引用本文： 黃俊波, 王世勇, 張曉敏, 李根, 姬菩忠, 趙紅斌. 載柚皮苷復合支架對兔骨軟骨缺損修復的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 489-496. doi: 10.7507/1002-1892.201611112 復制
骨軟骨損傷臨床十分常見，通常直徑>4 mm 的軟骨損傷不能自行修復[1-2]，對患者的身心健康造成嚴重影響。組織工程技術的出現為骨軟骨損傷修復和功能恢復帶來希望。單層支架往往不能滿足骨和軟骨兩種不同組織生長所需的細胞外環境，限制了其在骨軟骨組織工程中的廣泛應用[3]。目前構建雙層或多層復合支架用于修復骨軟骨損傷成為骨軟骨組織工程研究的熱點之一。同時，有關復合生長因子的支架對骨軟骨損傷的研究較多，且有較好的修復效果[4-6]，但生長因子價格昂貴，臨床應用也有限。傳統中藥骨碎補單體成分柚皮苷具有促進軟骨細胞生長和增殖的作用[7-8]，將其用于組織工程支架中修復骨軟骨損傷，是一種新的創新和嘗試。本實驗利用柚皮苷作為緩釋藥物與膠原蛋白復合構建軟骨層支架，凹凸棒石與膠原蛋白復合構建骨層支架，通過膠原蛋白將兩者黏接成骨軟骨 3 層復合支架，采用相應方法綜合評價藥物的緩釋效果、支架表征及其對兔骨軟骨缺損的修復效果，旨在為臨床修復骨軟骨缺損提供一種新型仿生復合支架。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性日本大耳白兔 40 只，體質量 2.0～2.5 kg，由中國農科院蘭州獸醫研究所提供。
BMSCs（ATCC 公司，美國）；柚皮苷（Aladdin 公司，美國）；凹凸棒石（中科院蘭州物理化學研究所）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、TGF-β1（Sigma 公司，美國）；Ⅰ 型膠原（豬皮中提取）由本實驗室自制；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海東仁化學科技有限公司）；甲苯胺藍軟骨染色液（北京雷根生物技術有限公司）；Ⅱ 型膠原小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG（Abcom 公司，英國）。紫外分光光度儀（HP 公司，美國）；酶標儀（美國伯爵儀器有限公司）；冷凍干燥機（中國軍事醫學科學院實驗儀器廠）；JSM-5600LV 低真空型掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 復合支架的構建
1.2.1 微球制備 稱取 2 mg 柚皮苷溶于 2 mL 去離子水中作內水相，取 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中作油相；將內水相逐滴加至油相，迅速于超聲波 100 W 超聲 30 s，使混合相（W/O）變均勻。再取 20 mL 1% 聚乙烯醇溶液作外水相，將混合相逐滴加至外水相中，同時于超聲波 100 W 超聲 30 s，使混合液（W/O/W）變乳白色，再轉至通風櫥內磁力攪拌過夜。然后以離心半徑 2.5 cm、13 000 r/min 離心 10 min，取試管底部沉淀物經去離子水洗滌、同上法離心、真空冷凍干燥制得載柚皮苷微球。同時用上述方法制備無載柚皮苷微球。
1.2.2 軟骨層支架構建 稱取載柚皮苷微球、殼聚糖、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶入 15 mL 1% 冰乙酸溶液中，攪拌混合均勻，形成乳白色混合物；將其裝入直徑 4.5 mm 的特制圓柱體模具中，–20℃ 冷凍使其呈圓柱體棒狀物，切成 2 mm 厚的圓形薄片，冷凍干燥制得載柚皮苷微球的軟骨層支架。同時用上述方法構建無載柚皮苷微球的軟骨層支架，保存備用。
1.2.3 骨層支架構建 稱取凹凸棒石、聚己內酯、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶于 15 mL 六氟異丙醇溶液中，磁力攪拌 2 h；加入 2.5 g NaCl 作致孔劑，攪拌混合均勻；待大部分六氟異丙醇揮發后，裝入直徑 4.5 mm 的特制圓柱體模具中，通風櫥內使其凝固成圓柱體棒狀物，切成 2 mm 厚的圓形薄片，37℃ 烘箱中烘干，除盡六氟異丙醇，再經去離子水脫鹽后，冷凍干燥制得骨層支架，保存備用。
1.2.4 黏接層溶液構建 取聚己內酯、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶于 10 mL 六氟異丙醇溶液中，攪拌混合均勻備用。
