引用本文： 陸彥玲, 林田, 劉玉瑩, 包麗榮, 吳煜. BMP-2 和地塞米松對人牙髓細胞增殖和分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(6): 738-744. doi: 10.7507/1002-1892.201701072 復制
牙髓細胞存在于健康機體牙髓組織中，在未分化狀態下具有多譜系的細胞表型，具有向多種細胞分化的潛能[1]。當牙髓組織受到外界刺激時，牙髓細胞可在多種因子調控下分化為成牙本質細胞，形成修復性牙本質[2]。近年研究表明[3-4]，與牙髓組織再生相關的生長因子主要有 BMP、bFGF、TGF 等，其中 BMP-2 存在于未分化的成牙本質細胞中，是參與成牙本質細胞分化的重要調控因子。地塞米松是一種糖皮質激素，可在體外誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化[5-6]。作為常見的成骨相關細胞因子，兩者對牙髓細胞向成牙本質細胞的誘導能力是否存在差異，聯合應用是否可發揮協同作用，尚無研究證實。因此，本研究通過將 BMP-2 和地塞米松分別及聯合作用于體外培養的人牙髓細胞，探討兩者對牙髓細胞增殖和分化能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H-DMEM 培養基、青霉素、鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；FBS（Wisent 公司，加拿大）；BMP-2（Peprotech 公司，以色列）；地塞米松、維生素 C、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶、BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒（Sigma 公司，美國）；β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、熒光定量 PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒（Takara 公司，日本）。倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）；紫外線分光光度計（Thermo 公司，美國）；PCR 擴增儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 牙髓細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 牙髓細胞分離及培養 收集 25 歲以下患者因正畸原因拔出的無病變牙，患者均知情同意。于拔牙后 30 min 內在無菌條件下劈開牙冠取牙髓組織，并將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小塊，置于培養瓶，加入含 15% FBS 的 H-DMEM 培養液，37℃、5% CO 2 培養箱培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況；待細胞生長融合至 80%～90%時，用 0.25% 胰蛋白酶消化并傳代。
1.2.2 免疫細胞化學染色鑒定 取第 3～5 代牙髓細胞，以 5×104 個/mL 密度接種于放置有細胞蓋玻片的 6 孔板中，于 37℃、5% CO 2 培養箱培養 3～5 d，當細胞匯合至蓋玻片的 80%～90% 時，用 0.01% PBS 沖洗 3 次，4% 多聚甲醛固定，再用 PBS 沖洗玻片后晾干；Triton X-100 浸泡 10 min，PBS 沖洗晾干后用 3% 雙氧水浸泡；再經 PBS 沖洗晾干后用血清封閉，分別滴加鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白抗體一抗，置于 4℃ 冰箱孵化過夜；第 2 天從冰箱取出，放入 37℃、5% CO 2 培養箱孵育，PBS 沖洗晾干后滴加通用型二抗，在 37℃ 濕盒內孵育；去除二抗，滴加辣根過氧化物酶標記物鏈霉素卵白素浸泡，PBS 沖洗晾干后加入 DAB 顯色液，蘇木精染色-分化-返藍，沖洗晾干后封片，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3 實驗分組及方法
取生長狀況良好的第 3～5 代牙髓細胞，0.25% 胰蛋白酶消化后，用含 10% FBS 的 H-DMEM 培養基配置成密度為 5×104 個/mL的細胞懸液，接種于 48 孔板，于 37℃、5% CO 2 培養箱內培養，每孔體積 500 μL。待細胞貼壁后將其分為 4 組，A、B、C 組分別加入 100 ng/mL BMP-2、1×10–8 mol/L 地塞米松、100 ng/mL BMP-2 以及 1×10–8 mol/L 地塞米松，D 組不添加誘導劑作為對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞生長曲線繪制 培養 1、3、5、7 d 時，各組取 3 孔細胞，以 0.25% 胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液并計數，繪制細胞生長曲線。
1.4.2 RT-PCR 檢測 培養 5、7 d 取各組細胞采用 Trizol 法提取 mRNA，測定 mRNA 純度及濃度，按照逆轉錄試劑盒方法逆轉錄形成 cDNA。以 GAPDH 作為內參，通過 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒對 cDNA 模板進行 PCR 擴增，檢測牙本質細胞形成標記基因牙本質涎磷蛋白（dentin sialo-phoshoprotein，DSPP）、牙本質基質蛋白 1（dentin matrix protein 1，DMP-1）、ALP 的相對表達量。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
