引用本文： 鞏棟, 馬永海, 楊新樂, 謝衛強, 邵隴龍, 甄平. 3D 打印 β-磷酸三鈣負載聚乳酸-羥基乙酸共聚物抗結核藥物緩釋微球細胞毒性及對 BMSCs 成骨分化影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(9): 1131-1136. doi: 10.7507/1002-1892.201803067 復制
目前，骨關節結核仍是居首位的肺外結核[1]，外科手術清除骨關節結核病灶后遺留的結核性骨缺損的治療，仍是骨科研究的難題和熱點[2]。另外，因骨關節創傷合并感染處理不當、多次植骨手術失敗、急慢性骨髓炎等最終導致的感染性骨缺損，在臨床上也存在骨重建困難、周期長、治愈率低、治療難度大等問題[3-4]，且其感染病原菌多為高毒性、耐藥的生物膜細菌[5]。近年來隨著各種技術的發展，感染和結核性骨缺損的治療取得了顯著進步，尤其在骨缺損的替代材料方面[6]；但也存在一系列問題，如材料的支撐強度不夠、促進成骨作用和加速骨誘導能力較弱、體內吸收降解緩慢和不完全、緩釋微球負載藥物對細菌耐藥性逐步增加等[7-8]。因此，研發一種既有骨缺損修復重建和成骨誘導作用，又具有局部持續、緩慢釋放抗耐藥菌藥物的骨修復材料顯得尤為必要。本課題組前期應用 3D 打印技術制備的 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）支架負載聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］抗結核藥物（異煙肼、利福平）緩釋微球能夠初步滿足上述需求[2, 9]。其中 3D 打印的 β-TCP 支架不僅可滿足個體化需求的特點，還具有可吸收、促進骨形成等特征[10]，PLGA 藥物緩釋微球能夠局部緩慢持續釋藥[11]，異煙肼、利福平具有良好的抗生物膜作用[12]。而 BMSCs 具有成骨分化潛能[13]，本研究擬進一步研究 3D 打印 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球細胞毒性以及對 BMSCs 成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 1 只，體質量 70 g，由解放軍蘭州總醫院實驗動物中心提供。實驗過程遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》處理動物。
β-TCP、PLGA、異煙肼、利福平、聚乙烯醇、稀檸檬酸、二氧化硅、氧化鋅、石蠟、地塞米松、1，25-（OH）2 VitD3（Sigma 公司，美國）；維生素 A、β-甘油磷酸鈉（重慶東方試劑廠）；二氯甲烷（西安化學試劑廠）；DMEM 培養基、FBS、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、茜素紅染色液（北京索萊寶生物科技有限公司）；Trizol 試劑盒、反轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。
SW-CJ 超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；恒溫細胞培養箱（上海躍進醫療器械廠）；Imaginer A2 正置金相顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；IX70 倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超速離心機、實時酶聯免疫檢測儀（Backman 公司，美國）；JSM-5600LV 掃描電鏡（Jeol 公司，日本）；實時熒光定量 PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad 公司，美國）；磁力攪拌器、漩渦振蕩器、冷凍干燥機（上海書培設備有限公司）。
1.2 3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料的制備
參照文獻[2，9]方法，采用復乳溶劑揮發法制備異煙肼、利福平/PLGA 緩釋微球，3D 打印技術制備 β-TCP 支架，用離心震蕩法將微球負載于支架上制備復合材料。
1.3 大鼠 BMSCs 的提取、分離與培養
取 SD 大鼠，以 2% 戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，75% 乙醇浸泡 30 min 消毒，無菌條件下去除股骨及脛骨表面軟組織，剪去兩端骨骺，顯露骨髓腔。用 5 mL 注射器吸取 L-DMEM 培養液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 室溫離心 5 min 后去上清。加入 5 mL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培養液，輕輕吹打并轉移接種至培養皿中，轉入恒溫細胞培養箱中培養。48 h 后更換新鮮培養基，棄去未貼壁細胞。每 3 天換液 1 次，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長情況，當細胞融合到 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化傳代，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.4 各材料浸提液的制備
