引用本文： 馮蔚楓, 陸海濱, 徐筑秋, 陳露露, 楊曉楠, 祁佐良. 肌外膜導管中細胞對周圍神經再生影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(5): 617-624. doi: 10.7507/1002-1892.201712092 復制
自體神經移植是周圍神經損傷修復的“金標準”，但存在供區功能損傷、來源有限的問題。學者們采用組織工程方法，將導管移植物[1-6]、干細胞衍生物[7-8]、導管結合干細胞[9]等用于周圍神經修復，但也存在供區損傷、需二次手術、供區細胞有限以及痛性神經瘤產生等問題[10-12]。相比于非生物材料，生物材料具有排斥反應小、吸收率高、無毒性等特點。我們前期實驗已證實，與聚氨酯導管相比，由小鼠腹外斜肌外膜制備成的肌外膜導管（epimysium conduit，EMC）修復 5 mm 長坐骨神經缺損后，神經再生更好[13]。EMC 不僅提供了神經再生的環境，還提供了神經再生的原料——肌源性干細胞。因此，我們分析 EMC 中的活細胞成分可能參與并促進了神經軸突再生。為驗證該結論，本實驗分別采用經細胞遷移抑制或脫去細胞核處理的 EMC 橋接小鼠坐骨神經斷端，與未處理的 EMC 對比修復神經的效果。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 C57BL/6J 增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠 8 只，體質量 22~24 g；8 周齡雌性 C57BL/6J 野生型小鼠 24 只，體質量 25~27 g；均由南京大學模式研究中心提供。
Matrigel 基質膠（BD 公司，美國）；兔抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、兔抗神經絲蛋白（neurofilament，NF）-H 多克隆抗體、兔抗層粘連蛋白（laminin，LN）多克隆抗體、Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，英國）；脫氧膽酸鈉溶液、DNase、RNase、Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。
RAD SOURCE RS2000 型 X 線生物輻照器（上海柏辰生物科技有限公司）；LKB-V 超薄切片機（LKB 公司，瑞典）；活細胞顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；H7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）； E600 顯微鏡 （Nikon 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 EMC 制備
無菌條件下，參照本課題組前期方法制備 EMC[13]。取 C57 BL/6J EGFP 小鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，顯微鏡下將小鼠腹外斜肌外膜沿脊柱側剪下，剪除部分肌纖維，修剪成大小為 5 mm×3 mm 的肌外膜，肌纖維側朝內，包裹在 25G 針頭上，用 11-0 絲線間斷縫合。見圖 1。
圖1
EMC 制備示意圖
a. 小鼠腹外斜肌外膜；b. 修剪后的肌外膜；c. 肌外膜包裹于 25G 針頭并縫合；d. 取出針頭后，EMC 管腔為中空結構
Figure1. Schematic diagram of EMC preparationa. Abdominal epimysium of mouse; b. Trimmed epimysium; c. Epimysium was wrapped in 25G needle and sutured; d. After removal of needle, EMC lumen was hollow structure
1.2.2 肌外膜細胞遷移抑制處理及觀測
無菌條件下，取部分 1.2.1 中獲得的肌外膜置于 35 mm 培養皿中，滴加 1 mL 含 20%FBS、1% 青鏈霉素混合液的 L-DMEM 培養基，置于 X 線生物輻照器中[14]，分別采用不同照射劑量（0、15、20、25、30、35 Gy）進行處理，每分鐘照射劑量約 7 Gy。然后取出肌外膜，置于新的 35 mm 培養皿中，肌肉側貼壁，置于 37℃ 培養箱中，2 h 后取出，每個培養皿中加入 3 mL 含 20%FBS、1% 青鏈霉素混合液的 L-DMEM 培養基，置于 37℃ 培養箱繼續培養，于培養后 4 d 及 15 d 于 40 倍鏡下計數遷移細胞。培養期間每隔 3 d 換液。根據 15 d 時遷移細胞數觀測結果，選擇細胞遷移抑制效果最強的照射劑量作為實驗劑量。取以該劑量輻射的肌外膜，參照 1.2.1 方法制備 EMC進行下一步體內實驗。