RT-PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for RT-PCR
1.4.3 ALP 染色 培養 14 d 取各組細胞，按照 BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒說明書[3]行 ALP 染色，倒置相差顯微鏡下觀察。采用 Image-Pro-Plus 圖像分析軟件定量測定陽性染色面積占總面積比值。每組設 3 個復孔。
1.4.4 茜素紅染色 培養 21 d 取各組細胞，棄培養液，用 4% 多聚甲醛固定 10 min；棄固定液，蒸餾水沖洗，加入 1% 茜素紅染液染色，20 min 后蒸餾水洗凈，倒置相差顯微鏡觀察。添加 10% 氯化十六烷基吡啶孵育 1 h，溶解附著于礦化結節的茜素紅，然后采用紫外線分光光度計測定 562 nm 波長處吸光度（A）值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 牙髓細胞形態觀察及鑒定
培養 7 d 后可見原代細胞從組織塊周圍爬出，狀態良好，呈長梭形漩渦狀排列；傳代后細胞狀態穩定。免疫細胞化學染色示，培養細胞波形蛋白染色呈陽性，角蛋白染色呈陰性，說明細胞來源于中胚層，具有成纖維細胞的形態特征，符合牙髓細胞的生物學特征。見圖 1。
圖1
牙髓細胞形態學觀察及免疫細胞化學染色鑒定 a. 原代細胞形態（倒置相差顯微鏡×40） 箭頭示牙髓組織塊；b. 第 3 代細胞形態（倒置相差顯微鏡×40）；c. 波形蛋白染色（倒置相差顯微鏡×400）；d. 角蛋白染色（倒置相差顯微鏡×400）
Figure1.
Morphological observation and immunocytochemistry staining identification of human dental pulp cells a. Primary cells morphology (Inverted phase contrast microscope×40) Arrow indicated the dental pulp mass; b. The 3rd generation cells morphology (Inverted phase contrast microscope×40); c. Vimentin staining (Inverted phase contrast microscope×400); d. Cytokeratin staining (Inverted phase contrast microscope×400)
2.2 細胞生長曲線繪制
隨培養時間延長，各組細胞均逐漸增多，5 d 時達峰值，7 d 時細胞減少并降至 3 d 水平。培養 1 d 時，各組間細胞數比較差異均無統計學意義（P>0.05）。3 d 時，A、C 組細胞顯著多于 B、D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。5 d 時，A、B、C 組細胞顯著多于 D 組，C 組多于 A 組，A 組多于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。7 d 時，C 組細胞顯著多于 A 組，A 組多于 D 組，D 組多于 B 組，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞生長曲線
Figure2.
The growth curve of cells in each group
2.3 RT-PCR 檢測成牙本質細胞形成標記基因表達
培養 5 d，A、B、C 組 ALP、DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量均顯著高于 D 組，C 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。培養 7 d，各組各基因表達趨于同化平穩。除 A、B、C 組 DSPP mRNA 相對表達量顯著高于 D 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組間比較各基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
RT-PCR 檢測各組牙髓細胞的成牙本質細胞形成標記基因相對表達量（n=3，
）
Table2.
The expression of osteo/dentinogenic genes in dental pulp cells by RT-PCR (n=3,
)
2.4 ALP 染色
培養 14 d 各組均可見不同著色程度的紫黑色沉淀，其中 C 組著色程度最深，表現為強陽性，其余依次為 A、B、D 組。見圖 3。A、B、C、D 組陽性染色面積占總面積比值分別為 0.368±0.004、0.337±0.022、0.849±0.013、0.181±0.008，C 組顯著高于 A、B、D 組，A、B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
培養 14 d 各組 ALP 染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure3.
