引用本文： 高堪達, 王漱陽, 王秋根. 淫羊藿苷治療小鼠骨關節炎后血清學及組織學改變的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(8): 963-969. doi: 10.7507/1002-1892.201703044 復制
一般認為，軟骨退變是骨關節炎（osteoarthritis，OA）的特征性表現。但近年研究發現，軟骨下骨改變也是 OA 病變重要方面[1-3]，而且軟骨下骨結構與生物力學性能的改變可以促使軟骨退變[2-3]。因此，有效控制軟骨下骨代謝和骨重塑速度，有望為 OA 提供一種新治療方法[1-3]。基于以上認識，作用于骨重建過程的中藥可以作為 OA 防治的候選藥物。中藥組分淫羊藿苷（icariin，ICA）能通過改善骨重建達到治療骨質疏松的目的，本研究將分別于小鼠 OA 早期和晚期給予 ICA 治療，觀察血清中與膝關節 OA 診斷和療效評價相關的細胞因子、代謝產物表達[4-5]變化，同時觀察軟骨和軟骨下骨組織形態學改變，從而初步探討 ICA 對 OA 的治療效果。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
80 只 8 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠，體質量（21±1）g，購于上海西普爾-必凱動物實驗有限公司。ICA（南京澤朗醫藥科技有限公司），用 DMSO 溶解后制成濃縮儲存液，灌胃前采用生理鹽水稀釋。
BCA 蛋白濃度測定試劑盒（PIERCE 公司，美國）；Ⅰ型膠原 C 末端肽（C-telopeptide of typeⅠcollagen，CTX）、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA 試劑盒（Biomedical Technologies 公司，美國）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（Abcam 公司，英國）；IL-1β ELISA 試劑盒（R&D system 公司，美國）。熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 實驗分組 將 80 只小鼠隨機分為 8 組，每組 10 只，分別為假手術/早期生理鹽水組（A 組）、假手術/早期 ICA 組（B 組）、前交叉韌帶切斷術（anterior cruciate ligament transaction，ACLT）/早期生理鹽水組（C 組）、ACLT/早期 ICA 組（D 組）、假手術/晚期生理鹽水組（E 組）、假手術/晚期 ICA 組（F 組）、ACLT/晚期生理鹽水組（G 組）、ACLT/晚期 ICA 組（H 組）。
1.2.2 動物模型制備 C、D、G、H 組小鼠行 ACLT，制備 OA 模型。具體步驟：采用 10% 水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，小鼠仰臥并固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。沿右膝關節髕骨外側切口，依次切開皮膚、皮下各層，鈍性分離肌肉組織，直至切開關節腔。向側方牽開髕韌帶，屈膝 90°，顯露前交叉韌帶并切斷，止血后生理鹽水充分沖洗關節腔，依次縫合各層組織。A、B、E、F 組除術中僅打開小鼠膝關節囊，不切斷前交叉韌帶外，其余操作與其他組一致。各組術后連續 3 d 肌肉注射青霉素 2 萬 U 預防感染，自由進食飲水，不行任何固定，分籠飼養。
1.2.3 給藥方法 B、D 組于術后第 1 天開始，每天采用灌胃方式給予 ICA（10 mg/kg）至第 8 周；A、C 組于相同時間點給予相同體積生理鹽水。F、H 組于術后第 4 周開始每天采用灌胃方式給予 ICA（10 mg/kg）至第 8 周；E、G 組于相同時間點給予相同體積生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 血清學指標測量 術后第 8 周各組小鼠斷頸處死，用注射器從心臟取血 1 mL，置于 1.5 mL 離心管（不含抗凝劑），室溫靜置 30 min，然后室溫下以 1 500×g 離心 10 min，取上層血清，采用 ELISA 法測量 CTX、OC、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量。