1.2.3 肌外膜脫細胞處理及觀測
無菌條件下，取部分 1.2.1 中獲得的肌外膜依次進行以下處理。首先，置于 4℃ 去離子水中 24 h；隨后置于室溫 4% 脫氧膽酸鈉溶液浸泡 4 h；PBS 清洗 3 次，每次 5 min；最后置于 50 U/mL DNase 與 1 U/mL RNase 混合液中，37℃ 條件下震蕩 24 h，PBS 清洗 3 次，每次 5 min。重復以上過程 3 次。最終獲得脫細胞核的肌外膜，然后按照 1.2.1 方法制備 EMC。
取脫細胞處理前及處理后的肌外膜置于多聚甲醛中固定 24 h，分級乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm 厚切片，常規 HE 和 Masson 染色，光鏡下觀察細胞核情況。
1.3 體內實驗
1.3.1 動物模型制備及分組
取 C57BL/6J 野生型小鼠 24 只，隨機分為 A、B、C 3 組，每組 8 只。腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，切開右后肢皮膚，暴露右側坐骨神經，顯微外科鏡下剪除 3 mm 坐骨神經，制備坐骨神經缺損模型。然后，根據分組將制備的不同 EMC 用 11-0 不可吸收線縫合于坐骨神經兩斷端；其中，A 組為 EMC、B 組為經細胞遷移抑制處理后的 EMC、C 組為脫細胞處理后的 EMC。用 27G 針頭在 EMC 中注入 0.1 mL Matrigel。將修復后的坐骨神經還納回肌間隙，用 6-0 尼龍線間斷縫合皮膚。麻醉蘇醒后，小鼠分籠飼養。
1.3.2 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組小鼠存活情況以及切口愈合、肢體功能情況。
② 大體觀察：術后 16 周各組小鼠同上法麻醉后，按照原切口入路，大體觀察神經再生情況。
③ 組織學及透射電鏡觀察：大體觀察后，各組隨機取 4 只小鼠的再生神經中段，置于 4℃ 2.5% 戊二醛中 24 h，PBS 沖洗，置于 1% 鋨酸 2 h，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋。用超薄切片機制備 500 nm 厚半薄切片，滴加 1% 甲苯胺藍 1 min，PBS 漂洗后中性樹脂封片。鏡下觀察再生軸突（藍染）情況，隨機取 6 個視野計數軸突，每個視野重復 3 次，取均值。然后，制備 70 nm 厚超薄切片，檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察有髓神經鞘，隨機取 10 個視野，每個視野內測量 5 個有髓神經鞘厚度，取均值。
④ 免疫熒光染色觀察：各組取剩余 4 只小鼠再生神經中段，置于 4℃ 4% 多聚甲醛和 10% 蔗糖混合液 2 h，更換至 4℃ 30% 蔗糖溶液中脫水 24 h；OCT 包埋、制備 9 μm 厚冰凍切片。切片先用 0.3% Triton X-100 室溫下破膜 15 min，PBS 漂洗后 37℃ 下用羊血清封閉 30 min，之后滴加 GFAP、LN、NF 一抗，4℃ 條件下過夜。次日，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，滴加二抗，37℃ 孵育 40 min，PBS 清洗后再滴加 DAPI 染色液封片。所有過程均避光操作。激光共聚焦顯微鏡下觀察，NF、GFAP、LN 陽性染色呈紅色，EGFP 細胞呈綠色、細胞核呈藍色。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行分析。數據符合正態分布時，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey’s post hoc檢驗；數據不符合正態分布時，以中位數表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肌外膜細胞遷移抑制觀察
培養后 4 d，各組肌外膜中均有細胞遷移，0、15、20、25、30、35 Gy 組遷移細胞數分別為（14.600±1.517）、（11.600±1.140）、（10.800±1.643）、（7.800±0.837）、（7.000±1.581）、（4.600±1.140）個。其中，15 Gy 組與 20 Gy 組比較、25、35 Gy 組與 30 Gy 組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；其余各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