1.2.5 復合支架構建 將構建的軟骨層、骨層支架的一面分別浸漬在黏接層溶液中，數秒后取出黏貼在一起，烘箱中烘干，制得直徑為 4.5 mm、厚 4 mm 的軟骨層-黏接層-骨層 3 層結構的復合支架，60Co 輻照滅菌后，4℃ 保存。
1.3 復合支架評價
1.3.1 藥物緩釋測定 精確稱取 500 mg 載柚皮苷微球的軟骨層支架，加入 50 mL PBS 中，密封置于 37℃ 恒溫平板搖床中勻速搖動，分別于 1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h 時取出 0.5 mL 溶液保存待測，并補回 0.5 mL PBS。待所有時間點取樣完畢后，紫外分光光度儀檢測其吸光度（A）值，參考文獻[9]方法計算柚皮苷緩釋率。
1.3.2 細胞在軟骨層支架上增殖檢測 向無載柚皮苷微球的軟骨層支架上逐滴加入 10 ng/mL TGF-β1 500 μL 作為陽性對照，烘箱中靜置過夜。將無載柚皮苷微球（A 組）、載柚皮苷微球（B 組）、載 TGF-β1 軟骨層支架（C 組）分別置于 96 孔板中，每組設 4 個復孔，DMEM/F12 培養基預濕；吸取 100 μL 濃度為 5×105 個/mL 的 BMSCs 懸液接種于支架上，分別于 1、2、3、4 d 將支架轉移至新孔板中，再加入 10 μL CCK-8 試劑，孵育 4 h 后，每孔吸出 80 μL 至新孔板中，于酶標儀 450 nm 處測其A 值。
1.3.3 掃描電鏡觀察表面形貌 隨機選取載柚皮苷微球、載柚皮苷復合支架，制樣、噴金，掃描電鏡觀察微球的形態、大小及復合支架的微觀形貌。BMSCs 在載柚皮苷軟骨層支架上增殖（同 1.3.2 方法）7 d 后取出，2.5% 戊二醛固定 24 h，洗滌、干燥，掃描電鏡觀察細胞在軟骨層支架上的黏附情況。
1.4 兔體內植入實驗觀察
1.4.1 實驗分組及方法 將 40 只日本大耳白兔隨機分為 4 組，每組 10 只。所有實驗動物采用 10% 水合氯醛耳緣靜脈注射（2 mL/kg）麻醉，雙膝關節部剃毛、消毒，于膝關節內側繞髕骨作弧形縱切口，充分暴露股骨髁間窩，利用電鉆于髁間窩制備直徑 4.5 mm、深 4.0 mm 的骨軟骨全層缺損模型。其中 A 組為缺損組（空白對照），僅制備缺損模型，不作其他處理；B、C、D 組分別于骨軟骨缺損處植入無載柚皮苷復合支架（陰性對照組）、載柚皮苷復合支架（實驗組）及載 TGF-β1 復合支架（陽性對照組）。術后每日肌肉注射青霉素 20 萬 U 至術后 7 d，每日觀察損傷局部有無感染及兔飲食、活動情況。
1.4.2 大體觀察 術后 3、6 個月時采用空氣栓塞法每組分別處死 3 只動物，取出股骨髁間窩，肉眼觀察骨軟骨缺損處軟骨修復效果。
1.4.3 組織學染色觀察 術后 3、6 個月將取出的股骨髁間窩置于 4% 甲醛中固定 3 d，10%EDTA-Na2 液中脫鈣 30 d，常規石蠟包埋、切片，行 HE 染色及甲苯胺藍染色，倒置顯微鏡下觀察。
1.4.4 Western blot 法檢測 Ⅱ 型膠原蛋白表達 術后 3、6 個月采用空氣栓塞法每組各處死 2 只動物，取出股骨髁間窩，于原骨軟骨缺損處用電環鉆取出直徑 5 mm 圓柱狀骨軟骨組織，高效 RIPA 組織裂解液裂解，提取總蛋白，用 BCA 試劑對總蛋白進行定量；然后加上樣緩沖液，煮沸 10 min，采用 SDS-PAGE 凝膠分離電泳，轉硝酸纖維素膜上，封閉液封閉 2 h，用 Ⅱ 型膠原小鼠單克隆抗體（1∶400）室溫孵育過夜，TBST 清洗，辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠 IgG（1∶10 000）室溫孵育 2 h，TBST 清洗，ECL 顯色，曝光。采用 Image-pro plus 軟件計算各條帶的A 值，將與內參 β-actin 測定A 值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 復合支架相關觀測
2.1.1 藥物緩釋測定 6 h 前載柚皮苷微球的軟骨層支架中柚皮苷釋放率迅速增加，出現突釋現象，釋放率達到 4.27%；12 h 后釋放率趨于緩釋水平，平均釋放率為 4.39%。見圖 1。
圖1
柚皮苷釋放曲線
Figure1.
Release curve of naringin
2.1.2 細胞在軟骨層支架上增殖檢測 CCK-8 法檢測示，2～4 d 時 B、C 組促細胞增殖率顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測 BMSCs 在各軟骨層支架上的增殖情況
Figure2.
