引用本文： 宋秀鋼, 李暉, 李瑞欣, 袁清獻, 劉迎節, 程威, 張西正. 動態力學加載下 MC3T3-E1 細胞在 3D 打印三維仿生復合支架上的成骨效應研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 448-456. doi: 10.7507/1002-1892.201711091 復制
理想的骨組織工程支架材料應具有以下特點：良好的細胞相容性、合適的降解率和孔隙率、理想的可塑性及力學強度、良好的傳導性及誘導性[1-2]，以及能為細胞的黏附、聚集、增殖、分化提供載體[3]。而支架材料的制備工藝決定了其結構性能，具有合適的三維孔隙結構是其發揮最優性能的關鍵[4]。研究表明，支架孔徑為 200～400 μm 時最有利于新骨生長[5-6]。相比傳統支架制備工藝，低溫 3D 打印聯合冷凍干燥法一方面可以避免由于高溫環境和添加有機溶劑，導致支架材料中蛋白質活性降低甚至消失的問題；另一方面可以精確控制支架孔徑與連通性，實現大、小、微孔徑共存的三維多孔體系，以利于細胞黏附伸展以及營養物質和代謝廢物的運輸。
基于 Wolff 定律和 Frost 穩態理論，力學因素是骨組織塑形和重建中的重要因素[7-8]。為了模擬成骨細胞體內生長及力學環境，本研究采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥技術，采用絲素蛋白、Ⅰ型膠原、納米羥基磷灰石制備三維仿生復合支架，構建三維培養體系。然后將 MC3T3-E1 細胞接種至支架上，進行動態力學加載培養，觀察細胞在該支架上的生物學效應。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
市售桑蠶絲棉兜、新鮮牛肌腱；納米羥基磷灰石（南京埃普瑞復合材料有限公司）；MC3T3-E1 成骨樣細胞系（協和醫科大學基礎醫學研究所）。α-MEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；DMSO（上海貝博生物科技有限公司）；青、鏈霉素混合液（南京凱基生物科技發展有限公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ型膠原、BMP-2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體及羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。
智能材料-壓電陶瓷加載裝置（Bio-Rad 公司，美國）；低溫生物 3D 打印機 （捷諾飛生物科技股份有限公司）；CO2 細胞培養箱（Forma Scientifis 公司，美國）；真空冷凍干燥機 （Thermo 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；S3000N 掃描電鏡 （Hitachi 公司，日本）；GENions 型酶標儀（TECAN 公司，奧地利）；Instron5865 力學試驗機（Instron 公司，美國）；Skyscan1076 Micro-CT（Bruker 公司，比利時）；計算機輔助設計軟件 SolidWorks（Dassault Systemes 公司，法國）；標準三維重建軟件 NReconv1.4.3（Bruker 公司，美國）。
1.2 三維仿生復合支架制備及觀測
1.2.1 絲素蛋白的制備
稱取 100 g 蠶絲置入 0.5% 無水 Na2CO3 溶液中煮沸脫膠，每次 30 min，重復 3 次。取脫膠后的蠶絲用去離子水洗滌，置于恒溫烘箱內 60℃ 烘干。按照質量比 1∶2∶8 配制 CaCl2·CH3CH2OH·H2O 三元溶液，將烘干后的蠶絲置入含 1 000 mL 三元溶液的三口瓶中，于 60℃ 機械攪拌溶解 4 h；溶解完畢后分裝入透析袋內，自來水持續透析 48 h 后，去離子水透析，每隔 8 h 更換 1 次去離子水。3 d 后將裝有絲素溶液的透析袋放入聚乙二醇溶液中進行濃縮，獲得絲素蛋白溶液。取干燥器皿稱重記為 M0；取適量絲素蛋白溶液置于器皿中，稱重記為 Ma；將絲素蛋白溶液充分烘干，稱重記為 Mb。按以下公式計算絲素蛋白濃度：（Mb—M0）/（Ma—M0）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.2 Ⅰ型膠原的制備
將新鮮牛肌腱粉碎后以 0.05 mol/L Tris 緩沖液浸泡 24 h，收集沉淀，加入含胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清，加入 3.5 mol/L NaCl 溶液鹽析，4℃ 去離子水透析沉淀物 5 d。同 1.2.1 方法測定Ⅰ型膠原濃度。
1.2.3 三維仿生復合支架制備
利用計算機輔助設計軟件 SolidWorks 設計 60 mm×30 mm×6 mm（長×寬×高）的三維支架數字模型（圖 1），并進行二維和三維模型分層，設計支架成型打印路徑，輸出文件保存為 STL 格式，將模型文件導入 3D 打印控制軟件[9]。打印參數：材料沉積速度 10 mm/s，打印層厚 0.45 mm，平臺成型溫度–20℃，擠出速度 0.15 mm/min，設備針頭直徑 0.41 mm。按照質量比為 3∶9∶2 稱取絲素蛋白、Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石，充分攪拌混合后，裝入低溫打印機料筒中進行打印，初步成型后–80℃ 過夜，置入–50℃ 真空冷凍干燥機中 72 h 進行成型穩定，分別用無水乙醇和 0.5%NaOH 溶液后處理，去離子水反復沖洗，60Co 滅菌后低溫冷凍保存備用。
圖1
三維仿生復合支架數字模型
Figure1.