15 d 時，隨照射劑量增大，細胞遷移數逐漸減小。0、15、20、25、30、35 Gy 組遷移細胞數分別為（819.000±22.967）、（77.00±7.063）、（55.600±3.362）、（34.400±3.362）、（12.600±3.975）、（8.600±1.140）個。除 30 Gy 組與 35 Gy 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。本實驗選擇 35 Gy 作為抑制肌外膜細胞遷移的照射劑量，將處理后的肌外膜制備 EMC，進行下一步實驗。
圖2
經細胞遷移抑制處理后肌外膜的細胞遷移情況觀察（×40）
從左至右分別為 0、15、20、25、30、35 Gy 組 a. 培養 4 d；b. 培養 15 d
Figure2. Observation of the epimysium cells after cell migration inhibition (×40)From left to right for 0, 15, 20, 25, 30, 35 Gy groups a. After culturing for 4 days; b. After culturing for 15 days
2.2 肌外膜脫細胞處理觀察
肌外膜脫細胞處理后仍可縫合成導管狀，制備 EMC。HE 染色和 Masson 染色觀察示，未作脫細胞處理的肌外膜中可見散在、均勻分布的細胞核，脫細胞處理后肌外膜中均未見細胞核。見圖 3。
圖3
脫細胞處理前后肌外膜觀察
a. 脫細胞處理后的肌外膜制備 EMC；b、c. 脫細胞處理前后肌外膜 HE 染色觀察（×200） 箭頭示細胞核；d、e. 脫細胞處理前后肌外膜 Masson 染色觀察（×200） 箭頭示細胞核
Figure3. Observation of the epimysium before and after decellularizationa. Preparation of EMC after decellularization; b, c. HE staining before and after decellularization (×200) Arrow indicated the nucleus; d, e. Masson staining before and after decellularization (×200) Arrow indicated the nucleus
2.3 體內實驗觀察
2.3.1 一般情況
各組小鼠均存活至實驗完成，無感染等并發癥。后肢切口均順利愈合，無患肢自殘或足部潰瘍等情況出現。
2.3.2 大體觀察
術后 16 周，各組按照原切口入路后，肉眼可較準確辨認并分離 EMC 再生的神經，顯微鑷子輕夾 EMC 中段，相應后肢均有動作反射，提示 EMC 中神經再通。取材后觀察，A 組修復后的坐骨神經最粗，B 組次之，C 組最細（圖 4）。
圖4
術后 16 周各組坐骨神經大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Gross observation of sciatic nerve in each group at 16 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.3 甲苯胺藍染色觀察
鏡下觀察各組均可見大量軸突，C 組中可見少量血管。見圖 5。A、B、C 組再生神經軸突數分別為（631.667±20.569）、（529.167±21.405）、（510.333±18.096）個/視野。其中，A 組顯著多于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
術后 16 周各組甲苯胺藍染色觀察（×600）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Toluidine blue staining in each group at 16 weeks after operation (×600)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.4 透射電鏡觀察
透射鏡下觀察，各組有髓神經鞘厚度不同（圖 6）。A、B、C 組再生有髓神經鞘厚度中位數分別為 0.8、0.7、0.7 μm。A 組再生有髓神經鞘明顯厚于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖6
術后 16 周各組透射電鏡觀察（×2 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. Observation of transmission electron microscopy in each group at 16 weeks after operation(×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.5 免疫熒光染色觀察