Proliferation of BMSCs on each cartilage layer scaffold by cell countin kit 8
2.1.3 微球及復合支架表面特征觀察 肉眼觀察復合支架呈白色圓柱狀，直徑 4.5 mm，厚 4 mm，其中軟骨層支架厚 2 mm，骨層支架厚 2 mm。見圖 3。掃描電鏡觀察示微球表面光滑，大小均一，平均粒徑 4.5 μm（圖 4a）。復合支架結構分層明顯，軟骨層支架與骨層支架黏接處緊密相連；軟骨層支架呈多孔片層結構，排列無規則且相互連通，微球均勻分散于軟骨層支架中；骨層支架結構致密，有大小不等的孔徑相通，孔徑 200～300 μm（圖 4b～d）。細胞呈扁平或多角不規則形黏附于軟骨層支架內，有些細胞相互接觸、聚集成片（圖 4e）。
圖3
復合支架大體觀察
Figure3.
General observation of composite scaffolds
圖4
掃描電鏡觀察 a. 微球（×5 000）；b. 復合支架（×35）；c. 軟骨層支架（×1 000）；d. 骨層支架（×50）；e. 軟骨層支架表面細胞黏附情況（×500）
Figure4.
Scanning electron microscope observation a. Microspheres (×5 000); b. Composite scaffold (×35); c. Cartilage layer scaffold (×1 000); d. Bone layer scaffold (×50); e. Cells adhesion on the surface of cartilage layer scaffold (×500)
2.2 兔體內植入實驗觀察
2.2.1 一般情況觀察 術后 1 d 所有兔飲食恢復正常，無骨折脫位，無化膿、感染等，術后 7 d 創口愈合良好，活動自如。
2.2.2 缺損處大體觀察 術后 3 個月各組均可見大小不等的軟骨缺損，C、D 組缺損范圍與 A、B 組相比明顯縮小。術后 6 個月，A 組缺損處有大量結締組織填充，邊界仍清晰可見，缺損直徑約 4 mm；B 組缺損處被少量新生軟骨組織和大量結締組織覆蓋；C 組缺損處被平滑的新生軟骨完全覆蓋，且新生軟骨與周圍正常軟骨融合；D 組新生軟骨表面光滑，與周圍正常軟骨平齊，C、D 組新生軟骨組織接近于正常軟骨組織。見圖 5。
圖5
術后各時間點各組大體觀察 箭頭示骨軟骨缺損處 從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 3 個月；b. 術后 6 個月
Figure5.
General observation of each group at each time point after repair Arrow indicated osteochondral defects From left to right for groups A, B, C, and D respectively a. At 3 months after repair; b. At 6 months after repair
2.2.3 組織學觀察 術后 3 個月內復合支架已完全降解。HE 染色及甲苯胺藍染色示，術后 3 個月，A、B 組可見缺損仍明顯，缺損處被少量纖維組織填充；C、D 組可見厚薄不均的少量透明軟骨生成，軟骨表面有大小不一的裂隙，軟骨細胞排列雜亂無規則，軟骨下骨由少許骨痂組成。術后 6 個月，A、B 組可見缺損尚未修復，缺損處以大量纖維組織為主；C、D 組新生軟骨細胞呈圓形或橢圓形，排列密集，可見軟骨下有大量骨細胞成扁橢圓形排列。術后 3、6 個月 C 組缺損處新生骨軟骨組織與 D 組類似。見圖 6、7。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察 黃箭頭示纖維組織，黑箭頭示新生軟骨 a. 術后 3 個月 A 組（×40）；b. 術后 3 個月 B 組（×40）；c. 術后 3 個月 C 組（×100）；d. 術后 3 個月 D 組（×100）；e. 術后 6 個月 A 組（×40）；f. 術后 6 個月 B 組（×40）；g. 術后 6 個月 C 組（×100）；h. 術后 6 個月 D 組（×100）
Figure6.
HE staining observation of each group at each time point after repair Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)
圖7
術后各時間點各組甲苯胺藍染色觀察 黃箭頭示纖維組織，黑箭頭示新生軟骨 a. 術后 3 個月 A 組（×40）；b. 術后 3 個月 B 組（×40）；c. 術后 3 個月 C 組（×100）；d. 術后 3 個月 D 組（×100）；e. 術后 6 個月 A 組（×40）；f. 術后 6 個月 B 組（×40）；g. 術后 6 個月 C 組（×100）；h. 術后 6 個月 D 組（×100）
Figure7.
Toluidine blue staining observation of each group at each time point after repair Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)
2.2.4 Western blot 法檢測 Ⅱ 型膠原蛋白表達 術后 3、6 個月，C、D 組缺損處新生組織中 Ⅱ 型膠原蛋白表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后 6 個月 C、D 組缺損處新生組織中 Ⅱ 型膠原蛋白表達量顯著高于術后 3 個月時，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖 8。
圖8
術后各時間點各組 Western blot 檢測
Ⅱ型膠原表達a. 術后 3 個月蛋白印跡圖 1: A 組 2: B 組 3: C 組 4: D 組；b. 術后 6 個月蛋白印跡圖 1: A 組 2: B 組 3: C 組 4: D 組；c. Ⅱ 型膠原蛋白相對表達量
Figure8.