3D biomimetic composite scaffold model
1.2.4 三維仿生復合支架觀測指標
① 結構參數：隨機取 3 個支架樣本，置入 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，放于 Micro-CT 樣本槽中，設置掃描參數：掃描空間分辨率 12 μm、射線電壓 44 kV、電流 226 μA，掃描視野 2 cm×2 cm×2 cm。掃描后應用標準三維重建軟件 NReconv1.4.3 進行整體重建，獲得樣本二維及三維圖像，分析其孔徑及孔隙率。
② 理化性能檢測：首先，隨機取 3 個支架樣本，測定吸水膨脹率。標本置于恒溫烘箱干燥后冷卻至室溫，稱重記為 M0；將支架浸于 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，濾紙吸干表面水分，稱重記為 Mw。按以下公式計算支架吸水膨脹率：（Mw－M0）/M0×100%。
然后，隨機取 3 個支架樣本行力學性能檢測。于37℃下將樣本置于 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，模擬體內生理環境。再置于 Instron5865 力學試驗機，測試參數：預載荷 0.05 N，最大壓縮應變 10%，每個樣本循環測試 3 次，繪制應力-應變曲線，計算支架的彈性模量。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 細胞-支架復合培養及分組
根據培養方法不同，實驗分為兩組。首先，取支架浸入完全培養液中，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中靜置 24 h 后備用。取 MC3T3-E1 細胞接種于 25T 培養瓶中，采用 α-MEM 完全培養液培養，待細胞長成單層進行傳代，棄培養液；加入 37℃ 預溫的 0.25% 胰蛋白酶，37℃ 下消化 2～3 min，棄去消化液；加入少量 α-MEM 完全培養液反復吹打，使細胞分散均勻，以離心半徑 19 cm、1 000 r/min 離心 5 min，用移液槍取 200 μL 細胞懸液接種至支架上，每個支架接種約 1×106個細胞，于 37℃、5%CO2 條件下復合培養 4 h 后，加入 α-MEM 完全培養液，每 2 天換液 1 次。
實驗組復合培養期間采用智能材料-壓電陶瓷加載裝置進行動態軸向力學加載，每天加載 1 次、每次 15 min、頻率 1 Hz、垂直方向的最大壓縮應變為 3 500 με[10]。具體操作：智能材料-壓電陶瓷加載裝置使用前先用 75% 乙醇擦拭動力加載單元，紫外燈照射 2 h。將培養小室放入裝置中，再將整個加載裝置放入孵箱中，保證細胞處于無菌環境。控制電路置于孵箱外，開啟加載裝置電源，對細胞-支架復合物施加的應變大小可通過顯示器對應變范圍進行調節。對照組不作力學加載。培養 7、14 d 后取兩組細胞-支架復合物進行觀測。
1.3.2 觀測指標
① 組織學觀察：兩組細胞-支架復合物置于甲醛中固定，石蠟包埋切片，片厚 5 μm，HE 染色，光鏡下觀察成骨細胞在支架內部的分布及形態。分別于 40、100、200、400 倍鏡下，隨機選取 3 個視野，采用 Image J 軟件計數成骨細胞。
② 掃描電鏡觀察：兩組細胞-支架復合物于 4℃ 經 5% 戊二醛溶液、1% 鋨酸固定、常規乙醇梯度脫水、臨界點干燥、鍍金等處理后，掃描電鏡下觀察細胞在支架上的生長情況。
③ 實時熒光定量 PCR 檢測：取兩組細胞-支架復合物，棄除培養液后收集細胞，加入 Trizol 裂解液，提取總 RNA，反轉錄成 cDNA；目的基因引物序列見表 1。采用 SYBR Green 熒光定量試劑按以下條件進行擴增：95℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 30 s，共 50 個循環。采用 2–ΔΔCt法計算目的基因 Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of targeted genes
④ Western blot 檢測：取兩組細胞-支架復合物，收集細胞后以 RIPA 緩沖液進行裂解，提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白濃度，等量總蛋白采用 SDS-PAGE 法分離后轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠 BMP-2、Ⅰ型膠原、OCN 一抗（1∶5 000）孵育，4℃ 過夜，PBST 充分漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗，室溫孵育 1 h，采用化學發光法 ECL 顯影，顯影定影后觀察結果，以 GAPDH 為內參，計算目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間及組內兩時間點比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 三維仿生復合支架觀測
制備的三維仿生復合支架為白色立方體網格，規格長 60 mm、寬 30 mm，干態質硬，濕態柔軟（圖 2a）。Micro-CT 檢測并三維重建下可見支架材料內部呈孔隙網狀結構，孔隙連通性良好（圖 2b）；大孔徑直徑為（506.37±18.63）μm，微孔徑直徑為（62.14±17.35）μm，孔隙率為 97.70%±1.37%，吸水膨脹率為 1 341.97%±64.41%。力學測試示，支架壓縮至 10% 時，支架壓縮位移為（0.376±0.004）mm、壓縮應力為（0.016±0.002）MPa、彈性模量為（162.418±18.754）kPa。