鏡下觀察可見各組 EMC 中均有神經軸突染色，且 A、B 組密集程度明顯高于 C 組；但雪旺細胞染色在 B、C 組較為明顯，分布均勻，在 A 組中幾乎不可見；此外，來源于 EMC 的綠色熒光細胞僅在 A、B 組再生神經中可見，C 組并未發現。見圖 7。
圖7
術后 16 周各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
箭頭示縫線線結 從左至右分別為 LN、NF、GFAP 染色 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. Immunofluorescence staining in each group at 16 weeks after operation (Fluorescence mircoscopy×200)Arrowed indicated the arrowheads From left to right for laminin, neurofilament, and glial fibrillary acidic protein stainings a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
放射線治療一直是腫瘤治療中的常見手段，放療后腫瘤細胞轉移明顯減少[15]。目前已知兩種放射線導致的細胞死亡，細胞間期死亡和有絲分裂期死亡。細胞分裂時若受到了超過 100 Gy 的照射，可直接殺死處于分裂間期的細胞；而有絲分裂期死亡常在正常細胞中發生，經 X 線照射后細胞間期的 G2 期延長，從而增加了細胞死亡率[16]。同時也有研究顯示，成纖維細胞在低劑量（1～4 Gy）放射線照射后能夠造成數十小時的 G1/S 期阻滯。本實驗利用放射線這一特性，制備了細胞遷移抑制的 EMC。本實驗發現，無論是否經 X 線照射，肌外膜中細胞均從第 4 天時開始向組織外遷移[17]，第 15 天時細胞遷移抑制現象與照射劑量成正相關，且細胞形態也隨之改變。這可能是因為 X 線照射不僅加速了細胞死亡，還暫停了細胞增殖。但當照射劑量達 35 Gy 時，遷移細胞數量與 30 Gy 照射時無顯著差異。考慮到本實驗欲得到遷移細胞數盡量少的 EMC，所以選用能接受的最大放射劑量 35 Gy。
脫細胞是從新鮮組織中去除細胞核成分，僅保留細胞外基質[18]。為了判斷 EMC 中活細胞是否影響神經再生，我們希望得到肌纖維完整但無細胞核存在的 EMC。現常用脫細胞方法，如 SDS、凍融法和胰蛋白酶等，雖能有效去除細胞核，但對肌纖維均有不同程度損傷。而脫氧膽酸鈉能與細胞膜的脂質雙分子層整合，破壞并溶解細胞膜，使細胞核暴露，而 DNase 和 RNase 可溶解核酸[19]。我們將二者聯合應用，得到了無細胞核且肌纖維完整的 EMC。并經脫細胞組織學評價方法[20]，驗證了此脫細胞方法的有效性，且脫細胞后的肌外膜仍能夠縫合成管腔結構，進行下一步體內實驗。
本次體內實驗結果顯示，A 組再生坐骨神經優于 B、C 組，說明 EMC 中活細胞對坐骨神經再生起到了促進作用。免疫熒光染色顯示，A 組來源于 EMC 的 EGFP 細胞融入再生神經基底膜，包繞神經軸突；而 B 組 EGFP 細胞停留在再生神經邊緣，未向內遷移；說明 EMC 中細胞有可能參與了軸突再生的過程。甲苯胺藍染色顯示，A 組再生神經軸突優于其余兩組。然而，需要注意的是，免疫熒光染色顯示 A 組神經軸突染色較多，但雪旺細胞染色卻幾乎不可見。這可能是因為 GFAP 標記物在不成熟的雪旺細胞中表達更高，而具有成髓鞘功能的雪旺細胞屬于成熟細胞[21]。說明 EMC 中活細胞成分可能對雪旺細胞的成髓鞘起促進作用，而由肌源性干細胞轉化來的類雪旺細胞可能也更趨近于成熟[22]。C 組再生神經管腔最細，再生軸突數量最少，可能是因為在早期脫細胞后，細胞外基質可在短時間內迅速激活宿主的再生炎性反應，而其某種細胞外基質的降解產物加速了 M2 巨噬細胞的極化[23-25]，相比于 M1 型免疫反應更有利于結構的重建[26]。同時，僅存的細胞外基質有刺激受體干細胞遷移[27]和促進多能干細胞分化的功能[28]。因此，在術后同時期內，C 組有效的炎性細胞多，促進神經系統干細胞再生作用強，而因 EMC 中已無肌細胞等干擾，故神經軸突得以快速再生；但當注入的 Matrigel 被吸收后，管腔內無成纖維組織等支撐，最終再生通路塌陷。另外，有髓神經鞘的主要成分是脂質，殘留的脫氧膽酸鈉對脂質有破壞作用，進而又對新生髓鞘形成有長期影響。