分別取 PLGA 抗結核藥物緩釋微球、3D 打印 β-TCP 支架以及 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料，等離子低溫消毒滅菌 60 min 后，按照表面積與培養液體積比例為 0.3 cm2∶1 mL，將各材料置于成骨誘導培養液（含 20%FBS、2 mmol/L 谷胺酰胺、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10–7 mol/L 地塞米松、50 mg/L 維生素 C 和 100 U/L 青、鏈霉素的 L-DMEM 培養基）中，置于恒溫細胞培養箱，4℃ 儲存備用。
1.5 觀測指標
1.5.1 CCK-8 法檢測細胞毒性
實驗分為 5 組，分別為陰性對照組（A 組）、微球組（B 組）、支架組（C 組）、復合材料組（D 組）以及陽性對照組（E 組）。將第 3 代 BMSCs 以 1×104個/孔濃度接種于 96 孔板，每組 10 孔。按照分組方法，A 組加入 200 μL 成骨誘導培養液，B、C、D 組分別加入 200 μL PLGA 抗結核藥物緩釋微球浸提液、3D 打印 β-TCP 支架浸提液、3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料浸提液，E 組加入 200 μL 含 0.65% 苯酚的成骨誘導培養液。培養 24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，輕微震蕩后繼續放入恒溫細胞培養箱中培養，2～3 h 后用實時酶聯免疫檢測儀測量各孔在 450 nm 波長處的吸光度（A）值，重復測量 3 次，取均值。根據 ISO10993-1:1992 和我國《醫療器械生物學評價》GB/T16886.1-1997 國家標準中的方法，計算細胞相對增殖率（relative proliferation rate，RGR），RGR=（各實驗組 A值/陰性對照組 A值）×100%。把 RGR 值轉換成 5 級反應以評定材料的毒性程度：0 級，≥100%；1 級，75%～99%；2 級，50%～74%；3 級，25%～50%，4 級，1%～24%；5 級，0。其中毒性反應 0～1 級為合格，2 級時根據細胞形態進行評價，3～5 級為不合格。
1.5.2 茜素紅染色觀察
實驗分為 4 組。取第 3 代 BMSCs 以 1×106個/mL 接種至 6 孔板，每組復 3 孔，A、B、C、D 組依次加入 1 mL 成骨誘導培養液、PLGA 抗結核藥物緩釋微球浸提液、3D 打印 β-TCP 支架浸提液、3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料浸提液。常規換液并于 21 d 進行茜素紅染色，行大體觀察及光鏡下觀察。
1.5.3 RT-qPCR 檢測成骨相關基因表達
同 1.5.2 方法取第 3 代 BMSCs 進行分組處理后，于培養 7、14、21 d 用 Trizol 法提取 BMSCs 總 RNA，反轉錄為 cDNA，采用 RT-qPCR 法檢測成骨相關基因 ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）的表達水平。以 β-actin 作為內參，依據 2–△△Ct法計算各基因相對表達量。根據 Genbank 中基因的核酸序列，由 TaKaRa（大連）公司設計并合成引物。引物序列：ALP 上游 5’-GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC-3’，下游 5’-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3’；OCN 上游 5’-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3’，下游 5’-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3’；BSP 上游 5’-TGTGGAATGGTGCTACGGTCTC-3’，下游 5’-GATCAACAGCCCTGATTTACGATC-3’；內參 β-actin 上游 5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游 5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代細胞接種后可見細胞懸浮于培養液中，呈大小不一的圓形或類圓形，部分聚集；接種后 3 d，細胞貼壁并呈集落式生長，向側方伸出 1 個或多個突起，單體較小呈梭形、三角形或多角形；接種后 7 d，70%～80% 細胞融合，呈“魚群狀”或“漩渦狀”排列。第 2 代細胞鋪滿皿底，細胞體積增大，形態有序。見圖 1。
2.2 CCK-8 法檢測細胞毒性
隨時間延長，A～D 組 A 值均逐漸增加，表明 BMSCs 生長良好；E 組 A 值逐漸降低，表明細胞的中毒狀態。培養 24、48、72 h 時，A 值按 A、C、B、D、E 組的順序遞減，除 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。根據各組 RGR 進行細胞毒性評價，結果顯示，24 h 時 D 組細胞毒性等級為 2 級，觀察細胞形態尚可；其余時間點 A～D 組細胞毒性等級為 0～1 級，提示細胞毒性實驗合格。見表 1。
表1
各時間點各組細胞毒性檢測結果
Table1.