Expression of collagen type II of each group at each time point after repair a. Electrophoretic pattern at 3 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Electrophoretic pattern at 6 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; c. Relative expression of collagen type II
3 討論
目前針對骨軟骨組織損傷的治療雖取得一定進展，但臨床療效仍不確切。傳統的保守療法、自體或異體骨軟骨移植術均存在治療效果不佳、來源有限和潛在的異源性疾病感染等缺陷[10]，無法滿足骨軟骨損傷患者的治療需求。單層軟骨支架存在機械強度不足、支架與軟骨下骨界面耦合欠佳等缺陷[11-12]。雙層或多層復合支架以其獨特優勢被廣泛用于組織工程骨軟骨支架研究中。林建華等[13]研究發現構建的膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石仿生復合支架無細胞毒性、急性全身毒性，骨植入實驗顯示該復合支架具有良好的生物相容性。Da 等[14]研究將膠原蛋白包裹 PLGA/β-磷酸三鈣作為骨支架、牛關節軟骨細胞外基質通過加工作為軟骨支架，再將兩者融合構建成骨軟骨復合支架，發現其對兔骨軟骨缺損有較好的修復效果。本實驗結果顯示，用“3 層夾心法”構建的凹凸棒石/膠原蛋白/柚皮苷骨軟骨復合支架具有良好的加工和成型特點、較高的孔隙率、良好的生物相容性和促細胞增殖作用，載柚皮苷微球也具有良好的藥物緩釋效果。
柚皮苷是中藥骨碎補的主要活性物質之一，為二氫黃酮類化合物[15]。有研究發現柚皮苷可促進軟骨細胞增殖，顯著提高過氧化物歧化酶活性，降低一氧化氮合成酶活性，保護軟骨細胞免受細胞因子的損傷[7]。蘇友新等[8]研究發現柚皮苷可抑制小窩蛋白 1（caveolin-1）、磷酸化 p38 和磷酸化核轉錄因子-2 蛋白的表達，抑制 caveolin-p38 MAPK 信號通路，進一步降低 IL-1β 和 TNF-α mRNA 在 caveolin-p38 MAPK 信號通路的下游表達，進而起到保護軟骨細胞的作用。柚皮苷對軟骨組織和軟骨細胞的保護作用可能還與抑制 NF-κB 信號通路相關[16]。凹凸棒石是一種具有鏈層狀結構的含水富鎂鋁硅酸鹽的白色黏土礦物，呈土狀，質地細膩，有油脂滑感，吸水性強，含有不定量的 Na+、Ca2+、Fe3+、Al3+ 等[17]。因其具有納米結構，比表面積大，可形成通道易于細胞生長和組織形成等特點，本課題組率先利用凹凸棒石作為骨支架進行了大量研究。張曉敏等[18-19]研究發現凹凸棒石/膠原骨支架能促進細胞增殖及其成骨相關基因 Osterix、Ⅰ 型膠原、骨橋蛋白、ALP 等的表達，并對兔橈骨缺損具有較好的修復效果，顯示出了該支架具有良好的生物相容性和骨誘導性。本實驗利用柚皮苷和凹凸棒石促進軟骨和骨細胞增殖的特點來構建骨軟骨復合支架，并以具有顯著促軟骨生長作用的 TGF-β1[20-21]作為陽性對照，研究其對骨軟骨缺損的修復效果。
術后大體觀察、組織學染色結果均顯示，術后 6 個月時，載柚皮苷復合支架組和載 TGF-β1 復合支架組對軟骨損傷的修復效果明顯好于無載柚皮苷復合支架組，其中載柚皮苷復合支架組與載 TGF-β1 復合支架組對骨軟骨損傷的修復效果類似；同時軟骨下骨有大量新生骨形成，表明以凹凸棒石/膠原蛋白構建的支架能促進骨形成，這與本課題組前期研究報道[18-19]一致。利用 Western blot 檢測缺損處新生軟骨中 Ⅱ 型膠原表達，同樣證明了組織學的上述結果，即在軟骨修復過程中載柚皮苷復合支架組和載 TGF-β1 復合支架組 Ⅱ 型膠原蛋白的表達顯著上調，其中術后 6 個月 Ⅱ 型膠原蛋白的表達水平明顯高于術后 3 個月。以上結果提示，利用柚皮苷替代生長因子 TGF-β1 能促進軟骨的再生和修復，具有與生長因子類似的效果。選擇類似于柚皮苷的中藥單體作為促進軟骨生長和修復的誘導分子，具有價格低廉、不易失活和易于保存等優點，將其與組織工程技術有機結合具有一定創新性和臨床應用價值。
綜上述，本實驗構建的凹凸棒石/膠原蛋白/柚皮苷骨軟骨復合支架，不僅具有良好的細胞和組織相容性，同時對骨軟骨缺損有較好的修復效果，通過后續對支架制備工藝的改造和提升，有望成為一種具有自主知識產權的新型組織工程骨軟骨復合支架。