綜上述，本實驗結果提示神經再生是通過細胞間交互作用產生的，EMC 中活細胞成分參與并促進了神經再生。我們將在本實驗基礎上進一步探索不同 EMC 間細胞因子的變化，以及再生早期各組神經再生情況。另外，不同處理后 EMC 造成的炎性反應對神經再生的影響機制也需研究，以期為臨床周圍神經再生提供更多選擇和理論依據。
自體神經移植是周圍神經損傷修復的“金標準”，但存在供區功能損傷、來源有限的問題。學者們采用組織工程方法，將導管移植物[1-6]、干細胞衍生物[7-8]、導管結合干細胞[9]等用于周圍神經修復，但也存在供區損傷、需二次手術、供區細胞有限以及痛性神經瘤產生等問題[10-12]。相比于非生物材料，生物材料具有排斥反應小、吸收率高、無毒性等特點。我們前期實驗已證實，與聚氨酯導管相比，由小鼠腹外斜肌外膜制備成的肌外膜導管（epimysium conduit，EMC）修復 5 mm 長坐骨神經缺損后，神經再生更好[13]。EMC 不僅提供了神經再生的環境，還提供了神經再生的原料——肌源性干細胞。因此，我們分析 EMC 中的活細胞成分可能參與并促進了神經軸突再生。為驗證該結論，本實驗分別采用經細胞遷移抑制或脫去細胞核處理的 EMC 橋接小鼠坐骨神經斷端，與未處理的 EMC 對比修復神經的效果。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 C57BL/6J 增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠 8 只，體質量 22~24 g；8 周齡雌性 C57BL/6J 野生型小鼠 24 只，體質量 25~27 g；均由南京大學模式研究中心提供。
Matrigel 基質膠（BD 公司，美國）；兔抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、兔抗神經絲蛋白（neurofilament，NF）-H 多克隆抗體、兔抗層粘連蛋白（laminin，LN）多克隆抗體、Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，英國）；脫氧膽酸鈉溶液、DNase、RNase、Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。
RAD SOURCE RS2000 型 X 線生物輻照器（上海柏辰生物科技有限公司）；LKB-V 超薄切片機（LKB 公司，瑞典）；活細胞顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；H7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）； E600 顯微鏡 （Nikon 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 EMC 制備
無菌條件下，參照本課題組前期方法制備 EMC[13]。取 C57 BL/6J EGFP 小鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，顯微鏡下將小鼠腹外斜肌外膜沿脊柱側剪下，剪除部分肌纖維，修剪成大小為 5 mm×3 mm 的肌外膜，肌纖維側朝內，包裹在 25G 針頭上，用 11-0 絲線間斷縫合。見圖 1。
圖1
EMC 制備示意圖
a. 小鼠腹外斜肌外膜；b. 修剪后的肌外膜；c. 肌外膜包裹于 25G 針頭并縫合；d. 取出針頭后，EMC 管腔為中空結構
Figure1. Schematic diagram of EMC preparationa. Abdominal epimysium of mouse; b. Trimmed epimysium; c. Epimysium was wrapped in 25G needle and sutured; d. After removal of needle, EMC lumen was hollow structure
1.2.2 肌外膜細胞遷移抑制處理及觀測
無菌條件下，取部分 1.2.1 中獲得的肌外膜置于 35 mm 培養皿中，滴加 1 mL 含 20%FBS、1% 青鏈霉素混合液的 L-DMEM 培養基，置于 X 線生物輻照器中[14]，分別采用不同照射劑量（0、15、20、25、30、35 Gy）進行處理，每分鐘照射劑量約 7 Gy。然后取出肌外膜，置于新的 35 mm 培養皿中，肌肉側貼壁，置于 37℃ 培養箱中，2 h 后取出，每個培養皿中加入 3 mL 含 20%FBS、1% 青鏈霉素混合液的 L-DMEM 培養基，置于 37℃ 培養箱繼續培養，于培養后 4 d 及 15 d 于 40 倍鏡下計數遷移細胞。培養期間每隔 3 d 換液。根據 15 d 時遷移細胞數觀測結果，選擇細胞遷移抑制效果最強的照射劑量作為實驗劑量。取以該劑量輻射的肌外膜，參照 1.2.1 方法制備 EMC進行下一步體內實驗。
1.2.3 肌外膜脫細胞處理及觀測