1.3.2 組織學觀察 切取小鼠膝關節上、下各 2 cm 區域組織，去除皮膚，置于 4% 多聚甲醛液中，4℃ 固定 24 h 后，剔除周圍軟組織及韌帶，PBS 浸洗，流水沖洗 2 h，10%EDTA 液加微波脫鈣 2 周，流水沖洗 24 h，截取脛骨部分并修整組織塊后石蠟包埋，作矢狀面不連續切片，片厚 5 μm，行阿辛藍/蘇木精-酸性橙 G 染色。具體步驟：將切片依次浸入二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水；自來水沖洗；置于 1% 鹽酸乙醇 30 s，瀝干；置于阿辛藍/蘇木精中和 30 min；去離子水充分清洗；置于 0.5% 氨溶液 15 s；去離子水充分清洗；置于 95% 乙醇 1 min，瀝干；置于酸性橙 G 中 1.5 min；95% 乙醇清洗 3 次；脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。切片置于顯微鏡下觀察。采用雙盲法參照骨關節炎國際研究學會（OARSI）評分標準，從基質染色、軟骨組織結構、軟骨細胞簇集、潮線完整性四方面評分[6]，以評價軟骨退變程度。總分 24 分，評分越高，表明關節軟骨破壞越嚴重。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 血清學檢測指標
2.1.1 CTX 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 CTX 含量降低（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 CTX 含量升高（P<0.05）。見圖 1a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 CTX 含量降低（P<0.05）；H 組與 G 組相比，血清 CTX 含量升高（P<0.05）。見圖 1b。
2.1.2 OC 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 OC 含量降低（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 OC 含量升高（P<0.05）。見圖 2a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 OC 含量降低（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
2.1.3 IL-6 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 IL-6 含量升高（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 IL-6 含量降低（P<0.05）。見圖 3a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 IL-6 含量升高（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3b。
2.1.4 TNF-α 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 TNF-α 含量升高（P<0.05）；C、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，TNF-α 含量升高（P<0.05），G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
2.1.5 IL-1β 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，IL-1β 含量升高（P<0.05），C、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，IL-1β 含量升高（P<0.05），G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5 b。
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察 術后第 8 周，C、G 組與對應的 A、B 組及 E、F 組相比，小鼠脛骨軟骨缺失明顯，小鼠脛骨平臺透明軟骨變薄甚至消失；鈣化軟骨層厚度減小甚至全層消失；潮線呈現不規則延伸，模糊甚至消失；軟骨下骨廣泛裸露，軟骨下皮質骨板變厚，骨小梁形狀纖細，數量減少，呈現晚期 OA 表現。
與 C 組相比，D 組脛骨軟骨缺失明顯改善；與 G 組相比，H 組脛骨軟骨的缺失程度相仿。見圖 6。
2.2.2 OARSI 評分 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，OARSI 評分顯著升高（P<0.05）；D 組與 C 組相比，OARSI 評分顯著降低（P<0.05）。見圖 7a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，OARSI 評分顯著升高（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7b。