Cytotoxicity test results of each group at each time point
2.3 茜素紅染色觀察
成骨誘導 21 d 茜素紅染色示，各組均有紅色礦化結節形成，但礦化結節數量 C 組>D 組>A 組>B 組。見圖 2。
2.4 RT-qPCR 檢測成骨相關基因表達
組內比較：隨培養時間延長，A、B、C、D 組 OCN 和 BSP 基因相對表達量均呈逐漸增加趨勢；ALP 基因相對表達量于 7、14 d 時呈增高趨勢，21 d 時有所降低。組間比較：培養各時間點 ALP、OCN 和 BSP 基因相對表達量均為 C 組>D 組>A 組>B 組，各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察 BMSCs 形態變化
a. 原代細胞接種后即刻（×400）；b. 原代細胞接種后 3 d（×100）；c. 原代細胞接種后 7 d（×40）；d. 第 2 代細胞接種后 3 d（×40）
Figure1. Morphological observation of BMSCs by inverted phase contrast microscopea. Primary cells after inoculation (×400); b. At 3 days after inoculation of primary cells (×100); c. At 7 days after inoculation of primary cells (×40); d. At 3 days after inoculation of the second generation cells (×40)
圖2
成骨誘導培養 21 d 各組茜素紅染色觀察
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. 大體觀察；b. 光鏡下觀察（×40）
Figure2. Alizarin red staining observation of each group at 21 days after osteogenic induction cultureFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. General observation; b. Under the microscope (×40)
圖3
RT-qPCR 檢測各組成骨相關基因相對表達量
a.ALP；b.OCN；c.BSP
Figure3. Osteogenic gene expression of each group tested by RT-qPCRa. ALP; b. OCN; c. BSP
3 討論
近年來，骨組織工程支架被較多地用于骨缺損的修復，其負載藥物和生物分子后具有的抗感染、促進成骨和滿足個體化需求等特性也逐漸成為研究熱點[14-15]。本課題組前期利用 3D 打印技術，制作了 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料[2, 9]，為解決感染、結核性骨缺損等導致的骨修復重建困難、感染遷延不愈等問題提供了方法。現進一步研究其對 BMSCs 毒性和成骨分化的影響。
3D 打印技術能對 β-TCP 支架的結構進行精確控制，制造出符合骨缺損形狀、利于組織生長的個性化修復材料[16-17]，β-TCP 又具有優異的生物組織相容性、促進成骨性和生物力學特性，在體內降解吸收速度與骨質生長周期相近，可刺激骨的重塑和生長[18-19]。前期研究[2]已測得 PLGA 利福平、異煙肼微球的載藥量分別為 26.0%±1.2% 和 28.0%±1.5%；單個復合材料的含藥量（異煙肼和利福平各 50%）為（21.33±2.34）mg；緩釋結果顯示在 3 d 時有藥物突釋現象，10 d 左右開始藥物釋放均勻平穩；利福平和異煙肼濃度分別為 50 μg /mL 和 60 μg /mL，高于兩者最低殺菌濃度 5 μg /mL 和 10 μg /mL。因此復合材料理論上能誘導骨再生、填補骨缺損，具有局部緩釋抗菌藥物功能，可滿足患者個性化需求。