骨軟骨損傷臨床十分常見，通常直徑>4 mm 的軟骨損傷不能自行修復[1-2]，對患者的身心健康造成嚴重影響。組織工程技術的出現為骨軟骨損傷修復和功能恢復帶來希望。單層支架往往不能滿足骨和軟骨兩種不同組織生長所需的細胞外環境，限制了其在骨軟骨組織工程中的廣泛應用[3]。目前構建雙層或多層復合支架用于修復骨軟骨損傷成為骨軟骨組織工程研究的熱點之一。同時，有關復合生長因子的支架對骨軟骨損傷的研究較多，且有較好的修復效果[4-6]，但生長因子價格昂貴，臨床應用也有限。傳統中藥骨碎補單體成分柚皮苷具有促進軟骨細胞生長和增殖的作用[7-8]，將其用于組織工程支架中修復骨軟骨損傷，是一種新的創新和嘗試。本實驗利用柚皮苷作為緩釋藥物與膠原蛋白復合構建軟骨層支架，凹凸棒石與膠原蛋白復合構建骨層支架，通過膠原蛋白將兩者黏接成骨軟骨 3 層復合支架，采用相應方法綜合評價藥物的緩釋效果、支架表征及其對兔骨軟骨缺損的修復效果，旨在為臨床修復骨軟骨缺損提供一種新型仿生復合支架。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性日本大耳白兔 40 只，體質量 2.0～2.5 kg，由中國農科院蘭州獸醫研究所提供。
BMSCs（ATCC 公司，美國）；柚皮苷（Aladdin 公司，美國）；凹凸棒石（中科院蘭州物理化學研究所）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、TGF-β1（Sigma 公司，美國）；Ⅰ 型膠原（豬皮中提取）由本實驗室自制；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海東仁化學科技有限公司）；甲苯胺藍軟骨染色液（北京雷根生物技術有限公司）；Ⅱ 型膠原小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG（Abcom 公司，英國）。紫外分光光度儀（HP 公司，美國）；酶標儀（美國伯爵儀器有限公司）；冷凍干燥機（中國軍事醫學科學院實驗儀器廠）；JSM-5600LV 低真空型掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 復合支架的構建
1.2.1 微球制備 稱取 2 mg 柚皮苷溶于 2 mL 去離子水中作內水相，取 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中作油相；將內水相逐滴加至油相，迅速于超聲波 100 W 超聲 30 s，使混合相（W/O）變均勻。再取 20 mL 1% 聚乙烯醇溶液作外水相，將混合相逐滴加至外水相中，同時于超聲波 100 W 超聲 30 s，使混合液（W/O/W）變乳白色，再轉至通風櫥內磁力攪拌過夜。然后以離心半徑 2.5 cm、13 000 r/min 離心 10 min，取試管底部沉淀物經去離子水洗滌、同上法離心、真空冷凍干燥制得載柚皮苷微球。同時用上述方法制備無載柚皮苷微球。
1.2.2 軟骨層支架構建 稱取載柚皮苷微球、殼聚糖、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶入 15 mL 1% 冰乙酸溶液中，攪拌混合均勻，形成乳白色混合物；將其裝入直徑 4.5 mm 的特制圓柱體模具中，–20℃ 冷凍使其呈圓柱體棒狀物，切成 2 mm 厚的圓形薄片，冷凍干燥制得載柚皮苷微球的軟骨層支架。同時用上述方法構建無載柚皮苷微球的軟骨層支架，保存備用。
1.2.3 骨層支架構建 稱取凹凸棒石、聚己內酯、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶于 15 mL 六氟異丙醇溶液中，磁力攪拌 2 h；加入 2.5 g NaCl 作致孔劑，攪拌混合均勻；待大部分六氟異丙醇揮發后，裝入直徑 4.5 mm 的特制圓柱體模具中，通風櫥內使其凝固成圓柱體棒狀物，切成 2 mm 厚的圓形薄片，37℃ 烘箱中烘干，除盡六氟異丙醇，再經去離子水脫鹽后，冷凍干燥制得骨層支架，保存備用。
1.2.4 黏接層溶液構建 取聚己內酯、Ⅰ 型膠原各 0.6 g，溶于 10 mL 六氟異丙醇溶液中，攪拌混合均勻備用。
1.2.5 復合支架構建 將構建的軟骨層、骨層支架的一面分別浸漬在黏接層溶液中，數秒后取出黏貼在一起，烘箱中烘干，制得直徑為 4.5 mm、厚 4 mm 的軟骨層-黏接層-骨層 3 層結構的復合支架，60Co 輻照滅菌后，4℃ 保存。