圖1
各組小鼠血清 CTX 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure1. Comparison of serum CTX content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖2
各組小鼠血清 OC 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure2. Comparison of serum OC content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖3
各組小鼠血清 IL-6 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure3. Comparison of serum IL-6 content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖4
各組小鼠血清 TNF-α 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure4. Comparison of serum TNF-α content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖5
各組小鼠血清 IL-1β 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure5. Comparison of serum IL-1β content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖6
各組組織學觀察（阿辛藍/蘇木精-酸性橙 G 染色×40）
箭頭示脛骨軟骨缺失 a. 早期給藥組 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. 晚期給藥組 從左至右分別為 E、F、G、H 組
Figure6. Histological observation of tibial cartilage in each group (AB/H&OG staining×40)Arrows indicated tibial cartilage loss a. Groups with early-stage administration From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. Groups with late-stage administrationFrom left to right for groups E, F, G, and H, respectively
圖7
各組小鼠脛骨軟骨和軟骨下骨組織學評分比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure7. Comparison of histological changes of tibial cartilage and subchondral bone in each groupa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
3 討論
近年來，研究證實軟骨下骨與 OA 進展緊密關聯，軟骨下骨異常可以加速軟骨退變，而改善軟骨下骨異常可減緩軟骨退變[2-3]。有研究表明，ICA 具有激素樣作用，能促進骨髓干細胞增殖和成骨分化[7]，促進成骨細胞礦化[8]，抑制破骨細胞功能和分化[9]。ICA 通過改善骨重建防治骨質疏松的作用已經得到公認，但其能否通過調節軟骨下骨骨重建治療 OA 目前尚缺乏相關基礎研究。本研究旨在通過觀察 OA 早期和晚期給予 ICA 治療后，血清中多種診斷和評價膝關節 OA 療效的細胞因子和代謝產物的表達變化，以及軟骨和軟骨下骨病理形態學的改變，初步探討 ICA 對 OA 的治療作用和效果。
小鼠的關節組織結構與人類接近，其 OA 模型軟骨生化指標與人類較一致。在形態學方面，鼠軟骨細胞的凋亡方式與人類相似，鼠模型關節軟骨退變的組織學特征與人類 OA 相似[10]。因此，為研究藥物 ICA 防治 OA 的療效，本實驗選用了小鼠模型。