BMSCs 具有多向分化潛能，在適宜條件下可分化為成骨細胞，是理想的骨組織工程種子細胞[20]。體外細胞毒性實驗是生物材料安全性評價的第一階段篩選實驗，本研究所采用的 CCK-8 法具有操作簡便、結果靈敏和重現性好等優點，實驗結果顯示復合材料細胞毒性實驗評價合格；但 B、D 組 RGR 相對較低，有研究表明 β-TCP 和 PLGA 自身無細胞毒性[21]，因此這可能與異煙肼、利福平的藥物毒性有關，兩者在殺菌范圍內是否能夠對 BMSCs 增殖造成影響有待進一步探究。鈣化結節的形成是 BMSCs 向成骨細胞分化成熟的標志，茜素紅染色可以使茜素紅與鈣離子螯合，產生深紅或紫紅色復合物，用于鑒定干細胞是否向成骨分化。實驗結果顯示 C 組和 D 組鈣化結節形成數量多于 A 組和 B 組，初步證明 β-TCP 支架和復合材料能夠促進 BMSCs 向成骨細胞分化。ALP 是 BMSCs 向成骨分化最早表達的基因之一，OCN 和 BSP 是常用的評估成骨分化成熟的基因[22]，通過 RT-qPCR 技術檢測成骨相關基因表達對上述結果進一步驗證。結果顯示 ALP 在 7、14 d 時表達較高，OCN 和 BSP 在 14、21 d 時表達較高，提示了 BMSCs 向成骨細胞分化；各時間點各基因的相對表達量 C 組>D 組>A 組>B 組，與茜素紅染色結果一致，說明 β-TCP 支架能夠促進 BMSCs 向成骨分化，但負載抗結核藥物可能對成骨分化水平產生了一定程度的抑制，這也許是導致 D 組成骨相關基因表達低于 C 組的原因。雖然如此，復合材料的成骨性能仍高于 A、B 組，相比于 C 組能同時起到成骨和抗菌作用。
綜上述，3D 打印 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料對 BMSCs 無明顯細胞毒性，在起到抗感染作用的同時能夠在一定程度上促進其向成骨細胞分化，為感染性骨缺損等疾病的治療提供了方法，值得進一步研究探索。
目前，骨關節結核仍是居首位的肺外結核[1]，外科手術清除骨關節結核病灶后遺留的結核性骨缺損的治療，仍是骨科研究的難題和熱點[2]。另外，因骨關節創傷合并感染處理不當、多次植骨手術失敗、急慢性骨髓炎等最終導致的感染性骨缺損，在臨床上也存在骨重建困難、周期長、治愈率低、治療難度大等問題[3-4]，且其感染病原菌多為高毒性、耐藥的生物膜細菌[5]。近年來隨著各種技術的發展，感染和結核性骨缺損的治療取得了顯著進步，尤其在骨缺損的替代材料方面[6]；但也存在一系列問題，如材料的支撐強度不夠、促進成骨作用和加速骨誘導能力較弱、體內吸收降解緩慢和不完全、緩釋微球負載藥物對細菌耐藥性逐步增加等[7-8]。因此，研發一種既有骨缺損修復重建和成骨誘導作用，又具有局部持續、緩慢釋放抗耐藥菌藥物的骨修復材料顯得尤為必要。本課題組前期應用 3D 打印技術制備的 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）支架負載聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］抗結核藥物（異煙肼、利福平）緩釋微球能夠初步滿足上述需求[2, 9]。其中 3D 打印的 β-TCP 支架不僅可滿足個體化需求的特點，還具有可吸收、促進骨形成等特征[10]，PLGA 藥物緩釋微球能夠局部緩慢持續釋藥[11]，異煙肼、利福平具有良好的抗生物膜作用[12]。而 BMSCs 具有成骨分化潛能[13]，本研究擬進一步研究 3D 打印 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球細胞毒性以及對 BMSCs 成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 1 只，體質量 70 g，由解放軍蘭州總醫院實驗動物中心提供。實驗過程遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》處理動物。
β-TCP、PLGA、異煙肼、利福平、聚乙烯醇、稀檸檬酸、二氧化硅、氧化鋅、石蠟、地塞米松、1，25-（OH）2 VitD3（Sigma 公司，美國）；維生素 A、β-甘油磷酸鈉（重慶東方試劑廠）；二氯甲烷（西安化學試劑廠）；DMEM 培養基、FBS、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、茜素紅染色液（北京索萊寶生物科技有限公司）；Trizol 試劑盒、反轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。