1.3 復合支架評價
1.3.1 藥物緩釋測定 精確稱取 500 mg 載柚皮苷微球的軟骨層支架，加入 50 mL PBS 中，密封置于 37℃ 恒溫平板搖床中勻速搖動，分別于 1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h 時取出 0.5 mL 溶液保存待測，并補回 0.5 mL PBS。待所有時間點取樣完畢后，紫外分光光度儀檢測其吸光度（A）值，參考文獻[9]方法計算柚皮苷緩釋率。
1.3.2 細胞在軟骨層支架上增殖檢測 向無載柚皮苷微球的軟骨層支架上逐滴加入 10 ng/mL TGF-β1 500 μL 作為陽性對照，烘箱中靜置過夜。將無載柚皮苷微球（A 組）、載柚皮苷微球（B 組）、載 TGF-β1 軟骨層支架（C 組）分別置于 96 孔板中，每組設 4 個復孔，DMEM/F12 培養基預濕；吸取 100 μL 濃度為 5×105 個/mL 的 BMSCs 懸液接種于支架上，分別于 1、2、3、4 d 將支架轉移至新孔板中，再加入 10 μL CCK-8 試劑，孵育 4 h 后，每孔吸出 80 μL 至新孔板中，于酶標儀 450 nm 處測其A 值。
1.3.3 掃描電鏡觀察表面形貌 隨機選取載柚皮苷微球、載柚皮苷復合支架，制樣、噴金，掃描電鏡觀察微球的形態、大小及復合支架的微觀形貌。BMSCs 在載柚皮苷軟骨層支架上增殖（同 1.3.2 方法）7 d 后取出，2.5% 戊二醛固定 24 h，洗滌、干燥，掃描電鏡觀察細胞在軟骨層支架上的黏附情況。
1.4 兔體內植入實驗觀察
1.4.1 實驗分組及方法 將 40 只日本大耳白兔隨機分為 4 組，每組 10 只。所有實驗動物采用 10% 水合氯醛耳緣靜脈注射（2 mL/kg）麻醉，雙膝關節部剃毛、消毒，于膝關節內側繞髕骨作弧形縱切口，充分暴露股骨髁間窩，利用電鉆于髁間窩制備直徑 4.5 mm、深 4.0 mm 的骨軟骨全層缺損模型。其中 A 組為缺損組（空白對照），僅制備缺損模型，不作其他處理；B、C、D 組分別于骨軟骨缺損處植入無載柚皮苷復合支架（陰性對照組）、載柚皮苷復合支架（實驗組）及載 TGF-β1 復合支架（陽性對照組）。術后每日肌肉注射青霉素 20 萬 U 至術后 7 d，每日觀察損傷局部有無感染及兔飲食、活動情況。
1.4.2 大體觀察 術后 3、6 個月時采用空氣栓塞法每組分別處死 3 只動物，取出股骨髁間窩，肉眼觀察骨軟骨缺損處軟骨修復效果。
1.4.3 組織學染色觀察 術后 3、6 個月將取出的股骨髁間窩置于 4% 甲醛中固定 3 d，10%EDTA-Na2 液中脫鈣 30 d，常規石蠟包埋、切片，行 HE 染色及甲苯胺藍染色，倒置顯微鏡下觀察。
1.4.4 Western blot 法檢測 Ⅱ 型膠原蛋白表達 術后 3、6 個月采用空氣栓塞法每組各處死 2 只動物，取出股骨髁間窩，于原骨軟骨缺損處用電環鉆取出直徑 5 mm 圓柱狀骨軟骨組織，高效 RIPA 組織裂解液裂解，提取總蛋白，用 BCA 試劑對總蛋白進行定量；然后加上樣緩沖液，煮沸 10 min，采用 SDS-PAGE 凝膠分離電泳，轉硝酸纖維素膜上，封閉液封閉 2 h，用 Ⅱ 型膠原小鼠單克隆抗體（1∶400）室溫孵育過夜，TBST 清洗，辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠 IgG（1∶10 000）室溫孵育 2 h，TBST 清洗，ECL 顯色，曝光。采用 Image-pro plus 軟件計算各條帶的A 值，將與內參 β-actin 測定A 值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 復合支架相關觀測
2.1.1 藥物緩釋測定 6 h 前載柚皮苷微球的軟骨層支架中柚皮苷釋放率迅速增加，出現突釋現象，釋放率達到 4.27%；12 h 后釋放率趨于緩釋水平，平均釋放率為 4.39%。見圖 1。
圖1
柚皮苷釋放曲線
Figure1.
Release curve of naringin
2.1.2 細胞在軟骨層支架上增殖檢測 CCK-8 法檢測示，2～4 d 時 B、C 組促細胞增殖率顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測 BMSCs 在各軟骨層支架上的增殖情況
Figure2.