OA 早期骨重建活躍，但晚期骨轉換減少，表現為骨吸收與骨形成之間的偶聯機制失去平衡，骨吸收減弱而骨形成相對增加，最終軟骨下骨板骨質硬化[3]。大量研究發現，OA 患者中存在軟骨細胞外基質的合成與降解失衡，其代謝產物可以作為生物標記物用于早期反映關節軟骨的新陳代謝改變，并顯示疾病活動[11]，如 CTX 和 OC。CTX 是Ⅰ型膠原的代謝產物，是反映骨轉換特別是骨吸收的特異而靈敏的指標[12]。OC 是成骨細胞的特異性產物，能反映成骨細胞的活性和骨轉換水平，并能反映患者對治療的反應，已成為臨床代謝性骨病的重要檢測指標[13]。本研究血清學檢測結果顯示，ACLT 術后第 8 周 C、G 組血清 CTX 和 OC 含量分別與 A、E 組相比顯著降低，提示軟骨下骨骨轉換率下降，符合 OA 晚期的骨重塑病理變化。ICA 早期治療后，D 組血清 CTX 和 OC 含量與 C 組比較均升高，說明經 ICA 治療后軟骨下骨骨重建活躍，骨轉換率升高，提示軟骨下骨可能是 ICA 的作用靶點。ICA 晚期治療后，H 組與 G 組比較，血清骨吸收指標 CTX 含量升高，血清成骨指標 OC 含量無明顯變化，提示 ICA 晚期治療對增強軟骨下骨骨轉換的能力不如早期治療。
近年研究認為，炎性反應也是OA重要的病理機制之一。血清中相關促炎和抗炎細胞因子的表達水平與 OA 的嚴重程度相關，可以作為臨床診斷和評價 OA 療效的參考指標[4-5, 14]。IL-6 是早期 OA 發生發展中重要的促炎因子，系統性抑制 IL-6 可以緩解大鼠 OA 的發生[15]。因此，IL-6 可以作為診斷和判斷 OA 預后的新型標志物[16]。本研究血清學檢測結果提示，ACLT 術后第 8 周 C、G 組血清 IL-6 含量分別與 A、E 組相比顯著升高，提示 OA 的發生以及 OA 造模成功，并符合 OA 中晚期血清 IL-6 含量顯著升高的特征[17]。ICA 早期治療后，與 C 組相比，D 組 IL-6 含量下降，提示 ICA 對軟骨具有保護作用。同時有研究表明在 OA 中晚期，關節間隙狹窄，軟骨基質受到嚴重損傷，此時軟骨細胞的分解及合成均相應增加。因此軟骨細胞的代謝在此時最為活躍，導致血清 IL-6 水平最高[18]。所以，我們分析 ICA 對軟骨的這種保護作用可能是通過改善軟骨細胞代謝活動而產生的。但是 ICA 晚期治療后，與 G 組比較，H 組 IL-6 含量變化無顯著差異，提示 ICA 晚期治療效果欠佳，與骨代謝指標結果一致。
在 OA 病變過程中，TNF-α 主要介導炎癥對軟骨進行直接損害，并可以影響 IL-6 的分泌；而 IL-1β 可以抑制軟骨Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，并介導其他諸多炎性因子的表達。兩者都能導致軟骨細胞凋亡，是 OA 病理過程中的關鍵細胞因子[16, 19-20]。本研究血清學檢測結果顯示，OA 造模成功后第 8 周 C 組和 G 組血清 TNF-α 和 IL-1β 含量分別與 A、E 組相比顯著升高，提示 OA 的發生和進展。但是，無論是早期給藥還是晚期給藥，D、H 組 TNF-α 和 IL-1β 含量分別與 C、G 組相比，均無顯著差異。TNF-α 和 IL-1β 的含量是否與 OA 病情的嚴重程度成正相關，目前相關研究結果仍然存有很大爭議[16]。我們認為，血清 TNF-α 和 IL-1β 的水平與 OA 軟骨的破壞程度可能不存在相關性，這可能與血清 TNF-α 和 IL-1β 的來源廣泛有關，并不能據此否定 ICA 的軟骨保護作用。
軟骨基質內蛋白多糖耗盡導致軟骨的缺失是 OA 的主要特征。近期研究發現，ICA 通過 MAPK 信號通路可以抑制 SW1353 軟骨肉瘤細胞基質金屬蛋白酶的表達[21]。ICA 能在體外促進軟骨細胞基因表達以及細胞外基質合成，因此對軟骨形成可能有促進作用[22]。本研究組織形態學觀察發現，早期給予 ICA 治療后，與 C 組相比，D 組小鼠軟骨缺失程度明顯好轉，提示 ICA 早期治療能對軟骨起到保護作用，并且與血清學改變一致。OARSI 評分系統是基于 OA 病變的病理進程，能在 OA 診斷之前明確關節軟骨的改變，并明確 OA 臨床治療的評價終點標準，現已廣泛應用于動物模型的評價[6]。本研究評分結果顯示，ICA 早期給藥后，與 C 組相比，D 組 OARSI 評分顯著下降。但是，ICA 晚期給藥后，與 G 組相比，H 組 OARSI 評分無顯著變化。上述結果說明 ICA 早期治療對 OA 有一定的防治作用，晚期治療效果欠佳。
綜上所述，我們初步研究發現，ICA 對 OA 的防治是全面的，其無論對透明軟骨、鈣化軟骨還是軟骨下骨均有一定程度保護作用，并且能在一定程度上改善 OA 軟骨下骨的骨重建，提示 OA 軟骨下骨亦是 ICA 的作用靶點。小鼠模型中的血清學和病理形態學的一致性改變提示 ICA 對 OA 早期干預作用更為明顯。因此，我們認為 ICA 可能通過多種生長因子介導的信號通路，如 MAPK、Wnt 等信號通路，對小鼠脛骨軟骨下骨骨髓基質干細胞或骨髓間充質干細胞成骨分化潛能、礦化能力和合成膠原蛋白能力產生影響[23-25]。但目前對于 ICA 改善 OA 骨重建的作用和機制尚不明確。深入研究 ICA 對 OA 骨重建的作用和機制，將為臨床 OA 防治新藥的開發提供理論基礎，同時也有助于理解 OA 的發生和發展。