無菌條件下，取部分 1.2.1 中獲得的肌外膜依次進行以下處理。首先，置于 4℃ 去離子水中 24 h；隨后置于室溫 4% 脫氧膽酸鈉溶液浸泡 4 h；PBS 清洗 3 次，每次 5 min；最后置于 50 U/mL DNase 與 1 U/mL RNase 混合液中，37℃ 條件下震蕩 24 h，PBS 清洗 3 次，每次 5 min。重復以上過程 3 次。最終獲得脫細胞核的肌外膜，然后按照 1.2.1 方法制備 EMC。
取脫細胞處理前及處理后的肌外膜置于多聚甲醛中固定 24 h，分級乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm 厚切片，常規 HE 和 Masson 染色，光鏡下觀察細胞核情況。
1.3 體內實驗
1.3.1 動物模型制備及分組
取 C57BL/6J 野生型小鼠 24 只，隨機分為 A、B、C 3 組，每組 8 只。腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，切開右后肢皮膚，暴露右側坐骨神經，顯微外科鏡下剪除 3 mm 坐骨神經，制備坐骨神經缺損模型。然后，根據分組將制備的不同 EMC 用 11-0 不可吸收線縫合于坐骨神經兩斷端；其中，A 組為 EMC、B 組為經細胞遷移抑制處理后的 EMC、C 組為脫細胞處理后的 EMC。用 27G 針頭在 EMC 中注入 0.1 mL Matrigel。將修復后的坐骨神經還納回肌間隙，用 6-0 尼龍線間斷縫合皮膚。麻醉蘇醒后，小鼠分籠飼養。
1.3.2 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組小鼠存活情況以及切口愈合、肢體功能情況。
② 大體觀察：術后 16 周各組小鼠同上法麻醉后，按照原切口入路，大體觀察神經再生情況。
③ 組織學及透射電鏡觀察：大體觀察后，各組隨機取 4 只小鼠的再生神經中段，置于 4℃ 2.5% 戊二醛中 24 h，PBS 沖洗，置于 1% 鋨酸 2 h，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋。用超薄切片機制備 500 nm 厚半薄切片，滴加 1% 甲苯胺藍 1 min，PBS 漂洗后中性樹脂封片。鏡下觀察再生軸突（藍染）情況，隨機取 6 個視野計數軸突，每個視野重復 3 次，取均值。然后，制備 70 nm 厚超薄切片，檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察有髓神經鞘，隨機取 10 個視野，每個視野內測量 5 個有髓神經鞘厚度，取均值。
④ 免疫熒光染色觀察：各組取剩余 4 只小鼠再生神經中段，置于 4℃ 4% 多聚甲醛和 10% 蔗糖混合液 2 h，更換至 4℃ 30% 蔗糖溶液中脫水 24 h；OCT 包埋、制備 9 μm 厚冰凍切片。切片先用 0.3% Triton X-100 室溫下破膜 15 min，PBS 漂洗后 37℃ 下用羊血清封閉 30 min，之后滴加 GFAP、LN、NF 一抗，4℃ 條件下過夜。次日，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，滴加二抗，37℃ 孵育 40 min，PBS 清洗后再滴加 DAPI 染色液封片。所有過程均避光操作。激光共聚焦顯微鏡下觀察，NF、GFAP、LN 陽性染色呈紅色，EGFP 細胞呈綠色、細胞核呈藍色。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行分析。數據符合正態分布時，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey’s post hoc檢驗；數據不符合正態分布時，以中位數表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肌外膜細胞遷移抑制觀察
培養后 4 d，各組肌外膜中均有細胞遷移，0、15、20、25、30、35 Gy 組遷移細胞數分別為（14.600±1.517）、（11.600±1.140）、（10.800±1.643）、（7.800±0.837）、（7.000±1.581）、（4.600±1.140）個。其中，15 Gy 組與 20 Gy 組比較、25、35 Gy 組與 30 Gy 組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；其余各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