ALP staining of each group at 14 days (Inverted phase contrast microscope×40) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.5 茜素紅染色
培養 21 d，A、B、C 組均出現大小及著色程度不一的橘紅色礦化結節，其中 C 組礦化結節成片狀大面積分布，A、B 組呈散在分布；D 組無礦化結節形成，僅見細胞堆積擠壓成復層。見圖 4。A、B、C、D 組 A 值分別為 0.110±0.087、0.071±0.002、0.146±0.027、0.051±0.005，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖4
培養 21 d 各組茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4.
Alizarin red staining of each group at 21 days (Inverted phase contrast microscope×40) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
牙髓組織中含有可防御修復的牙髓細胞，在體內外均具有多向分化能力，可分化成牙本質細胞、成骨細胞、軟骨細胞等。牙髓細胞來源廣泛易獲取，可從拔出的人類第 3 磨牙、正畸牙、脫落的乳牙中分離得來，符合倫理學要求，是近年牙髓組織再生工程的熱門種子細胞[7]。大量研究表明，牙髓細胞增殖、分化過程受到多種生物因子以及信號通路的轉導調控[8]。BMP-2 屬于 TGF-β 家族，與多種細胞分化、組織發育相關。目前已知 BMP-2 在骨誘導、牙胚發育、細胞遷移分化等過程發揮重要作用，是關鍵的信號蛋白。研究已證實，BMP-2 可通過基因轉染或體外誘導方式上調牙髓細胞中 DMP-1 等基因的表達[4, 9]。近年林穎等[10]的研究發現，BMP-2 可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號傳導通路，從而發揮促進牙髓細胞向成牙本質細胞分化的作用。Yang 等[11]研究結果表明，BMP-2 通過激活 Wnt 信號通路中的 β-catenin 經典通路來促進牙髓細胞分化，由于 BMP-2 可有效刺激 MAPK 信號通路的傳導，上調了 β-catenin 蛋白在牙髓細胞中的表達量。不僅如此，BMP-2 還可與其他生物因子發揮協同作用。周俊等[12]在犬恒牙建立根尖周炎模型后，用 VEGF 和 BMP-2 復合水凝膠支架植入感染控制的根管可誘導牙髓再生。劉彩宏等[13]在研究 TGF-β 1 在 BMP-2 誘導人牙周膜干細胞成骨分化作用的實驗中發現，在 BMP-2 誘導液中加入 TGF-β 1 后可顯著提高人牙周膜干細胞中成骨相關基因骨鈣素、Runx2、ALP 的 mRNA 及蛋白表達。地塞米松是常見的礦化因子，可誘導 BMSCs 分化為成骨細胞[14]。作為糖皮質激素，地塞米松對細胞發揮作用存在雙重效應，生理劑量濃度（1×10–8 mol/L）地塞米松可促進 MSCs 的成骨分化作用，但高濃度藥理劑量（≥1×10–7 mol/L）則明顯抑制細胞增殖，導致細胞凋亡增加[15-16]。汪建樣等[17]發現生長分化因子 5 與地塞米松聯合應用可誘導大鼠 BMSCs 向軟骨細胞分化，并檢測 β-catenin 蛋白表達水平上調，激活 Wnt/β-catenin 信號通路的傳導，促進大鼠 BMSCs 向軟骨細胞分化。因此，我們認為 BMP-2 與地塞米松在發揮誘導分化作用時均可能受到 Wnt/β-catenin 信號通路調控；那么 BMP-2 是否可聯合地塞米松，在誘導牙髓細胞增殖、分化的過程發揮協同作用。為此，我們進行了本實驗。
本實驗以牙髓細胞為研究對象，單純或聯合應用 BMP-2 和地塞米松體外誘導培養牙髓細胞，測定其對人牙髓細胞增殖和分化能力的影響。通過描繪細胞生長曲線發現，BMP-2 有促進牙髓細胞增殖的作用，與地塞米松聯合應用后對細胞的增殖效果較單獨應用時更顯著。郭冕等[18]研究指出，BMP-2 可介導 BMP/Smad 通路和 MAPK 通路而促進細胞增殖效果；我們結合本實驗結果分析，BMP-2 對牙髓細胞的增殖效應可能與 MAPK 通路相關。本實驗亦發現，單獨應用地塞米松對牙髓細胞的增殖作用不明顯，1、3 d 時細胞數量與對照組比較無明顯差異；5 d 時對牙髓細胞有短暫促增殖作用，但效果不如 BMP-2 以及兩者聯合應用；7 d 時細胞數量下降，低于對照組。謝小偉等[19]研究指出長時間應用地塞米松可抑制成骨細胞增殖；范鍥等[20]研究也指出，地塞米松有促進大鼠 MSCs 凋亡的作用。本實驗結果證實了上述結論，分析單獨應用地塞米松 7 d 后牙髓細胞數量較對照組下降可能與長時間作用或其促細胞凋亡作用有關。綜上，BMP-2 與地塞米松均可促進牙髓細胞增殖，但 BMP-2 的促增殖效應比地塞米松更明顯，而兩者聯合作用可能發揮協同效應，在牙髓細胞增殖過程中較兩者單獨應用更能促進牙髓細胞增殖。