一般認為，軟骨退變是骨關節炎（osteoarthritis，OA）的特征性表現。但近年研究發現，軟骨下骨改變也是 OA 病變重要方面[1-3]，而且軟骨下骨結構與生物力學性能的改變可以促使軟骨退變[2-3]。因此，有效控制軟骨下骨代謝和骨重塑速度，有望為 OA 提供一種新治療方法[1-3]。基于以上認識，作用于骨重建過程的中藥可以作為 OA 防治的候選藥物。中藥組分淫羊藿苷（icariin，ICA）能通過改善骨重建達到治療骨質疏松的目的，本研究將分別于小鼠 OA 早期和晚期給予 ICA 治療，觀察血清中與膝關節 OA 診斷和療效評價相關的細胞因子、代謝產物表達[4-5]變化，同時觀察軟骨和軟骨下骨組織形態學改變，從而初步探討 ICA 對 OA 的治療效果。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
80 只 8 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠，體質量（21±1）g，購于上海西普爾-必凱動物實驗有限公司。ICA（南京澤朗醫藥科技有限公司），用 DMSO 溶解后制成濃縮儲存液，灌胃前采用生理鹽水稀釋。
BCA 蛋白濃度測定試劑盒（PIERCE 公司，美國）；Ⅰ型膠原 C 末端肽（C-telopeptide of typeⅠcollagen，CTX）、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA 試劑盒（Biomedical Technologies 公司，美國）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（Abcam 公司，英國）；IL-1β ELISA 試劑盒（R&D system 公司，美國）。熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 實驗分組 將 80 只小鼠隨機分為 8 組，每組 10 只，分別為假手術/早期生理鹽水組（A 組）、假手術/早期 ICA 組（B 組）、前交叉韌帶切斷術（anterior cruciate ligament transaction，ACLT）/早期生理鹽水組（C 組）、ACLT/早期 ICA 組（D 組）、假手術/晚期生理鹽水組（E 組）、假手術/晚期 ICA 組（F 組）、ACLT/晚期生理鹽水組（G 組）、ACLT/晚期 ICA 組（H 組）。
1.2.2 動物模型制備 C、D、G、H 組小鼠行 ACLT，制備 OA 模型。具體步驟：采用 10% 水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，小鼠仰臥并固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。沿右膝關節髕骨外側切口，依次切開皮膚、皮下各層，鈍性分離肌肉組織，直至切開關節腔。向側方牽開髕韌帶，屈膝 90°，顯露前交叉韌帶并切斷，止血后生理鹽水充分沖洗關節腔，依次縫合各層組織。A、B、E、F 組除術中僅打開小鼠膝關節囊，不切斷前交叉韌帶外，其余操作與其他組一致。各組術后連續 3 d 肌肉注射青霉素 2 萬 U 預防感染，自由進食飲水，不行任何固定，分籠飼養。
1.2.3 給藥方法 B、D 組于術后第 1 天開始，每天采用灌胃方式給予 ICA（10 mg/kg）至第 8 周；A、C 組于相同時間點給予相同體積生理鹽水。F、H 組于術后第 4 周開始每天采用灌胃方式給予 ICA（10 mg/kg）至第 8 周；E、G 組于相同時間點給予相同體積生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 血清學指標測量 術后第 8 周各組小鼠斷頸處死，用注射器從心臟取血 1 mL，置于 1.5 mL 離心管（不含抗凝劑），室溫靜置 30 min，然后室溫下以 1 500×g 離心 10 min，取上層血清，采用 ELISA 法測量 CTX、OC、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量。