圖2
三維仿生復合支架觀察
a. 大體觀察（干態）；b. 利用 Micro-CT 掃描數據進行三維重建
Figure2. 3D biomimetic composite scaffold observationa. General morphology of scaffold (dry condition); b. 3D reconstruction of scaffold by Micro-CT
2.2 細胞-支架復合培養觀測
2.2.1 組織學觀察
實驗組及對照組支架內部均呈多孔結構，可見細胞在孔隙內部生長，且 14 d 時細胞較 7 d 明顯增多；但同時間點實驗組支架內細胞多于對照組。見圖 3。除 200 倍鏡下 14 d 時兩組細胞計數差異無統計學意義（t=–2.024，P=0.080）外，其余不同放大倍數下各時間點組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖3
兩組 HE 染色觀察
從左至右分別為放大 200、400、1 000 倍 a. 實驗組 7 d；b. 對照組 7 d；c. 實驗組 14 d；d. 對照組 14 d
Figure3. HE staining observation of 2 groupsForm left to right for 200-, 400-, and 1 000-folds a. Experimental group at 7 days; b. Control group at 7 days; c. Experimental group at 14 days; d. Control group at 14 days
表2
兩組 HE 染色細胞計數比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of HE staining positive cells counting between 2 groups (n=3, 
)
2.2.2 掃描電鏡觀察
實驗組：培養 7 d 后可見細胞在支架表面生長，細胞形態呈扁平狀；14 d 后細胞較 7 d 時明顯增多，細胞形態較 7 d 更扁平。對照組：培養 7 d 后同樣可見細胞在支架表面生長，但細胞呈梭形；14 d 時細胞較 7 d 有所增加，但少于同時間點實驗組。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察支架上細胞生長情況
從左至右分別為放大 200、400、800 倍 a. 實驗組 7 d；b. 對照組 7 d；c. 實驗組 14 d；d. 對照組 14 d
Figure4. Scanning electron microscopy observation of scaffold surface cell growth statusForm left to right for 200-, 400-, and 800-folds a. Experimental group at 7 days; b. Control group at 7 days; c. Experimental group at 14 days; d. Control group at 14 days
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測
組間比較：實驗組培養 7、14 d 時Ⅰ型膠原、OCN mRNA 相對表達量與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），但 BMP-2 mRNA 相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
組內比較：實驗組 7、14 d Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；BMP-2、OCN mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義 （P>0.05）。對照組 7、14 d Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN mRNA 相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
兩組Ⅰ型膠原、BMP-2 及 OCN mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of the mRNA relative expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN between 2 groups (n=3, 
)
2.2.4 Western blot 檢測
組間比較：實驗組培養 7、14 d 時Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN 蛋白相對表達量與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。組內比較：兩組 7、14 d Ⅰ型膠原、BMP-2 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；但 OCN 蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5、表 4。
圖5
Western blot 檢測Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN 蛋白表達1：對照組 7 d 2：對照組 14 d 3：實驗組 7 d 4：實驗組 14 d
Figure5.
Expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN proteins by Western blot
1: Control group at 7 days 2: Control group at 14 days 3: Experimental group at 7 days 4: Experimental group at 14 days
3 討論
本實驗首先由計算機模擬構建出三維多孔支架模型，采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥法制備三維多孔支架，經 Micro-CT 及掃描電鏡觀察顯示支架內部孔隙度好，孔隙相互連通，能為細胞生長以及進行物質交換提供必要條件。骨重建單元主要由緊密耦合的破骨細胞和成骨細胞組成，即破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成作用共同協調下完成。研究表明，力學因素是骨重塑的重要因素，應變梯度變化會導致成骨細胞和破骨細胞的連續激活[8]。基于 Frost 穩態模型，人骨骼生理載荷范圍為 50～2 500 με，而支架材料具有應力屏蔽作用[11]，所以本實驗選用表觀應變 3 500 με 對細胞-支架復合物進行動態力學加載[12-13]。培養 7、14 d 后 HE 染色觀察示，實驗組支架內細胞較對照組明顯增多，主要分布于支架孔壁周圍。掃描電鏡觀察示，對照組支架表面細胞明顯增多，細胞形態呈梭形；而實驗組經力學加載后細胞形態由梭形變為扁平狀，這與骨形成分化時，梭形成骨始祖細胞分化為扁平狀成熟的成骨細胞形態相符合[14-15]。以上研究結果提示，本實驗制備的三維仿生復合支架與細胞支架相容性良好，并且力學加載能促進細胞在支架表面黏附、聚集、增殖及分化。
BMP 是骨生長的一種促進因子，具有誘導成骨的作用，與骨細胞的形成和改建密切相關。BMP 通過作用于間充質細胞、成纖維細胞等細胞胞膜受體，使這些細胞的 DNA 序列發生改變，向著骨系細胞方向分化。現已發現 BMP 家族至少有 20 個成員，不同的 BMP 成員對成骨具有不同的誘導作用。其中 BMP-2 被認為是活性最強且唯一能單獨誘導成骨的因子[16]。正常骨基質中含有少量 BMP-2，主要存在于成骨細胞、骨膜和骨髓細胞中，并通過自分泌或旁分泌的形式誘導成骨細胞分化，形成新骨[17]。成骨細胞來源于多潛能間充質骨源細胞，是重要的力學刺激感受細胞，它可以將力學刺激信號轉變為細胞的生物化學合成反應，分泌骨基質并促進骨基質礦化。同時，力學刺激可促進成骨細胞的增殖和合成代謝，促進骨組織的重建，進而促進骨組織的內環境穩定。生理范圍的應變刺激可能通過影響 BMP-2 mRNA 表達，促進成骨細胞的增殖分化[17-18] 。閆玉仙等[16]研究結果表明，5 000 με 超生理應變范圍力學加載下，可以明顯上調破骨細胞 BMP-2 mRNA 表達，這與成骨細胞的作用相反，提示在生理應變范圍內的力學刺激下，成骨細胞通過促進 BMP-2 mRNA 的表達促進成骨的同時，破骨細胞通過抑制 BMP-2 mRNA 的表達來抑制骨吸收，從而促進骨的修復重建。本實驗在三維培養條件下，施加生理范圍的應變刺激后，實驗組 BMP-2 mRNA 及蛋白表達均高于對照組，說明力學刺激促進了骨形成。
Ⅰ型膠原和 OCN 表達變化可以反映成骨細胞的分化情況[19]，是成骨細胞晚期分化的標志。Ⅰ型膠原、OCN mRNA 與蛋白表達并不完全一致。Ⅰ型膠原是前體成骨細胞分化為成熟成骨細胞時分泌，是骨基質的主要組成成分[20]。OCN 是骨轉換標志物之一[21]，主要是活化的破骨細胞和成骨細胞分泌的一種特異性非膠原蛋白，其能通過調節羥基磷灰石量和大小來完成礦物的有序沉積，表達水平增高是骨代謝細胞分化成熟、處于功能狀態的標志，其 mRNA 調節需在膠原合成基礎上進行[22-24]。本實驗結果顯示，實驗組力學加載后細胞Ⅰ型膠原、OCN mRNA 及蛋白表達均高于對照組，Ⅰ型膠原合成處于上升趨勢，表明細胞還未完全分化成熟。
既往閆玉仙等[16]及唐麗靈等[25]采用四點彎曲實驗裝置對細胞進行動態力學加載，觀察成骨細胞二維培養條件下的生物學效應。本實驗是采用三維培養觀察成骨細胞在力學加載下的生物學效應。與二維培養相比，我們發現在生理應變范圍且一定頻率的力學刺激下，MC3T3-E1 細胞Ⅰ型膠原、OCN、BMP-2 表達均明顯上調。但在二維培養條件下，超過 5 000 με 的應變刺激對 MC3T3-E1 細胞的以上因子表達有抑制作用，而且持續的力學刺激也會降低其表達。由于在三維培養條件下，支架材料有對應力屏蔽及應力集中現象[11]，對細胞-支架復合物表觀力學刺激的力學參數應大于細胞的微觀生理應變范圍（50～2 000 με）[18]。本實驗室前期研究顯示，當表觀應變>3 500 με 時，支架內部超生理應變范圍的節點數量明顯增加，會對黏附于支架孔壁的細胞造成損傷[14]，因此本實驗采用 3 500 με 作為表觀應變，結果提示此表觀應變為最適應變范圍。
綜上述，本研究采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥技術成功制備三維仿生復合支架，并在體外建立動態力學加載下的三維培養模型，且動態力學加載促進了成骨細胞在支架上的黏附、聚集、增殖及分化。
表4
兩組Ⅰ型膠原、BMP-2 及 OCN 蛋白相對表達量比較（n=3，
）
Table4.