成牙本質細胞與成骨細胞一樣，具有形成礦化組織的特性[21]。ALP 活性是反映細胞具有礦化能力的一個重要指標，其表達變化體現了牙髓細胞分化的狀態，ALP 活性增強標志著牙髓細胞向終末細胞分化，因而被認為是牙髓細胞分化功能和牙本質形成的一個標志[22]。DSPP 基因編碼牙本質涎蛋白和牙本質磷蛋白，是牙本質非膠原蛋白的主要成分，被認為是成牙本質細胞的特異性標記蛋白[23]。DMP-1 在牙胚中主要表達于成牙本質細胞，在多潛能細胞和間充質源性細胞中過表達 DMP-1 能夠誘導這些細胞分化和形成成牙本質細胞樣細胞，并且能夠促進礦化結節的形成，在牙本質形成和礦化中至關重要，參與牙髓細胞向成牙本質細胞分化、維持牙本質細胞分泌和礦化等作用[24-25]。本實驗通過 RT-PCR 檢測 ALP、DSPP、DMP-1 基因表達變化驗證牙髓細胞向成牙本質細胞分化，采用 BCIP/NBT ALP 比色法測定細胞 ALP 活性，通過礦化結節茜素紅染色檢測 BMP-2、地塞米松以及兩者聯合應用對牙髓細胞分化能力的影響。結果顯示，誘導 5 d，A、B、C 組 ALP、DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量均顯著高于 D 組，C 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示經 BMP-2 和地塞米松誘導后各組牙髓細胞的分化標志基因強烈表達。誘導 7 d 各組各基因表達趨于同化平穩。除 A、B、C 組 DSPP mRNA 相對表達量顯著高于 D 組（P<0.05）外，其余各組間比較各基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。ALP 活性檢測示，誘導 14 d C 組陽性染色面積占總面積比值顯著高于 A、B、D 組，A、B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間差異無統計學意義（P>0.05）。提示各誘導組細胞較對照組 ALP 活性增強，細胞外基質發生鈣化。茜素紅染色示，誘導 21 d 各誘導組細胞均有礦化結節形成，定量測定結果示 C 組形成的礦化結節數量顯著多于 A、B 組，D 組細胞未見礦化結節形成。宋揚等[26]報道，BMP-2、bFGF、地塞米松 3 種因子任意兩兩結合均能顯著提高犬牙周膜細胞的礦化能力；徐璐璐等[27]研究亦指出，BMP-2 和地塞米松聯合應用可顯著增強大鼠牙囊細胞體外的成骨能力。本實驗得出了類似結果，說明 BMP-2 與地塞米松均有促進牙髓細胞向成牙本質細胞分化的作用，并且兩者聯合作用后促分化能力最優。
綜上述，BMP-2 和地塞米松聯合誘導能顯著增加牙髓細胞的增殖和向成牙本質分化的能力，可高效發揮誘導作用，從而使種子細胞具備良好的生物學活性，為牙髓細胞向成牙本質細胞分化提供較可行的優化方案。但成牙本質細胞形成過程較復雜，其中涉及調控的信號分子轉錄因子等機制未能完全知曉，還有待深入研究。
牙髓細胞存在于健康機體牙髓組織中，在未分化狀態下具有多譜系的細胞表型，具有向多種細胞分化的潛能[1]。當牙髓組織受到外界刺激時，牙髓細胞可在多種因子調控下分化為成牙本質細胞，形成修復性牙本質[2]。近年研究表明[3-4]，與牙髓組織再生相關的生長因子主要有 BMP、bFGF、TGF 等，其中 BMP-2 存在于未分化的成牙本質細胞中，是參與成牙本質細胞分化的重要調控因子。地塞米松是一種糖皮質激素，可在體外誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化[5-6]。作為常見的成骨相關細胞因子，兩者對牙髓細胞向成牙本質細胞的誘導能力是否存在差異，聯合應用是否可發揮協同作用，尚無研究證實。因此，本研究通過將 BMP-2 和地塞米松分別及聯合作用于體外培養的人牙髓細胞，探討兩者對牙髓細胞增殖和分化能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H-DMEM 培養基、青霉素、鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；FBS（Wisent 公司，加拿大）；BMP-2（Peprotech 公司，以色列）；地塞米松、維生素 C、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶、BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒（Sigma 公司，美國）；β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、熒光定量 PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒（Takara 公司，日本）。倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）；紫外線分光光度計（Thermo 公司，美國）；PCR 擴增儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 牙髓細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 牙髓細胞分離及培養 收集 25 歲以下患者因正畸原因拔出的無病變牙，患者均知情同意。于拔牙后 30 min 內在無菌條件下劈開牙冠取牙髓組織，并將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小塊，置于培養瓶，加入含 15% FBS 的 H-DMEM 培養液，37℃、5% CO 2 培養箱培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況；待細胞生長融合至 80%～90%時，用 0.25% 胰蛋白酶消化并傳代。
1.2.2 免疫細胞化學染色鑒定 取第 3～5 代牙髓細胞，以 5×104 個/mL 密度接種于放置有細胞蓋玻片的 6 孔板中，于 37℃、5% CO 2 培養箱培養 3～5 d，當細胞匯合至蓋玻片的 80%～90% 時，用 0.01% PBS 沖洗 3 次，4% 多聚甲醛固定，再用 PBS 沖洗玻片后晾干；Triton X-100 浸泡 10 min，PBS 沖洗晾干后用 3% 雙氧水浸泡；再經 PBS 沖洗晾干后用血清封閉，分別滴加鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白抗體一抗，置于 4℃ 冰箱孵化過夜；第 2 天從冰箱取出，放入 37℃、5% CO 2 培養箱孵育，PBS 沖洗晾干后滴加通用型二抗，在 37℃ 濕盒內孵育；去除二抗，滴加辣根過氧化物酶標記物鏈霉素卵白素浸泡，PBS 沖洗晾干后加入 DAB 顯色液，蘇木精染色-分化-返藍，沖洗晾干后封片，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3 實驗分組及方法
取生長狀況良好的第 3～5 代牙髓細胞，0.25% 胰蛋白酶消化后，用含 10% FBS 的 H-DMEM 培養基配置成密度為 5×104 個/mL的細胞懸液，接種于 48 孔板，于 37℃、5% CO 2 培養箱內培養，每孔體積 500 μL。待細胞貼壁后將其分為 4 組，A、B、C 組分別加入 100 ng/mL BMP-2、1×10–8 mol/L 地塞米松、100 ng/mL BMP-2 以及 1×10–8 mol/L 地塞米松，D 組不添加誘導劑作為對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞生長曲線繪制 培養 1、3、5、7 d 時，各組取 3 孔細胞，以 0.25% 胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液并計數，繪制細胞生長曲線。
1.4.2 RT-PCR 檢測 培養 5、7 d 取各組細胞采用 Trizol 法提取 mRNA，測定 mRNA 純度及濃度，按照逆轉錄試劑盒方法逆轉錄形成 cDNA。以 GAPDH 作為內參，通過 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒對 cDNA 模板進行 PCR 擴增，檢測牙本質細胞形成標記基因牙本質涎磷蛋白（dentin sialo-phoshoprotein，DSPP）、牙本質基質蛋白 1（dentin matrix protein 1，DMP-1）、ALP 的相對表達量。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
RT-PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for RT-PCR
1.4.3 ALP 染色 培養 14 d 取各組細胞，按照 BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒說明書[3]行 ALP 染色，倒置相差顯微鏡下觀察。采用 Image-Pro-Plus 圖像分析軟件定量測定陽性染色面積占總面積比值。每組設 3 個復孔。