1.3.2 組織學觀察 切取小鼠膝關節上、下各 2 cm 區域組織，去除皮膚，置于 4% 多聚甲醛液中，4℃ 固定 24 h 后，剔除周圍軟組織及韌帶，PBS 浸洗，流水沖洗 2 h，10%EDTA 液加微波脫鈣 2 周，流水沖洗 24 h，截取脛骨部分并修整組織塊后石蠟包埋，作矢狀面不連續切片，片厚 5 μm，行阿辛藍/蘇木精-酸性橙 G 染色。具體步驟：將切片依次浸入二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水；自來水沖洗；置于 1% 鹽酸乙醇 30 s，瀝干；置于阿辛藍/蘇木精中和 30 min；去離子水充分清洗；置于 0.5% 氨溶液 15 s；去離子水充分清洗；置于 95% 乙醇 1 min，瀝干；置于酸性橙 G 中 1.5 min；95% 乙醇清洗 3 次；脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。切片置于顯微鏡下觀察。采用雙盲法參照骨關節炎國際研究學會（OARSI）評分標準，從基質染色、軟骨組織結構、軟骨細胞簇集、潮線完整性四方面評分[6]，以評價軟骨退變程度。總分 24 分，評分越高，表明關節軟骨破壞越嚴重。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 血清學檢測指標
2.1.1 CTX 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 CTX 含量降低（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 CTX 含量升高（P<0.05）。見圖 1a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 CTX 含量降低（P<0.05）；H 組與 G 組相比，血清 CTX 含量升高（P<0.05）。見圖 1b。
2.1.2 OC 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 OC 含量降低（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 OC 含量升高（P<0.05）。見圖 2a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 OC 含量降低（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
2.1.3 IL-6 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 IL-6 含量升高（P<0.05）；D 組與 C 組相比，血清 IL-6 含量降低（P<0.05）。見圖 3a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，血清 IL-6 含量升高（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3b。
2.1.4 TNF-α 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，血清 TNF-α 含量升高（P<0.05）；C、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，TNF-α 含量升高（P<0.05），G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
2.1.5 IL-1β 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，IL-1β 含量升高（P<0.05），C、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，IL-1β 含量升高（P<0.05），G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5 b。
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察 術后第 8 周，C、G 組與對應的 A、B 組及 E、F 組相比，小鼠脛骨軟骨缺失明顯，小鼠脛骨平臺透明軟骨變薄甚至消失；鈣化軟骨層厚度減小甚至全層消失；潮線呈現不規則延伸，模糊甚至消失；軟骨下骨廣泛裸露，軟骨下皮質骨板變厚，骨小梁形狀纖細，數量減少，呈現晚期 OA 表現。
與 C 組相比，D 組脛骨軟骨缺失明顯改善；與 G 組相比，H 組脛骨軟骨的缺失程度相仿。見圖 6。
2.2.2 OARSI 評分 早期給藥各組間比較：C 組與 A、B 組相比，OARSI 評分顯著升高（P<0.05）；D 組與 C 組相比，OARSI 評分顯著降低（P<0.05）。見圖 7a。
晚期給藥各組間比較：G 組與 E、F 組相比，OARSI 評分顯著升高（P<0.05）；G、H 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7b。
圖1
