌及抗菌性能評價
2.2.1 抑菌圈實驗
培養 24 h，與對照樣品（0 μg）相比，載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片周圍均表現出明顯抑菌圈，且抑菌圈隨著抗菌肽聚合物量的增加而擴大。其中，50、70、90 μg 鈦片抑菌圈直徑明顯大于 10、30 μg 鈦片，70、90 μg 鈦片大于 50 μg 鈦片，90 μg 鈦片大于 70 μg 鈦片，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
2.2.2 滴液染菌實驗
掃描電鏡下觀察，處理前以及 SLA+AHT 處理后的鈦片表面留存的金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌均較少，而 SLA 處理后的鈦片表面黏附了大量細菌。載有 90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片表面僅有極少量金黃色葡萄球菌，幾乎未見到大腸桿菌；并且黏附的金黃色葡萄球菌表面出現褶皺，提示細菌為死亡狀態，在后續處理中脫水變形（圖 6）。各鈦片表面兩種細菌黏附數量見圖 7。相比于處理前鈦片，SLA 處理后的鈦片表面兩種細菌黏附數量明顯增加，載抗菌肽聚合物的鈦片表面明顯減少；相比于 SLA 處理后鈦片，SLA+AHT 處理后和載抗菌肽聚合物的鈦片表面細菌黏附量明顯減少；載抗菌肽聚合物的鈦片表面細菌黏附量較 SLA+AHT 處理后鈦片明顯減少；以上比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 菌液濃度測定
金黃色葡萄球菌觀察：隨培養時間延長，空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片菌液的 A 值明顯增加，提示金黃色葡萄球菌數目增多，但 12 h 后 A 值增加趨勢減緩；而隨培養時間增加，載抗菌肽聚合物鈦片菌液的 A 值僅略增加，提示金黃色葡萄球菌數量無明顯增加。除培養 3 h 外，其余各時間點空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05），但均高于載有抗菌肽聚合物的鈦片（P<0.05）。見圖 8a。
大腸桿菌觀察：隨培養時間延長，空白菌液、處理前、SLA+AHT 處理后以及載抗菌肽聚合物鈦片菌液 A 值總體呈增加趨勢，其中 SLA 處理后和載抗菌肽聚合物鈦片的 A 值先增加，至 12 h 后減少。培養 3、6、9 h，空白菌液、處理前、SLA 處理后以及 SLA+AHT 處理后鈦片的 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。12 h，SLA 處理后鈦片菌液A 值最高、載抗菌肽聚合物鈦片最低，與其他組比較差異有統計學意義（P<0.05）；而 SLA+AHT 處理后鈦片低于處理前鈦片和空白菌液（P<0.05），處理前鈦片和空白菌液間比較差異無統計學意義（P>0.05）。24 h，空白菌液、處理前、SLA 處理后鈦片的A 值差異無統計學意義（P>0.05），高于 SLA+AHT 處理及載抗菌肽聚合物鈦片（P<0.05）；而 SLA+AHT 處理后鈦片高于載抗菌肽聚合物鈦片（P<0.05）。見圖 8b。
3 討論
為避免植入材料相關感染的發生，一方面要保證植入過程中嚴格遵守無菌原則，另一方面則應改善材料的表面性能，進而掐斷生物膜形成的源頭。植入材料表面的抗菌改性包含減少甚至避免細菌的黏附和有效地殺死細菌兩方面。前者可以通過改變材料表面的物化性質（如親水性、吸水率、表面自由能、表面潤濕性）、表面電性質（表面電荷、ζ 電位）、表面形貌等來抑制細菌的黏附；后者則需要在表面引入抗菌分子（如金屬離子、抗生素類、非抗生素類有機分子）[13-14, 18-21]。
SLA 處理有利于材料表面粗糙化和微米孔洞的形成，進而利于成骨細胞的黏附、增殖和分化[22]。同時，表面的粗糙化結構及疏水特性（接觸角約為 110°）明顯地增強了細菌的黏附。為了維持材料表面與成骨細胞的緊密接觸，同時又減少細菌的黏附，表面親疏水特性調控是最為簡便的方式。聚乙二醇是目前研究較多的親水化合物，已有研究表明，密集的聚乙二醇鏈具有高度親水性，能在生物材料表面形成空間和滲透壓屏障，能有效地減少細菌的吸附 [7, 23-24]。本研究采用了 AHT 處理方式進行納米結構的構建和親水化調控，處理后表面呈現超親水特性（去離子水滴加于表面立刻浸潤平鋪），鈦片表面金黃色葡萄球菌和大腸桿菌黏附數量比 SLA 處理后鈦片表面的黏附量有不同程度減少。但是，SLA+AHT 處理后鈦片表面對溶液中大腸桿菌的增長有一定的抑制作用，表現為 SLA+AHT 處理后鈦片樣品 A 值明顯低于空白菌液、處理前、SLA 處理后鈦片樣品；SLA+AHT 處理后鈦片表面對溶液中金黃色葡萄球菌的增殖沒有顯著作用，空白菌液、處理前、SLA 處理以及 SLA+AHT 處理后鈦片樣品的 A 值無統計學差異。由此可見，AHT 處理對降低細菌的表面黏附量具有顯著作用，但是很難殺死細菌懸液中細菌，僅僅依靠表面親疏水性的調控很難掐斷生物膜形成的源頭。因此，本研究在對鈦片表面進行納米結構調控外，結合了旋涂抗菌肽的策略。