1.4.4 茜素紅染色 培養 21 d 取各組細胞，棄培養液，用 4% 多聚甲醛固定 10 min；棄固定液，蒸餾水沖洗，加入 1% 茜素紅染液染色，20 min 后蒸餾水洗凈，倒置相差顯微鏡觀察。添加 10% 氯化十六烷基吡啶孵育 1 h，溶解附著于礦化結節的茜素紅，然后采用紫外線分光光度計測定 562 nm 波長處吸光度（A）值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 牙髓細胞形態觀察及鑒定
培養 7 d 后可見原代細胞從組織塊周圍爬出，狀態良好，呈長梭形漩渦狀排列；傳代后細胞狀態穩定。免疫細胞化學染色示，培養細胞波形蛋白染色呈陽性，角蛋白染色呈陰性，說明細胞來源于中胚層，具有成纖維細胞的形態特征，符合牙髓細胞的生物學特征。見圖 1。
圖1
牙髓細胞形態學觀察及免疫細胞化學染色鑒定 a. 原代細胞形態（倒置相差顯微鏡×40） 箭頭示牙髓組織塊；b. 第 3 代細胞形態（倒置相差顯微鏡×40）；c. 波形蛋白染色（倒置相差顯微鏡×400）；d. 角蛋白染色（倒置相差顯微鏡×400）
Figure1.
Morphological observation and immunocytochemistry staining identification of human dental pulp cells a. Primary cells morphology (Inverted phase contrast microscope×40) Arrow indicated the dental pulp mass; b. The 3rd generation cells morphology (Inverted phase contrast microscope×40); c. Vimentin staining (Inverted phase contrast microscope×400); d. Cytokeratin staining (Inverted phase contrast microscope×400)
2.2 細胞生長曲線繪制
隨培養時間延長，各組細胞均逐漸增多，5 d 時達峰值，7 d 時細胞減少并降至 3 d 水平。培養 1 d 時，各組間細胞數比較差異均無統計學意義（P>0.05）。3 d 時，A、C 組細胞顯著多于 B、D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。5 d 時，A、B、C 組細胞顯著多于 D 組，C 組多于 A 組，A 組多于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。7 d 時，C 組細胞顯著多于 A 組，A 組多于 D 組，D 組多于 B 組，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞生長曲線
Figure2.
The growth curve of cells in each group
2.3 RT-PCR 檢測成牙本質細胞形成標記基因表達
培養 5 d，A、B、C 組 ALP、DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量均顯著高于 D 組，C 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。培養 7 d，各組各基因表達趨于同化平穩。除 A、B、C 組 DSPP mRNA 相對表達量顯著高于 D 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組間比較各基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
RT-PCR 檢測各組牙髓細胞的成牙本質細胞形成標記基因相對表達量（n=3，
）
Table2.
The expression of osteo/dentinogenic genes in dental pulp cells by RT-PCR (n=3,
)
2.4 ALP 染色
培養 14 d 各組均可見不同著色程度的紫黑色沉淀，其中 C 組著色程度最深，表現為強陽性，其余依次為 A、B、D 組。見圖 3。A、B、C、D 組陽性染色面積占總面積比值分別為 0.368±0.004、0.337±0.022、0.849±0.013、0.181±0.008，C 組顯著高于 A、B、D 組，A、B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
培養 14 d 各組 ALP 染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure3.