15 d 時，隨照射劑量增大，細胞遷移數逐漸減小。0、15、20、25、30、35 Gy 組遷移細胞數分別為（819.000±22.967）、（77.00±7.063）、（55.600±3.362）、（34.400±3.362）、（12.600±3.975）、（8.600±1.140）個。除 30 Gy 組與 35 Gy 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。本實驗選擇 35 Gy 作為抑制肌外膜細胞遷移的照射劑量，將處理后的肌外膜制備 EMC，進行下一步實驗。
圖2
經細胞遷移抑制處理后肌外膜的細胞遷移情況觀察（×40）
從左至右分別為 0、15、20、25、30、35 Gy 組 a. 培養 4 d；b. 培養 15 d
Figure2. Observation of the epimysium cells after cell migration inhibition (×40)From left to right for 0, 15, 20, 25, 30, 35 Gy groups a. After culturing for 4 days; b. After culturing for 15 days
2.2 肌外膜脫細胞處理觀察
肌外膜脫細胞處理后仍可縫合成導管狀，制備 EMC。HE 染色和 Masson 染色觀察示，未作脫細胞處理的肌外膜中可見散在、均勻分布的細胞核，脫細胞處理后肌外膜中均未見細胞核。見圖 3。
圖3
脫細胞處理前后肌外膜觀察
a. 脫細胞處理后的肌外膜制備 EMC；b、c. 脫細胞處理前后肌外膜 HE 染色觀察（×200） 箭頭示細胞核；d、e. 脫細胞處理前后肌外膜 Masson 染色觀察（×200） 箭頭示細胞核
Figure3. Observation of the epimysium before and after decellularizationa. Preparation of EMC after decellularization; b, c. HE staining before and after decellularization (×200) Arrow indicated the nucleus; d, e. Masson staining before and after decellularization (×200) Arrow indicated the nucleus
2.3 體內實驗觀察
2.3.1 一般情況
各組小鼠均存活至實驗完成，無感染等并發癥。后肢切口均順利愈合，無患肢自殘或足部潰瘍等情況出現。
2.3.2 大體觀察
術后 16 周，各組按照原切口入路后，肉眼可較準確辨認并分離 EMC 再生的神經，顯微鑷子輕夾 EMC 中段，相應后肢均有動作反射，提示 EMC 中神經再通。取材后觀察，A 組修復后的坐骨神經最粗，B 組次之，C 組最細（圖 4）。
圖4
術后 16 周各組坐骨神經大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Gross observation of sciatic nerve in each group at 16 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.3 甲苯胺藍染色觀察
鏡下觀察各組均可見大量軸突，C 組中可見少量血管。見圖 5。A、B、C 組再生神經軸突數分別為（631.667±20.569）、（529.167±21.405）、（510.333±18.096）個/視野。其中，A 組顯著多于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
術后 16 周各組甲苯胺藍染色觀察（×600）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Toluidine blue staining in each group at 16 weeks after operation (×600)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.4 透射電鏡觀察
透射鏡下觀察，各組有髓神經鞘厚度不同（圖 6）。A、B、C 組再生有髓神經鞘厚度中位數分別為 0.8、0.7、0.7 μm。A 組再生有髓神經鞘明顯厚于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖6
術后 16 周各組透射電鏡觀察（×2 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. Observation of transmission electron microscopy in each group at 16 weeks after operation(×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.5 免疫熒光染色觀察