Comparison of the protein relative expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN between 2 groups (n=3, 
)
理想的骨組織工程支架材料應具有以下特點：良好的細胞相容性、合適的降解率和孔隙率、理想的可塑性及力學強度、良好的傳導性及誘導性[1-2]，以及能為細胞的黏附、聚集、增殖、分化提供載體[3]。而支架材料的制備工藝決定了其結構性能，具有合適的三維孔隙結構是其發揮最優性能的關鍵[4]。研究表明，支架孔徑為 200～400 μm 時最有利于新骨生長[5-6]。相比傳統支架制備工藝，低溫 3D 打印聯合冷凍干燥法一方面可以避免由于高溫環境和添加有機溶劑，導致支架材料中蛋白質活性降低甚至消失的問題；另一方面可以精確控制支架孔徑與連通性，實現大、小、微孔徑共存的三維多孔體系，以利于細胞黏附伸展以及營養物質和代謝廢物的運輸。
基于 Wolff 定律和 Frost 穩態理論，力學因素是骨組織塑形和重建中的重要因素[7-8]。為了模擬成骨細胞體內生長及力學環境，本研究采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥技術，采用絲素蛋白、Ⅰ型膠原、納米羥基磷灰石制備三維仿生復合支架，構建三維培養體系。然后將 MC3T3-E1 細胞接種至支架上，進行動態力學加載培養，觀察細胞在該支架上的生物學效應。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
市售桑蠶絲棉兜、新鮮牛肌腱；納米羥基磷灰石（南京埃普瑞復合材料有限公司）；MC3T3-E1 成骨樣細胞系（協和醫科大學基礎醫學研究所）。α-MEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；DMSO（上海貝博生物科技有限公司）；青、鏈霉素混合液（南京凱基生物科技發展有限公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ型膠原、BMP-2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體及羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。
智能材料-壓電陶瓷加載裝置（Bio-Rad 公司，美國）；低溫生物 3D 打印機 （捷諾飛生物科技股份有限公司）；CO2 細胞培養箱（Forma Scientifis 公司，美國）；真空冷凍干燥機 （Thermo 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；S3000N 掃描電鏡 （Hitachi 公司，日本）；GENions 型酶標儀（TECAN 公司，奧地利）；Instron5865 力學試驗機（Instron 公司，美國）；Skyscan1076 Micro-CT（Bruker 公司，比利時）；計算機輔助設計軟件 SolidWorks（Dassault Systemes 公司，法國）；標準三維重建軟件 NReconv1.4.3（Bruker 公司，美國）。
1.2 三維仿生復合支架制備及觀測
1.2.1 絲素蛋白的制備
稱取 100 g 蠶絲置入 0.5% 無水 Na2CO3 溶液中煮沸脫膠，每次 30 min，重復 3 次。取脫膠后的蠶絲用去離子水洗滌，置于恒溫烘箱內 60℃ 烘干。按照質量比 1∶2∶8 配制 CaCl2·CH3CH2OH·H2O 三元溶液，將烘干后的蠶絲置入含 1 000 mL 三元溶液的三口瓶中，于 60℃ 機械攪拌溶解 4 h；溶解完畢后分裝入透析袋內，自來水持續透析 48 h 后，去離子水透析，每隔 8 h 更換 1 次去離子水。3 d 后將裝有絲素溶液的透析袋放入聚乙二醇溶液中進行濃縮，獲得絲素蛋白溶液。取干燥器皿稱重記為 M0；取適量絲素蛋白溶液置于器皿中，稱重記為 Ma；將絲素蛋白溶液充分烘干，稱重記為 Mb。按以下公式計算絲素蛋白濃度：（Mb—M0）/（Ma—M0）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.2.2 Ⅰ型膠原的制備
將新鮮牛肌腱粉碎后以 0.05 mol/L Tris 緩沖液浸泡 24 h，收集沉淀，加入含胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清，加入 3.5 mol/L NaCl 溶液鹽析，4℃ 去離子水透析沉淀物 5 d。同 1.2.1 方法測定Ⅰ型膠原濃度。
1.2.3 三維仿生復合支架制備
利用計算機輔助設計軟件 SolidWorks 設計 60 mm×30 mm×6 mm（長×寬×高）的三維支架數字模型（圖 1），并進行二維和三維模型分層，設計支架成型打印路徑，輸出文件保存為 STL 格式，將模型文件導入 3D 打印控制軟件[9]。打印參數：材料沉積速度 10 mm/s，打印層厚 0.45 mm，平臺成型溫度–20℃，擠出速度 0.15 mm/min，設備針頭直徑 0.41 mm。按照質量比為 3∶9∶2 稱取絲素蛋白、Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石，充分攪拌混合后，裝入低溫打印機料筒中進行打印，初步成型后–80℃ 過夜，置入–50℃ 真空冷凍干燥機中 72 h 進行成型穩定，分別用無水乙醇和 0.5%NaOH 溶液后處理，去離子水反復沖洗，60Co 滅菌后低溫冷凍保存備用。
圖1
三維仿生復合支架數字模型
Figure1.