SW-CJ 超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；恒溫細胞培養箱（上海躍進醫療器械廠）；Imaginer A2 正置金相顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；IX70 倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超速離心機、實時酶聯免疫檢測儀（Backman 公司，美國）；JSM-5600LV 掃描電鏡（Jeol 公司，日本）；實時熒光定量 PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad 公司，美國）；磁力攪拌器、漩渦振蕩器、冷凍干燥機（上海書培設備有限公司）。
1.2 3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料的制備
參照文獻[2，9]方法，采用復乳溶劑揮發法制備異煙肼、利福平/PLGA 緩釋微球，3D 打印技術制備 β-TCP 支架，用離心震蕩法將微球負載于支架上制備復合材料。
1.3 大鼠 BMSCs 的提取、分離與培養
取 SD 大鼠，以 2% 戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，75% 乙醇浸泡 30 min 消毒，無菌條件下去除股骨及脛骨表面軟組織，剪去兩端骨骺，顯露骨髓腔。用 5 mL 注射器吸取 L-DMEM 培養液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 室溫離心 5 min 后去上清。加入 5 mL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培養液，輕輕吹打并轉移接種至培養皿中，轉入恒溫細胞培養箱中培養。48 h 后更換新鮮培養基，棄去未貼壁細胞。每 3 天換液 1 次，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長情況，當細胞融合到 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化傳代，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.4 各材料浸提液的制備
分別取 PLGA 抗結核藥物緩釋微球、3D 打印 β-TCP 支架以及 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料，等離子低溫消毒滅菌 60 min 后，按照表面積與培養液體積比例為 0.3 cm2∶1 mL，將各材料置于成骨誘導培養液（含 20%FBS、2 mmol/L 谷胺酰胺、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10–7 mol/L 地塞米松、50 mg/L 維生素 C 和 100 U/L 青、鏈霉素的 L-DMEM 培養基）中，置于恒溫細胞培養箱，4℃ 儲存備用。
1.5 觀測指標
1.5.1 CCK-8 法檢測細胞毒性
實驗分為 5 組，分別為陰性對照組（A 組）、微球組（B 組）、支架組（C 組）、復合材料組（D 組）以及陽性對照組（E 組）。將第 3 代 BMSCs 以 1×104個/孔濃度接種于 96 孔板，每組 10 孔。按照分組方法，A 組加入 200 μL 成骨誘導培養液，B、C、D 組分別加入 200 μL PLGA 抗結核藥物緩釋微球浸提液、3D 打印 β-TCP 支架浸提液、3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料浸提液，E 組加入 200 μL 含 0.65% 苯酚的成骨誘導培養液。培養 24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，輕微震蕩后繼續放入恒溫細胞培養箱中培養，2～3 h 后用實時酶聯免疫檢測儀測量各孔在 450 nm 波長處的吸光度（A）值，重復測量 3 次，取均值。根據 ISO10993-1:1992 和我國《醫療器械生物學評價》GB/T16886.1-1997 國家標準中的方法，計算細胞相對增殖率（relative proliferation rate，RGR），RGR=（各實驗組 A值/陰性對照組 A值）×100%。把 RGR 值轉換成 5 級反應以評定材料的毒性程度：0 級，≥100%；1 級，75%～99%；2 級，50%～74%；3 級，25%～50%，4 級，1%～24%；5 級，0。其中毒性反應 0～1 級為合格，2 級時根據細胞形態進行評價，3～5 級為不合格。
1.5.2 茜素紅染色觀察