Proliferation of BMSCs on each cartilage layer scaffold by cell countin kit 8
2.1.3 微球及復合支架表面特征觀察 肉眼觀察復合支架呈白色圓柱狀，直徑 4.5 mm，厚 4 mm，其中軟骨層支架厚 2 mm，骨層支架厚 2 mm。見圖 3。掃描電鏡觀察示微球表面光滑，大小均一，平均粒徑 4.5 μm（圖 4a）。復合支架結構分層明顯，軟骨層支架與骨層支架黏接處緊密相連；軟骨層支架呈多孔片層結構，排列無規則且相互連通，微球均勻分散于軟骨層支架中；骨層支架結構致密，有大小不等的孔徑相通，孔徑 200～300 μm（圖 4b～d）。細胞呈扁平或多角不規則形黏附于軟骨層支架內，有些細胞相互接觸、聚集成片（圖 4e）。
圖3
復合支架大體觀察
Figure3.
General observation of composite scaffolds
圖4
掃描電鏡觀察 a. 微球（×5 000）；b. 復合支架（×35）；c. 軟骨層支架（×1 000）；d. 骨層支架（×50）；e. 軟骨層支架表面細胞黏附情況（×500）
Figure4.
Scanning electron microscope observation a. Microspheres (×5 000); b. Composite scaffold (×35); c. Cartilage layer scaffold (×1 000); d. Bone layer scaffold (×50); e. Cells adhesion on the surface of cartilage layer scaffold (×500)
2.2 兔體內植入實驗觀察
2.2.1 一般情況觀察 術后 1 d 所有兔飲食恢復正常，無骨折脫位，無化膿、感染等，術后 7 d 創口愈合良好，活動自如。
2.2.2 缺損處大體觀察 術后 3 個月各組均可見大小不等的軟骨缺損，C、D 組缺損范圍與 A、B 組相比明顯縮小。術后 6 個月，A 組缺損處有大量結締組織填充，邊界仍清晰可見，缺損直徑約 4 mm；B 組缺損處被少量新生軟骨組織和大量結締組織覆蓋；C 組缺損處被平滑的新生軟骨完全覆蓋，且新生軟骨與周圍正常軟骨融合；D 組新生軟骨表面光滑，與周圍正常軟骨平齊，C、D 組新生軟骨組織接近于正常軟骨組織。見圖 5。
圖5
術后各時間點各組大體觀察 箭頭示骨軟骨缺損處 從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 3 個月；b. 術后 6 個月
Figure5.
General observation of each group at each time point after repair Arrow indicated osteochondral defects From left to right for groups A, B, C, and D respectively a. At 3 months after repair; b. At 6 months after repair
2.2.3 組織學觀察 術后 3 個月內復合支架已完全降解。HE 染色及甲苯胺藍染色示，術后 3 個月，A、B 組可見缺損仍明顯，缺損處被少量纖維組織填充；C、D 組可見厚薄不均的少量透明軟骨生成，軟骨表面有大小不一的裂隙，軟骨細胞排列雜亂無規則，軟骨下骨由少許骨痂組成。術后 6 個月，A、B 組可見缺損尚未修復，缺損處以大量纖維組織為主；C、D 組新生軟骨細胞呈圓形或橢圓形，排列密集，可見軟骨下有大量骨細胞成扁橢圓形排列。術后 3、6 個月 C 組缺損處新生骨軟骨組織與 D 組類似。見圖 6、7。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察 黃箭頭示纖維組織，黑箭頭示新生軟骨 a. 術后 3 個月 A 組（×40）；b. 術后 3 個月 B 組（×40）；c. 術后 3 個月 C 組（×100）；d. 術后 3 個月 D 組（×100）；e. 術后 6 個月 A 組（×40）；f. 術后 6 個月 B 組（×40）；g. 術后 6 個月 C 組（×100）；h. 術后 6 個月 D 組（×100）
Figure6.
HE staining observation of each group at each time point after repair Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)
圖7
術后各時間點各組甲苯胺藍染色觀察 黃箭頭示纖維組織，黑箭頭示新生軟骨 a. 術后 3 個月 A 組（×40）；b. 術后 3 個月 B 組（×40）；c. 術后 3 個月 C 組（×100）；d. 術后 3 個月 D 組（×100）；e. 術后 6 個月 A 組（×40）；f. 術后 6 個月 B 組（×40）；g. 術后 6 個月 C 組（×100）；h. 術后 6 個月 D 組（×100）
Figure7.
Toluidine blue staining observation of each group at each time point after repair Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)
2.2.4 Western blot 法檢測 Ⅱ 型膠原蛋白表達 術后 3、6 個月，C、D 組缺損處新生組織中 Ⅱ 型膠原蛋白表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后 6 個月 C、D 組缺損處新生組織中 Ⅱ 型膠原蛋白表達量顯著高于術后 3 個月時，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖 8。
圖8
術后各時間點各組 Western blot 檢測
Ⅱ型膠原表達a. 術后 3 個月蛋白印跡圖 1: A 組 2: B 組 3: C 組 4: D 組；b. 術后 6 個月蛋白印跡圖 1: A 組 2: B 組 3: C 組 4: D 組；c. Ⅱ 型膠原蛋白相對表達量
Figure8.