ALP staining of each group at 14 days (Inverted phase contrast microscope×40) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.5 茜素紅染色
培養 21 d，A、B、C 組均出現大小及著色程度不一的橘紅色礦化結節，其中 C 組礦化結節成片狀大面積分布，A、B 組呈散在分布；D 組無礦化結節形成，僅見細胞堆積擠壓成復層。見圖 4。A、B、C、D 組 A 值分別為 0.110±0.087、0.071±0.002、0.146±0.027、0.051±0.005，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖4
培養 21 d 各組茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4.
Alizarin red staining of each group at 21 days (Inverted phase contrast microscope×40) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
牙髓組織中含有可防御修復的牙髓細胞，在體內外均具有多向分化能力，可分化成牙本質細胞、成骨細胞、軟骨細胞等。牙髓細胞來源廣泛易獲取，可從拔出的人類第 3 磨牙、正畸牙、脫落的乳牙中分離得來，符合倫理學要求，是近年牙髓組織再生工程的熱門種子細胞[7]。大量研究表明，牙髓細胞增殖、分化過程受到多種生物因子以及信號通路的轉導調控[8]。BMP-2 屬于 TGF-β 家族，與多種細胞分化、組織發育相關。目前已知 BMP-2 在骨誘導、牙胚發育、細胞遷移分化等過程發揮重要作用，是關鍵的信號蛋白。研究已證實，BMP-2 可通過基因轉染或體外誘導方式上調牙髓細胞中 DMP-1 等基因的表達[4, 9]。近年林穎等[10]的研究發現，BMP-2 可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號傳導通路，從而發揮促進牙髓細胞向成牙本質細胞分化的作用。Yang 等[11]研究結果表明，BMP-2 通過激活 Wnt 信號通路中的 β-catenin 經典通路來促進牙髓細胞分化，由于 BMP-2 可有效刺激 MAPK 信號通路的傳導，上調了 β-catenin 蛋白在牙髓細胞中的表達量。不僅如此，BMP-2 還可與其他生物因子發揮協同作用。周俊等[12]在犬恒牙建立根尖周炎模型后，用 VEGF 和 BMP-2 復合水凝膠支架植入感染控制的根管可誘導牙髓再生。劉彩宏等[13]在研究 TGF-β 1 在 BMP-2 誘導人牙周膜干細胞成骨分化作用的實驗中發現，在 BMP-2 誘導液中加入 TGF-β 1 后可顯著提高人牙周膜干細胞中成骨相關基因骨鈣素、Runx2、ALP 的 mRNA 及蛋白表達。地塞米松是常見的礦化因子，可誘導 BMSCs 分化為成骨細胞[14]。作為糖皮質激素，地塞米松對細胞發揮作用存在雙重效應，生理劑量濃度（1×10–8 mol/L）地塞米松可促進 MSCs 的成骨分化作用，但高濃度藥理劑量（≥1×10–7 mol/L）則明顯抑制細胞增殖，導致細胞凋亡增加[15-16]。汪建樣等[17]發現生長分化因子 5 與地塞米松聯合應用可誘導大鼠 BMSCs 向軟骨細胞分化，并檢測 β-catenin 蛋白表達水平上調，激活 Wnt/β-catenin 信號通路的傳導，促進大鼠 BMSCs 向軟骨細胞分化。因此，我們認為 BMP-2 與地塞米松在發揮誘導分化作用時均可能受到 Wnt/β-catenin 信號通路調控；那么 BMP-2 是否可聯合地塞米松，在誘導牙髓細胞增殖、分化的過程發揮協同作用。為此，我們進行了本實驗。