3D biomimetic composite scaffold model
1.2.4 三維仿生復合支架觀測指標
① 結構參數：隨機取 3 個支架樣本，置入 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，放于 Micro-CT 樣本槽中，設置掃描參數：掃描空間分辨率 12 μm、射線電壓 44 kV、電流 226 μA，掃描視野 2 cm×2 cm×2 cm。掃描后應用標準三維重建軟件 NReconv1.4.3 進行整體重建，獲得樣本二維及三維圖像，分析其孔徑及孔隙率。
② 理化性能檢測：首先，隨機取 3 個支架樣本，測定吸水膨脹率。標本置于恒溫烘箱干燥后冷卻至室溫，稱重記為 M0；將支架浸于 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，濾紙吸干表面水分，稱重記為 Mw。按以下公式計算支架吸水膨脹率：（Mw－M0）/M0×100%。
然后，隨機取 3 個支架樣本行力學性能檢測。于37℃下將樣本置于 PBS 緩沖液中 24 h 直至平衡，模擬體內生理環境。再置于 Instron5865 力學試驗機，測試參數：預載荷 0.05 N，最大壓縮應變 10%，每個樣本循環測試 3 次，繪制應力-應變曲線，計算支架的彈性模量。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 細胞-支架復合培養及分組
根據培養方法不同，實驗分為兩組。首先，取支架浸入完全培養液中，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中靜置 24 h 后備用。取 MC3T3-E1 細胞接種于 25T 培養瓶中，采用 α-MEM 完全培養液培養，待細胞長成單層進行傳代，棄培養液；加入 37℃ 預溫的 0.25% 胰蛋白酶，37℃ 下消化 2～3 min，棄去消化液；加入少量 α-MEM 完全培養液反復吹打，使細胞分散均勻，以離心半徑 19 cm、1 000 r/min 離心 5 min，用移液槍取 200 μL 細胞懸液接種至支架上，每個支架接種約 1×106個細胞，于 37℃、5%CO2 條件下復合培養 4 h 后，加入 α-MEM 完全培養液，每 2 天換液 1 次。
實驗組復合培養期間采用智能材料-壓電陶瓷加載裝置進行動態軸向力學加載，每天加載 1 次、每次 15 min、頻率 1 Hz、垂直方向的最大壓縮應變為 3 500 με[10]。具體操作：智能材料-壓電陶瓷加載裝置使用前先用 75% 乙醇擦拭動力加載單元，紫外燈照射 2 h。將培養小室放入裝置中，再將整個加載裝置放入孵箱中，保證細胞處于無菌環境。控制電路置于孵箱外，開啟加載裝置電源，對細胞-支架復合物施加的應變大小可通過顯示器對應變范圍進行調節。對照組不作力學加載。培養 7、14 d 后取兩組細胞-支架復合物進行觀測。
1.3.2 觀測指標
① 組織學觀察：兩組細胞-支架復合物置于甲醛中固定，石蠟包埋切片，片厚 5 μm，HE 染色，光鏡下觀察成骨細胞在支架內部的分布及形態。分別于 40、100、200、400 倍鏡下，隨機選取 3 個視野，采用 Image J 軟件計數成骨細胞。
② 掃描電鏡觀察：兩組細胞-支架復合物于 4℃ 經 5% 戊二醛溶液、1% 鋨酸固定、常規乙醇梯度脫水、臨界點干燥、鍍金等處理后，掃描電鏡下觀察細胞在支架上的生長情況。
③ 實時熒光定量 PCR 檢測：取兩組細胞-支架復合物，棄除培養液后收集細胞，加入 Trizol 裂解液，提取總 RNA，反轉錄成 cDNA；目的基因引物序列見表 1。采用 SYBR Green 熒光定量試劑按以下條件進行擴增：95℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 30 s，共 50 個循環。采用 2–ΔΔCt法計算目的基因 Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of targeted genes
④ Western blot 檢測：取兩組細胞-支架復合物，收集細胞后以 RIPA 緩沖液進行裂解，提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白濃度，等量總蛋白采用 SDS-PAGE 法分離后轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠 BMP-2、Ⅰ型膠原、OCN 一抗（1∶5 000）孵育，4℃ 過夜，PBST 充分漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗，室溫孵育 1 h，采用化學發光法 ECL 顯影，顯影定影后觀察結果，以 GAPDH 為內參，計算目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間及組內兩時間點比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 三維仿生復合支架觀測
制備的三維仿生復合支架為白色立方體網格，規格長 60 mm、寬 30 mm，干態質硬，濕態柔軟（圖 2a）。Micro-CT 檢測并三維重建下可見支架材料內部呈孔隙網狀結構，孔隙連通性良好（圖 2b）；大孔徑直徑為（506.37±18.63）μm，微孔徑直徑為（62.14±17.35）μm，孔隙率為 97.70%±1.37%，吸水膨脹率為 1 341.97%±64.41%。力學測試示，支架壓縮至 10% 時，支架壓縮位移為（0.376±0.004）mm、壓縮應力為（0.016±0.002）MPa、彈性模量為（162.418±18.754）kPa。