各組小鼠血清 CTX 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure1. Comparison of serum CTX content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖2
各組小鼠血清 OC 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure2. Comparison of serum OC content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖3
各組小鼠血清 IL-6 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure3. Comparison of serum IL-6 content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖4
各組小鼠血清 TNF-α 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure4. Comparison of serum TNF-α content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖5
各組小鼠血清 IL-1β 含量比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure5. Comparison of serum IL-1β content in mice between groupsa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
圖6
各組組織學觀察（阿辛藍/蘇木精-酸性橙 G 染色×40）
箭頭示脛骨軟骨缺失 a. 早期給藥組 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. 晚期給藥組 從左至右分別為 E、F、G、H 組
Figure6. Histological observation of tibial cartilage in each group (AB/H&OG staining×40)Arrows indicated tibial cartilage loss a. Groups with early-stage administration From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. Groups with late-stage administrationFrom left to right for groups E, F, G, and H, respectively
圖7
各組小鼠脛骨軟骨和軟骨下骨組織學評分比較
a. 早期給藥各組間比較；b. 晚期給藥各組間比較
Figure7. Comparison of histological changes of tibial cartilage and subchondral bone in each groupa. Comparison between groups with early-stage administration; b. Comparison between groups with late-stage administration
3 討論
近年來，研究證實軟骨下骨與 OA 進展緊密關聯，軟骨下骨異常可以加速軟骨退變，而改善軟骨下骨異常可減緩軟骨退變[2-3]。有研究表明，ICA 具有激素樣作用，能促進骨髓干細胞增殖和成骨分化[7]，促進成骨細胞礦化[8]，抑制破骨細胞功能和分化[9]。ICA 通過改善骨重建防治骨質疏松的作用已經得到公認，但其能否通過調節軟骨下骨骨重建治療 OA 目前尚缺乏相關基礎研究。本研究旨在通過觀察 OA 早期和晚期給予 ICA 治療后，血清中多種診斷和評價膝關節 OA 療效的細胞因子和代謝產物的表達變化，以及軟骨和軟骨下骨病理形態學的改變，初步探討 ICA 對 OA 的治療作用和效果。
小鼠的關節組織結構與人類接近，其 OA 模型軟骨生化指標與人類較一致。在形態學方面，鼠軟骨細胞的凋亡方式與人類相似，鼠模型關節軟骨退變的組織學特征與人類 OA 相似[10]。因此，為研究藥物 ICA 防治 OA 的療效，本實驗選用了小鼠模型。