實驗分為 4 組。取第 3 代 BMSCs 以 1×106個/mL 接種至 6 孔板，每組復 3 孔，A、B、C、D 組依次加入 1 mL 成骨誘導培養液、PLGA 抗結核藥物緩釋微球浸提液、3D 打印 β-TCP 支架浸提液、3D 打印 β-TCP 負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料浸提液。常規換液并于 21 d 進行茜素紅染色，行大體觀察及光鏡下觀察。
1.5.3 RT-qPCR 檢測成骨相關基因表達
同 1.5.2 方法取第 3 代 BMSCs 進行分組處理后，于培養 7、14、21 d 用 Trizol 法提取 BMSCs 總 RNA，反轉錄為 cDNA，采用 RT-qPCR 法檢測成骨相關基因 ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）的表達水平。以 β-actin 作為內參，依據 2–△△Ct法計算各基因相對表達量。根據 Genbank 中基因的核酸序列，由 TaKaRa（大連）公司設計并合成引物。引物序列：ALP 上游 5’-GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC-3’，下游 5’-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3’；OCN 上游 5’-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3’，下游 5’-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3’；BSP 上游 5’-TGTGGAATGGTGCTACGGTCTC-3’，下游 5’-GATCAACAGCCCTGATTTACGATC-3’；內參 β-actin 上游 5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游 5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代細胞接種后可見細胞懸浮于培養液中，呈大小不一的圓形或類圓形，部分聚集；接種后 3 d，細胞貼壁并呈集落式生長，向側方伸出 1 個或多個突起，單體較小呈梭形、三角形或多角形；接種后 7 d，70%～80% 細胞融合，呈“魚群狀”或“漩渦狀”排列。第 2 代細胞鋪滿皿底，細胞體積增大，形態有序。見圖 1。
2.2 CCK-8 法檢測細胞毒性
隨時間延長，A～D 組 A 值均逐漸增加，表明 BMSCs 生長良好；E 組 A 值逐漸降低，表明細胞的中毒狀態。培養 24、48、72 h 時，A 值按 A、C、B、D、E 組的順序遞減，除 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。根據各組 RGR 進行細胞毒性評價，結果顯示，24 h 時 D 組細胞毒性等級為 2 級，觀察細胞形態尚可；其余時間點 A～D 組細胞毒性等級為 0～1 級，提示細胞毒性實驗合格。見表 1。
表1
各時間點各組細胞毒性檢測結果
Table1.
Cytotoxicity test results of each group at each time point
2.3 茜素紅染色觀察
成骨誘導 21 d 茜素紅染色示，各組均有紅色礦化結節形成，但礦化結節數量 C 組>D 組>A 組>B 組。見圖 2。
2.4 RT-qPCR 檢測成骨相關基因表達
組內比較：隨培養時間延長，A、B、C、D 組 OCN 和 BSP 基因相對表達量均呈逐漸增加趨勢；ALP 基因相對表達量于 7、14 d 時呈增高趨勢，21 d 時有所降低。組間比較：培養各時間點 ALP、OCN 和 BSP 基因相對表達量均為 C 組>D 組>A 組>B 組，各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察 BMSCs 形態變化
a. 原代細胞接種后即刻（×400）；b. 原代細胞接種后 3 d（×100）；c. 原代細胞接種后 7 d（×40）；d. 第 2 代細胞接種后 3 d（×40）
Figure1. Morphological observation of BMSCs by inverted phase contrast microscopea. Primary cells after inoculation (×400); b. At 3 days after inoculation of primary cells (×100); c. At 7 days after inoculation of primary cells (×40); d. At 3 days after inoculation of the second generation cells (×40)