圖2
三維仿生復合支架觀察
a. 大體觀察（干態）；b. 利用 Micro-CT 掃描數據進行三維重建
Figure2. 3D biomimetic composite scaffold observationa. General morphology of scaffold (dry condition); b. 3D reconstruction of scaffold by Micro-CT
2.2 細胞-支架復合培養觀測
2.2.1 組織學觀察
實驗組及對照組支架內部均呈多孔結構，可見細胞在孔隙內部生長，且 14 d 時細胞較 7 d 明顯增多；但同時間點實驗組支架內細胞多于對照組。見圖 3。除 200 倍鏡下 14 d 時兩組細胞計數差異無統計學意義（t=–2.024，P=0.080）外，其余不同放大倍數下各時間點組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖3
兩組 HE 染色觀察
從左至右分別為放大 200、400、1 000 倍 a. 實驗組 7 d；b. 對照組 7 d；c. 實驗組 14 d；d. 對照組 14 d
Figure3. HE staining observation of 2 groupsForm left to right for 200-, 400-, and 1 000-folds a. Experimental group at 7 days; b. Control group at 7 days; c. Experimental group at 14 days; d. Control group at 14 days
表2
兩組 HE 染色細胞計數比較（n=3，）
Table2.
Comparison of HE staining positive cells counting between 2 groups (n=3, )
2.2.2 掃描電鏡觀察
實驗組：培養 7 d 后可見細胞在支架表面生長，細胞形態呈扁平狀；14 d 后細胞較 7 d 時明顯增多，細胞形態較 7 d 更扁平。對照組：培養 7 d 后同樣可見細胞在支架表面生長，但細胞呈梭形；14 d 時細胞較 7 d 有所增加，但少于同時間點實驗組。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察支架上細胞生長情況
從左至右分別為放大 200、400、800 倍 a. 實驗組 7 d；b. 對照組 7 d；c. 實驗組 14 d；d. 對照組 14 d
Figure4. Scanning electron microscopy observation of scaffold surface cell growth statusForm left to right for 200-, 400-, and 800-folds a. Experimental group at 7 days; b. Control group at 7 days; c. Experimental group at 14 days; d. Control group at 14 days
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測
組間比較：實驗組培養 7、14 d 時Ⅰ型膠原、OCN mRNA 相對表達量與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），但 BMP-2 mRNA 相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
組內比較：實驗組 7、14 d Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；BMP-2、OCN mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義 （P>0.05）。對照組 7、14 d Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN mRNA 相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
兩組Ⅰ型膠原、BMP-2 及 OCN mRNA 相對表達量比較（n=3，）
Table3.
Comparison of the mRNA relative expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN between 2 groups (n=3, )
2.2.4 Western blot 檢測
組間比較：實驗組培養 7、14 d 時Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN 蛋白相對表達量與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。組內比較：兩組 7、14 d Ⅰ型膠原、BMP-2 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；但 OCN 蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5、表 4。
圖5
Western blot 檢測Ⅰ型膠原、BMP-2、OCN 蛋白表達1：對照組 7 d 2：對照組 14 d 3：實驗組 7 d 4：實驗組 14 d
Figure5.
Expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN proteins by Western blot
1: Control group at 7 days 2: Control group at 14 days 3: Experimental group at 7 days 4: Experimental group at 14 days
3 討論
本實驗首先由計算機模擬構建出三維多孔支架模型，采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥法制備三維多孔支架，經 Micro-CT 及掃描電鏡觀察顯示支架內部孔隙度好，孔隙相互連通，能為細胞生長以及進行物質交換提供必要條件。骨重建單元主要由緊密耦合的破骨細胞和成骨細胞組成，即破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成作用共同協調下完成。研究表明，力學因素是骨重塑的重要因素，應變梯度變化會導致成骨細胞和破骨細胞的連續激活[8]。基于 Frost 穩態模型，人骨骼生理載荷范圍為 50～2 500 με，而支架材料具有應力屏蔽作用[11]，所以本實驗選用表觀應變 3 500 με 對細胞-支架復合物進行動態力學加載[12-13]。培養 7、14 d 后 HE 染色觀察示，實驗組支架內細胞較對照組明顯增多，主要分布于支架孔壁周圍。掃描電鏡觀察示，對照組支架表面細胞明顯增多，細胞形態呈梭形；而實驗組經力學加載后細胞形態由梭形變為扁平狀，這與骨形成分化時，梭形成骨始祖細胞分化為扁平狀成熟的成骨細胞形態相符合[14-15]。以上研究結果提示，本實驗制備的三維仿生復合支架與細胞支架相容性良好，并且力學加載能促進細胞在支架表面黏附、聚集、增殖及分化。
BMP 是骨生長的一種促進因子，具有誘導成骨的作用，與骨細胞的形成和改建密切相關。BMP 通過作用于間充質細胞、成纖維細胞等細胞胞膜受體，使這些細胞的 DNA 序列發生改變，向著骨系細胞方向分化。現已發現 BMP 家族至少有 20 個成員，不同的 BMP 成員對成骨具有不同的誘導作用。其中 BMP-2 被認為是活性最強且唯一能單獨誘導成骨的因子[16]。正常骨基質中含有少量 BMP-2，主要存在于成骨細胞、骨膜和骨髓細胞中，并通過自分泌或旁分泌的形式誘導成骨細胞分化，形成新骨[17]。成骨細胞來源于多潛能間充質骨源細胞，是重要的力學刺激感受細胞，它可以將力學刺激信號轉變為細胞的生物化學合成反應，分泌骨基質并促進骨基質礦化。同時，力學刺激可促進成骨細胞的增殖和合成代謝，促進骨組織的重建，進而促進骨組織的內環境穩定。生理范圍的應變刺激可能通過影響 BMP-2 mRNA 表達，促進成骨細胞的增殖分化[17-18] 。閆玉仙等[16]研究結果表明，5 000 με 超生理應變范圍力學加載下，可以明顯上調破骨細胞 BMP-2 mRNA 表達，這與成骨細胞的作用相反，提示在生理應變范圍內的力學刺激下，成骨細胞通過促進 BMP-2 mRNA 的表達促進成骨的同時，破骨細胞通過抑制 BMP-2 mRNA 的表達來抑制骨吸收，從而促進骨的修復重建。本實驗在三維培養條件下，施加生理范圍的應變刺激后，實驗組 BMP-2 mRNA 及蛋白表達均高于對照組，說明力學刺激促進了骨形成。
Ⅰ型膠原和 OCN 表達變化可以反映成骨細胞的分化情況[19]，是成骨細胞晚期分化的標志。Ⅰ型膠原、OCN mRNA 與蛋白表達并不完全一致。Ⅰ型膠原是前體成骨細胞分化為成熟成骨細胞時分泌，是骨基質的主要組成成分[20]。OCN 是骨轉換標志物之一[21]，主要是活化的破骨細胞和成骨細胞分泌的一種特異性非膠原蛋白，其能通過調節羥基磷灰石量和大小來完成礦物的有序沉積，表達水平增高是骨代謝細胞分化成熟、處于功能狀態的標志，其 mRNA 調節需在膠原合成基礎上進行[22-24]。本實驗結果顯示，實驗組力學加載后細胞Ⅰ型膠原、OCN mRNA 及蛋白表達均高于對照組，Ⅰ型膠原合成處于上升趨勢，表明細胞還未完全分化成熟。
既往閆玉仙等[16]及唐麗靈等[25]采用四點彎曲實驗裝置對細胞進行動態力學加載，觀察成骨細胞二維培養條件下的生物學效應。本實驗是采用三維培養觀察成骨細胞在力學加載下的生物學效應。與二維培養相比，我們發現在生理應變范圍且一定頻率的力學刺激下，MC3T3-E1 細胞Ⅰ型膠原、OCN、BMP-2 表達均明顯上調。但在二維培養條件下，超過 5 000 με 的應變刺激對 MC3T3-E1 細胞的以上因子表達有抑制作用，而且持續的力學刺激也會降低其表達。由于在三維培養條件下，支架材料有對應力屏蔽及應力集中現象[11]，對細胞-支架復合物表觀力學刺激的力學參數應大于細胞的微觀生理應變范圍（50～2 000 με）[18]。本實驗室前期研究顯示，當表觀應變>3 500 με 時，支架內部超生理應變范圍的節點數量明顯增加，會對黏附于支架孔壁的細胞造成損傷[14]，因此本實驗采用 3 500 με 作為表觀應變，結果提示此表觀應變為最適應變范圍。
綜上述，本研究采用低溫 3D 打印聯合冷凍干燥技術成功制備三維仿生復合支架，并在體外建立動態力學加載下的三維培養模型，且動態力學加載促進了成骨細胞在支架上的黏附、聚集、增殖及分化。
表4
兩組Ⅰ型膠原、BMP-2 及 OCN 蛋白相對表達量比較（n=3，）
Table4.
Comparison of the protein relative expressions of collagen type Ⅰ, BMP-2, and OCN between 2 groups (n=3, )