OA 早期骨重建活躍，但晚期骨轉換減少，表現為骨吸收與骨形成之間的偶聯機制失去平衡，骨吸收減弱而骨形成相對增加，最終軟骨下骨板骨質硬化[3]。大量研究發現，OA 患者中存在軟骨細胞外基質的合成與降解失衡，其代謝產物可以作為生物標記物用于早期反映關節軟骨的新陳代謝改變，并顯示疾病活動[11]，如 CTX 和 OC。CTX 是Ⅰ型膠原的代謝產物，是反映骨轉換特別是骨吸收的特異而靈敏的指標[12]。OC 是成骨細胞的特異性產物，能反映成骨細胞的活性和骨轉換水平，并能反映患者對治療的反應，已成為臨床代謝性骨病的重要檢測指標[13]。本研究血清學檢測結果顯示，ACLT 術后第 8 周 C、G 組血清 CTX 和 OC 含量分別與 A、E 組相比顯著降低，提示軟骨下骨骨轉換率下降，符合 OA 晚期的骨重塑病理變化。ICA 早期治療后，D 組血清 CTX 和 OC 含量與 C 組比較均升高，說明經 ICA 治療后軟骨下骨骨重建活躍，骨轉換率升高，提示軟骨下骨可能是 ICA 的作用靶點。ICA 晚期治療后，H 組與 G 組比較，血清骨吸收指標 CTX 含量升高，血清成骨指標 OC 含量無明顯變化，提示 ICA 晚期治療對增強軟骨下骨骨轉換的能力不如早期治療。
近年研究認為，炎性反應也是OA重要的病理機制之一。血清中相關促炎和抗炎細胞因子的表達水平與 OA 的嚴重程度相關，可以作為臨床診斷和評價 OA 療效的參考指標[4-5, 14]。IL-6 是早期 OA 發生發展中重要的促炎因子，系統性抑制 IL-6 可以緩解大鼠 OA 的發生[15]。因此，IL-6 可以作為診斷和判斷 OA 預后的新型標志物[16]。本研究血清學檢測結果提示，ACLT 術后第 8 周 C、G 組血清 IL-6 含量分別與 A、E 組相比顯著升高，提示 OA 的發生以及 OA 造模成功，并符合 OA 中晚期血清 IL-6 含量顯著升高的特征[17]。ICA 早期治療后，與 C 組相比，D 組 IL-6 含量下降，提示 ICA 對軟骨具有保護作用。同時有研究表明在 OA 中晚期，關節間隙狹窄，軟骨基質受到嚴重損傷，此時軟骨細胞的分解及合成均相應增加。因此軟骨細胞的代謝在此時最為活躍，導致血清 IL-6 水平最高[18]。所以，我們分析 ICA 對軟骨的這種保護作用可能是通過改善軟骨細胞代謝活動而產生的。但是 ICA 晚期治療后，與 G 組比較，H 組 IL-6 含量變化無顯著差異，提示 ICA 晚期治療效果欠佳，與骨代謝指標結果一致。
在 OA 病變過程中，TNF-α 主要介導炎癥對軟骨進行直接損害，并可以影響 IL-6 的分泌；而 IL-1β 可以抑制軟骨Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，并介導其他諸多炎性因子的表達。兩者都能導致軟骨細胞凋亡，是 OA 病理過程中的關鍵細胞因子[16, 19-20]。本研究血清學檢測結果顯示，OA 造模成功后第 8 周 C 組和 G 組血清 TNF-α 和 IL-1β 含量分別與 A、E 組相比顯著升高，提示 OA 的發生和進展。但是，無論是早期給藥還是晚期給藥，D、H 組 TNF-α 和 IL-1β 含量分別與 C、G 組相比，均無顯著差異。TNF-α 和 IL-1β 的含量是否與 OA 病情的嚴重程度成正相關，目前相關研究結果仍然存有很大爭議[16]。我們認為，血清 TNF-α 和 IL-1β 的水平與 OA 軟骨的破壞程度可能不存在相關性，這可能與血清 TNF-α 和 IL-1β 的來源廣泛有關，并不能據此否定 ICA 的軟骨保護作用。
軟骨基質內蛋白多糖耗盡導致軟骨的缺失是 OA 的主要特征。近期研究發現，ICA 通過 MAPK 信號通路可以抑制 SW1353 軟骨肉瘤細胞基質金屬蛋白酶的表達[21]。ICA 能在體外促進軟骨細胞基因表達以及細胞外基質合成，因此對軟骨形成可能有促進作用[22]。本研究組織形態學觀察發現，早期給予 ICA 治療后，與 C 組相比，D 組小鼠軟骨缺失程度明顯好轉，提示 ICA 早期治療能對軟骨起到保護作用，并且與血清學改變一致。OARSI 評分系統是基于 OA 病變的病理進程，能在 OA 診斷之前明確關節軟骨的改變，并明確 OA 臨床治療的評價終點標準，現已廣泛應用于動物模型的評價[6]。本研究評分結果顯示，ICA 早期給藥后，與 C 組相比，D 組 OARSI 評分顯著下降。但是，ICA 晚期給藥后，與 G 組相比，H 組 OARSI 評分無顯著變化。上述結果說明 ICA 早期治療對 OA 有一定的防治作用，晚期治療效果欠佳。
綜上所述，我們初步研究發現，ICA 對 OA 的防治是全面的，其無論對透明軟骨、鈣化軟骨還是軟骨下骨均有一定程度保護作用，并且能在一定程度上改善 OA 軟骨下骨的骨重建，提示 OA 軟骨下骨亦是 ICA 的作用靶點。小鼠模型中的血清學和病理形態學的一致性改變提示 ICA 對 OA 早期干預作用更為明顯。因此，我們認為 ICA 可能通過多種生長因子介導的信號通路，如 MAPK、Wnt 等信號通路，對小鼠脛骨軟骨下骨骨髓基質干細胞或骨髓間充質干細胞成骨分化潛能、礦化能力和合成膠原蛋白能力產生影響[23-25]。但目前對于 ICA 改善 OA 骨重建的作用和機制尚不明確。深入研究 ICA 對 OA 骨重建的作用和機制，將為臨床 OA 防治新藥的開發提供理論基礎，同時也有助于理解 OA 的發生和發展。