本實驗以牙髓細胞為研究對象，單純或聯合應用 BMP-2 和地塞米松體外誘導培養牙髓細胞，測定其對人牙髓細胞增殖和分化能力的影響。通過描繪細胞生長曲線發現，BMP-2 有促進牙髓細胞增殖的作用，與地塞米松聯合應用后對細胞的增殖效果較單獨應用時更顯著。郭冕等[18]研究指出，BMP-2 可介導 BMP/Smad 通路和 MAPK 通路而促進細胞增殖效果；我們結合本實驗結果分析，BMP-2 對牙髓細胞的增殖效應可能與 MAPK 通路相關。本實驗亦發現，單獨應用地塞米松對牙髓細胞的增殖作用不明顯，1、3 d 時細胞數量與對照組比較無明顯差異；5 d 時對牙髓細胞有短暫促增殖作用，但效果不如 BMP-2 以及兩者聯合應用；7 d 時細胞數量下降，低于對照組。謝小偉等[19]研究指出長時間應用地塞米松可抑制成骨細胞增殖；范鍥等[20]研究也指出，地塞米松有促進大鼠 MSCs 凋亡的作用。本實驗結果證實了上述結論，分析單獨應用地塞米松 7 d 后牙髓細胞數量較對照組下降可能與長時間作用或其促細胞凋亡作用有關。綜上，BMP-2 與地塞米松均可促進牙髓細胞增殖，但 BMP-2 的促增殖效應比地塞米松更明顯，而兩者聯合作用可能發揮協同效應，在牙髓細胞增殖過程中較兩者單獨應用更能促進牙髓細胞增殖。
成牙本質細胞與成骨細胞一樣，具有形成礦化組織的特性[21]。ALP 活性是反映細胞具有礦化能力的一個重要指標，其表達變化體現了牙髓細胞分化的狀態，ALP 活性增強標志著牙髓細胞向終末細胞分化，因而被認為是牙髓細胞分化功能和牙本質形成的一個標志[22]。DSPP 基因編碼牙本質涎蛋白和牙本質磷蛋白，是牙本質非膠原蛋白的主要成分，被認為是成牙本質細胞的特異性標記蛋白[23]。DMP-1 在牙胚中主要表達于成牙本質細胞，在多潛能細胞和間充質源性細胞中過表達 DMP-1 能夠誘導這些細胞分化和形成成牙本質細胞樣細胞，并且能夠促進礦化結節的形成，在牙本質形成和礦化中至關重要，參與牙髓細胞向成牙本質細胞分化、維持牙本質細胞分泌和礦化等作用[24-25]。本實驗通過 RT-PCR 檢測 ALP、DSPP、DMP-1 基因表達變化驗證牙髓細胞向成牙本質細胞分化，采用 BCIP/NBT ALP 比色法測定細胞 ALP 活性，通過礦化結節茜素紅染色檢測 BMP-2、地塞米松以及兩者聯合應用對牙髓細胞分化能力的影響。結果顯示，誘導 5 d，A、B、C 組 ALP、DSPP、DMP-1 mRNA 相對表達量均顯著高于 D 組，C 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示經 BMP-2 和地塞米松誘導后各組牙髓細胞的分化標志基因強烈表達。誘導 7 d 各組各基因表達趨于同化平穩。除 A、B、C 組 DSPP mRNA 相對表達量顯著高于 D 組（P<0.05）外，其余各組間比較各基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。ALP 活性檢測示，誘導 14 d C 組陽性染色面積占總面積比值顯著高于 A、B、D 組，A、B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間差異無統計學意義（P>0.05）。提示各誘導組細胞較對照組 ALP 活性增強，細胞外基質發生鈣化。茜素紅染色示，誘導 21 d 各誘導組細胞均有礦化結節形成，定量測定結果示 C 組形成的礦化結節數量顯著多于 A、B 組，D 組細胞未見礦化結節形成。宋揚等[26]報道，BMP-2、bFGF、地塞米松 3 種因子任意兩兩結合均能顯著提高犬牙周膜細胞的礦化能力；徐璐璐等[27]研究亦指出，BMP-2 和地塞米松聯合應用可顯著增強大鼠牙囊細胞體外的成骨能力。本實驗得出了類似結果，說明 BMP-2 與地塞米松均有促進牙髓細胞向成牙本質細胞分化的作用，并且兩者聯合作用后促分化能力最優。
綜上述，BMP-2 和地塞米松聯合誘導能顯著增加牙髓細胞的增殖和向成牙本質分化的能力，可高效發揮誘導作用，從而使種子細胞具備良好的生物學活性，為牙髓細胞向成牙本質細胞分化提供較可行的優化方案。但成牙本質細胞形成過程較復雜，其中涉及調控的信號分子轉錄因子等機制未能完全知曉，還有待深入研究。