鏡下觀察可見各組 EMC 中均有神經軸突染色，且 A、B 組密集程度明顯高于 C 組；但雪旺細胞染色在 B、C 組較為明顯，分布均勻，在 A 組中幾乎不可見；此外，來源于 EMC 的綠色熒光細胞僅在 A、B 組再生神經中可見，C 組并未發現。見圖 7。
圖7
術后 16 周各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
箭頭示縫線線結 從左至右分別為 LN、NF、GFAP 染色 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. Immunofluorescence staining in each group at 16 weeks after operation (Fluorescence mircoscopy×200)Arrowed indicated the arrowheads From left to right for laminin, neurofilament, and glial fibrillary acidic protein stainings a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
放射線治療一直是腫瘤治療中的常見手段，放療后腫瘤細胞轉移明顯減少[15]。目前已知兩種放射線導致的細胞死亡，細胞間期死亡和有絲分裂期死亡。細胞分裂時若受到了超過 100 Gy 的照射，可直接殺死處于分裂間期的細胞；而有絲分裂期死亡常在正常細胞中發生，經 X 線照射后細胞間期的 G2 期延長，從而增加了細胞死亡率[16]。同時也有研究顯示，成纖維細胞在低劑量（1～4 Gy）放射線照射后能夠造成數十小時的 G1/S 期阻滯。本實驗利用放射線這一特性，制備了細胞遷移抑制的 EMC。本實驗發現，無論是否經 X 線照射，肌外膜中細胞均從第 4 天時開始向組織外遷移[17]，第 15 天時細胞遷移抑制現象與照射劑量成正相關，且細胞形態也隨之改變。這可能是因為 X 線照射不僅加速了細胞死亡，還暫停了細胞增殖。但當照射劑量達 35 Gy 時，遷移細胞數量與 30 Gy 照射時無顯著差異。考慮到本實驗欲得到遷移細胞數盡量少的 EMC，所以選用能接受的最大放射劑量 35 Gy。
脫細胞是從新鮮組織中去除細胞核成分，僅保留細胞外基質[18]。為了判斷 EMC 中活細胞是否影響神經再生，我們希望得到肌纖維完整但無細胞核存在的 EMC。現常用脫細胞方法，如 SDS、凍融法和胰蛋白酶等，雖能有效去除細胞核，但對肌纖維均有不同程度損傷。而脫氧膽酸鈉能與細胞膜的脂質雙分子層整合，破壞并溶解細胞膜，使細胞核暴露，而 DNase 和 RNase 可溶解核酸[19]。我們將二者聯合應用，得到了無細胞核且肌纖維完整的 EMC。并經脫細胞組織學評價方法[20]，驗證了此脫細胞方法的有效性，且脫細胞后的肌外膜仍能夠縫合成管腔結構，進行下一步體內實驗。
本次體內實驗結果顯示，A 組再生坐骨神經優于 B、C 組，說明 EMC 中活細胞對坐骨神經再生起到了促進作用。免疫熒光染色顯示，A 組來源于 EMC 的 EGFP 細胞融入再生神經基底膜，包繞神經軸突；而 B 組 EGFP 細胞停留在再生神經邊緣，未向內遷移；說明 EMC 中細胞有可能參與了軸突再生的過程。甲苯胺藍染色顯示，A 組再生神經軸突優于其余兩組。然而，需要注意的是，免疫熒光染色顯示 A 組神經軸突染色較多，但雪旺細胞染色卻幾乎不可見。這可能是因為 GFAP 標記物在不成熟的雪旺細胞中表達更高，而具有成髓鞘功能的雪旺細胞屬于成熟細胞[21]。說明 EMC 中活細胞成分可能對雪旺細胞的成髓鞘起促進作用，而由肌源性干細胞轉化來的類雪旺細胞可能也更趨近于成熟[22]。C 組再生神經管腔最細，再生軸突數量最少，可能是因為在早期脫細胞后，細胞外基質可在短時間內迅速激活宿主的再生炎性反應，而其某種細胞外基質的降解產物加速了 M2 巨噬細胞的極化[23-25]，相比于 M1 型免疫反應更有利于結構的重建[26]。同時，僅存的細胞外基質有刺激受體干細胞遷移[27]和促進多能干細胞分化的功能[28]。因此，在術后同時期內，C 組有效的炎性細胞多，促進神經系統干細胞再生作用強，而因 EMC 中已無肌細胞等干擾，故神經軸突得以快速再生；但當注入的 Matrigel 被吸收后，管腔內無成纖維組織等支撐，最終再生通路塌陷。另外，有髓神經鞘的主要成分是脂質，殘留的脫氧膽酸鈉對脂質有破壞作用，進而又對新生髓鞘形成有長期影響。
綜上述，本實驗結果提示神經再生是通過細胞間交互作用產生的，EMC 中活細胞成分參與并促進了神經再生。我們將在本實驗基礎上進一步探索不同 EMC 間細胞因子的變化，以及再生早期各組神經再生情況。另外，不同處理后 EMC 造成的炎性反應對神經再生的影響機制也需研究，以期為臨床周圍神經再生提供更多選擇和理論依據。