抗菌肽的合成、應用及其抗菌機制是近期研究的熱點之一，陽離子抗菌肽接枝到鈦金屬材料表面或將聚乙二醇-賴氨酸自組裝到鈦金屬材料表面均賦予其明顯抗菌作用。本研究采用的抗菌肽具有陽離子單元、親疏水性可控的特性。抗菌鈦片樣品制備過程中，當涂覆量<50 μg 時，旋涂過程抗菌肽聚合物溶液幾乎沒有損失（沒有溶液甩落在樣品表面以外）。當超過該劑量時，每增加 10 μg 溶液，體積都會有少許離心損失，當旋涂量增加到 100 μg 時，離心損失量不可忽略。因此，后續實驗中我們選擇鈦片表面最大旋涂量為 90 μg。SLA 和 AHT 處理處理后，成功在鈦片表面構建了微米、納米多級結構，旋涂抗菌肽聚合物溶液后可以將其加載于納米孔洞中。不僅如此，具有陽離子單元的抗菌肽與 AHT 的負電表面有較強的靜電作用。因此，載有抗菌肽聚合物的鈦片表面表現出顯著的殺菌作用，載抗菌肽聚合物鈦片樣品A 值顯著低于其他處理后鈦片。相比 SLA 處理和 SLA+AHT 處理后鈦片，載有抗菌肽聚合物的鈦片不僅表現出良好的減少細菌黏附作用，同時也表現出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的優良抑制作用。
綜上述，采用 SLA 和 AHT 處理方法，有效地增強了鈦片表面親水性，一定程度上阻止大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的黏附；通過旋涂方法在納米結構表面成功裝載抗菌肽，其在瓊脂中和菌液中均有良好的釋放和擴散，殺菌效果明顯。表明通過調控材料表面結構及結合抗菌肽的策略可以有效地減少或避免植入材料表面細菌生物膜的形成。
圖1
不同處理后鈦片表面大體觀察
a. 處理前；b. SLA 處理后；c. SLA+AHT 處理后
Figure1. The macroscopic observation of the Ti disks after different treatmentsa. Untreated; b. After SLA treatment; c. After SLA+AHT treatment
圖2
掃描電鏡觀察不同處理后鈦片表面形貌
a. 處理前（×1 000）；b. SLA 處理后（×10 k）；c. SLA+AHT 處理后（×10 k）
Figure2. Surface morphology of the Ti disks observed by SEMa. Untreated (×1 000); b. After SLA treatment (×10 k); c. After SLA+AHT treatment (×10 k)
圖3
掃描電鏡觀察抗菌肽聚合物涂覆前后鈦片表面形貌
左：旋涂前；右：旋涂后 a. ×2 000；b. ×80 k
Figure3. Surface morphology of the Ti disks observed by SEMLeft: Before spin-coating; Right: After spin-coating a. ×2 000; b. ×80 k
圖4
載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片表面元素含量分析
Figure4.
EDS analysis on the Ti disks with different AMPs loading after SLA+AHT treatment
圖5
培養 24 h 后載有不同量抗菌肽聚合物的鈦片周圍抑菌圈觀察
a～f. 載有 0、10、30、50、70、90 μg 抗菌肽聚合物的鈦片抑菌圈；g. 抑菌圈直徑比較
Figure5. Observation of the inhibition zone on the Ti disks with different AMPs loading after 24 hours culturea～f. 0, 10, 30, 50, 70, and 90 μg-loaded samples; g. Diameter comparison of the inhibition zone
圖6
掃描電鏡觀察不同處理后鈦片表面的細菌黏附情況（×10 k）
從左至右分別為處理前、SLA 處理、SLA+AHT 處理、載抗菌肽聚合物鈦片 a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure6. Observation of bacterial attachment on Ti disks surfaces with different treatments (×10 k)From left to right for untreated, SLA treatment, SLA+AHT treatment, and AMP-loaded Ti disks a. Attachment of S. aureus; b. Attachment of E. coli
圖7
不同處理后鈦片表面的兩種細菌黏附量比較
Figure7.
Bacterial amounts attached on the different Ti disks
圖8
兩種菌液不同時間點 A 值比較
a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure8. Comparison of A values of bacterial solutions with immersed different Ti disksa. S. aureus; b. E.coli