Expression of collagen type II of each group at each time point after repair a. Electrophoretic pattern at 3 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Electrophoretic pattern at 6 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; c. Relative expression of collagen type II
3 討論
目前針對骨軟骨組織損傷的治療雖取得一定進展，但臨床療效仍不確切。傳統的保守療法、自體或異體骨軟骨移植術均存在治療效果不佳、來源有限和潛在的異源性疾病感染等缺陷[10]，無法滿足骨軟骨損傷患者的治療需求。單層軟骨支架存在機械強度不足、支架與軟骨下骨界面耦合欠佳等缺陷[11-12]。雙層或多層復合支架以其獨特優勢被廣泛用于組織工程骨軟骨支架研究中。林建華等[13]研究發現構建的膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石仿生復合支架無細胞毒性、急性全身毒性，骨植入實驗顯示該復合支架具有良好的生物相容性。Da 等[14]研究將膠原蛋白包裹 PLGA/β-磷酸三鈣作為骨支架、牛關節軟骨細胞外基質通過加工作為軟骨支架，再將兩者融合構建成骨軟骨復合支架，發現其對兔骨軟骨缺損有較好的修復效果。本實驗結果顯示，用“3 層夾心法”構建的凹凸棒石/膠原蛋白/柚皮苷骨軟骨復合支架具有良好的加工和成型特點、較高的孔隙率、良好的生物相容性和促細胞增殖作用，載柚皮苷微球也具有良好的藥物緩釋效果。
柚皮苷是中藥骨碎補的主要活性物質之一，為二氫黃酮類化合物[15]。有研究發現柚皮苷可促進軟骨細胞增殖，顯著提高過氧化物歧化酶活性，降低一氧化氮合成酶活性，保護軟骨細胞免受細胞因子的損傷[7]。蘇友新等[8]研究發現柚皮苷可抑制小窩蛋白 1（caveolin-1）、磷酸化 p38 和磷酸化核轉錄因子-2 蛋白的表達，抑制 caveolin-p38 MAPK 信號通路，進一步降低 IL-1β 和 TNF-α mRNA 在 caveolin-p38 MAPK 信號通路的下游表達，進而起到保護軟骨細胞的作用。柚皮苷對軟骨組織和軟骨細胞的保護作用可能還與抑制 NF-κB 信號通路相關[16]。凹凸棒石是一種具有鏈層狀結構的含水富鎂鋁硅酸鹽的白色黏土礦物，呈土狀，質地細膩，有油脂滑感，吸水性強，含有不定量的 Na+、Ca2+、Fe3+、Al3+ 等[17]。因其具有納米結構，比表面積大，可形成通道易于細胞生長和組織形成等特點，本課題組率先利用凹凸棒石作為骨支架進行了大量研究。張曉敏等[18-19]研究發現凹凸棒石/膠原骨支架能促進細胞增殖及其成骨相關基因 Osterix、Ⅰ 型膠原、骨橋蛋白、ALP 等的表達，并對兔橈骨缺損具有較好的修復效果，顯示出了該支架具有良好的生物相容性和骨誘導性。本實驗利用柚皮苷和凹凸棒石促進軟骨和骨細胞增殖的特點來構建骨軟骨復合支架，并以具有顯著促軟骨生長作用的 TGF-β1[20-21]作為陽性對照，研究其對骨軟骨缺損的修復效果。
術后大體觀察、組織學染色結果均顯示，術后 6 個月時，載柚皮苷復合支架組和載 TGF-β1 復合支架組對軟骨損傷的修復效果明顯好于無載柚皮苷復合支架組，其中載柚皮苷復合支架組與載 TGF-β1 復合支架組對骨軟骨損傷的修復效果類似；同時軟骨下骨有大量新生骨形成，表明以凹凸棒石/膠原蛋白構建的支架能促進骨形成，這與本課題組前期研究報道[18-19]一致。利用 Western blot 檢測缺損處新生軟骨中 Ⅱ 型膠原表達，同樣證明了組織學的上述結果，即在軟骨修復過程中載柚皮苷復合支架組和載 TGF-β1 復合支架組 Ⅱ 型膠原蛋白的表達顯著上調，其中術后 6 個月 Ⅱ 型膠原蛋白的表達水平明顯高于術后 3 個月。以上結果提示，利用柚皮苷替代生長因子 TGF-β1 能促進軟骨的再生和修復，具有與生長因子類似的效果。選擇類似于柚皮苷的中藥單體作為促進軟骨生長和修復的誘導分子，具有價格低廉、不易失活和易于保存等優點，將其與組織工程技術有機結合具有一定創新性和臨床應用價值。
綜上述，本實驗構建的凹凸棒石/膠原蛋白/柚皮苷骨軟骨復合支架，不僅具有良好的細胞和組織相容性，同時對骨軟骨缺損有較好的修復效果，通過后續對支架制備工藝的改造和提升，有望成為一種具有自主知識產權的新型組織工程骨軟骨復合支架。