圖2
成骨誘導培養 21 d 各組茜素紅染色觀察
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. 大體觀察；b. 光鏡下觀察（×40）
Figure2. Alizarin red staining observation of each group at 21 days after osteogenic induction cultureFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. General observation; b. Under the microscope (×40)
圖3
RT-qPCR 檢測各組成骨相關基因相對表達量
a.ALP；b.OCN；c.BSP
Figure3. Osteogenic gene expression of each group tested by RT-qPCRa. ALP; b. OCN; c. BSP
3 討論
近年來，骨組織工程支架被較多地用于骨缺損的修復，其負載藥物和生物分子后具有的抗感染、促進成骨和滿足個體化需求等特性也逐漸成為研究熱點[14-15]。本課題組前期利用 3D 打印技術，制作了 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料[2, 9]，為解決感染、結核性骨缺損等導致的骨修復重建困難、感染遷延不愈等問題提供了方法。現進一步研究其對 BMSCs 毒性和成骨分化的影響。
3D 打印技術能對 β-TCP 支架的結構進行精確控制，制造出符合骨缺損形狀、利于組織生長的個性化修復材料[16-17]，β-TCP 又具有優異的生物組織相容性、促進成骨性和生物力學特性，在體內降解吸收速度與骨質生長周期相近，可刺激骨的重塑和生長[18-19]。前期研究[2]已測得 PLGA 利福平、異煙肼微球的載藥量分別為 26.0%±1.2% 和 28.0%±1.5%；單個復合材料的含藥量（異煙肼和利福平各 50%）為（21.33±2.34）mg；緩釋結果顯示在 3 d 時有藥物突釋現象，10 d 左右開始藥物釋放均勻平穩；利福平和異煙肼濃度分別為 50 μg /mL 和 60 μg /mL，高于兩者最低殺菌濃度 5 μg /mL 和 10 μg /mL。因此復合材料理論上能誘導骨再生、填補骨缺損，具有局部緩釋抗菌藥物功能，可滿足患者個性化需求。
BMSCs 具有多向分化潛能，在適宜條件下可分化為成骨細胞，是理想的骨組織工程種子細胞[20]。體外細胞毒性實驗是生物材料安全性評價的第一階段篩選實驗，本研究所采用的 CCK-8 法具有操作簡便、結果靈敏和重現性好等優點，實驗結果顯示復合材料細胞毒性實驗評價合格；但 B、D 組 RGR 相對較低，有研究表明 β-TCP 和 PLGA 自身無細胞毒性[21]，因此這可能與異煙肼、利福平的藥物毒性有關，兩者在殺菌范圍內是否能夠對 BMSCs 增殖造成影響有待進一步探究。鈣化結節的形成是 BMSCs 向成骨細胞分化成熟的標志，茜素紅染色可以使茜素紅與鈣離子螯合，產生深紅或紫紅色復合物，用于鑒定干細胞是否向成骨分化。實驗結果顯示 C 組和 D 組鈣化結節形成數量多于 A 組和 B 組，初步證明 β-TCP 支架和復合材料能夠促進 BMSCs 向成骨細胞分化。ALP 是 BMSCs 向成骨分化最早表達的基因之一，OCN 和 BSP 是常用的評估成骨分化成熟的基因[22]，通過 RT-qPCR 技術檢測成骨相關基因表達對上述結果進一步驗證。結果顯示 ALP 在 7、14 d 時表達較高，OCN 和 BSP 在 14、21 d 時表達較高，提示了 BMSCs 向成骨細胞分化；各時間點各基因的相對表達量 C 組>D 組>A 組>B 組，與茜素紅染色結果一致，說明 β-TCP 支架能夠促進 BMSCs 向成骨分化，但負載抗結核藥物可能對成骨分化水平產生了一定程度的抑制，這也許是導致 D 組成骨相關基因表達低于 C 組的原因。雖然如此，復合材料的成骨性能仍高于 A、B 組，相比于 C 組能同時起到成骨和抗菌作用。
綜上述，3D 打印 β-TCP 支架負載 PLGA 抗結核藥物緩釋微球復合材料對 BMSCs 無明顯細胞毒性，在起到抗感染作用的同時能夠在一定程度上促進其向成骨細胞分化，為感染性骨缺損等疾病的治療提供了方法，值得進一步研究探索。
