引用本文： 符鋒, 趙明亮, 李曉紅, 陳翀, 王麗娜, 孫洪濤, 涂悅, 張賽. 基于MRI數據的3D打印定制腦組織空腔支架的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(11): 1425-1430. doi: 10.7507/1002-1892.20160294 復制
創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）因其高死亡率和高致殘率，一直以來都是威脅人類生命和影響生活質量的全球性疾病[1]。TBI導致的神經組織缺損可能會形成瘢痕空腔，進而阻礙軸突再生，影響患者預后[2]。近年來，組織工程及神經科學在發展中不斷融合，研究能夠填補腦組織缺損的生物替代品成為了熱點，這為臨床上TBI后腦組織缺損修復提供了新的思路和方向[3]。顆粒瀝濾和溶劑蒸發等常規方法制備的空腔支架在神經修復中的作用雖已被證實[4-5]，但大多采取固定模式進行統一化生產，故單一化的外部輪廓不能與特異化的損傷部位吻合，隨機化的內部結構會阻礙營養物質的運輸，并限制神經細胞遷移和生存[6]。3D打印技術為解決上述問題提供了思路。結合計算機輔助設計（computer aided design，CAD）、先進的影像學技術和3D打印技術，人們可基于患者特異性影像學數據精確控制支架外部輪廓和內部結構，實現個性化定制空腔支架修復腦組織損傷[7-9]。本研究采用電子控制性腦皮質撞擊儀（electric controlled cortical impactor，eCCI）建立TBI大鼠模型，基于MRI數據集采用Mimics軟件重建損傷空腔表面輪廓，CAD構建內部正交叉結構，通過3D生物打印機制作腦組織空腔支架，為支架聯合干細胞治療TBI奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠5只，體質量（300±10）g，由軍事醫學科學院提供。殼聚糖（脫乙酰度75%~85%；Sigma公司，美國）；膠原蛋白（牛肌腱）購自當地農貿市場。3.0T MRI掃描儀（Siemens公司，德國）；大鼠專用線圈（上海辰光醫療科技股份有限公司）；3D生物打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；FEI QUANTA 200掃描電鏡（Phenom公司，荷蘭）；eCCI（Custom & Design公司，美國）。三維重建軟件Mimics（Materialise公司，比利時）；SolidWorks軟件、3D打印軟件Meshmixer（Autodesk公司，美國）。
1.2 大鼠TBI模型建立
取5只SD大鼠，參照文獻[10]方法制備TBI模型。大鼠經腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）麻醉，俯臥位固定后常規消毒。無菌條件下，于SD大鼠前囟與“人”字點連線上3.8 mm，向右旁開2.5 mm顱鉆鉆孔，直徑5 mm，暴露完整硬腦膜，應用eCCI，調整打擊參數：打擊速度5 m/s，打擊深度3 mm，打擊最低點持續時間200 ms。仔細檢查大腦損傷區域后，及時清除血腫并充分止血，逐層縫合關閉傷口，待大鼠蘇醒后放回籠中。
1.3 大鼠大腦MRI掃描
致傷24 h后，采用MRI掃描儀和大鼠專用線圈對損傷后大鼠進行頭顱掃描。實驗大鼠同上法麻醉后俯臥，自嗅溝水平向尾側作連續冠狀位掃描，獲取常規T2 3D成像，具體參數[11]：重復時間TR 1?000?ms，回波時間TE 146 ms，層厚2 mm，矩陣256×128。掃描數據以Dicom格式保存。MRI顯示致傷側腦組織損傷改變，皮層的低信號區域提示損傷灶空腔范圍。5只大鼠空腔位置均限于大腦右側皮層區，中線未發生明顯偏移。見圖 1。
圖1
MRI觀察大鼠TBI后腦組織空腔???橫斷位???矢狀位???冠狀位??圖 2 Mimics軟件中重建的大鼠TBI后空腔三維模型??圖 3支架三維模型構建及結構優化??? 3D打印軟件Meshmixer中清除空腔內殘留血塊???面網格優化???在SolidWorks軟件中填充正交叉結構??圖 4 3D打印支架觀察???支架外觀???支架橫截面觀察內部結構??圖 5 3D打印支架掃描電鏡觀察???支架內部微觀結構（×60）???支架表面微觀結構（×500）
Figure1.
MRI images of rats' brain tissue cavity after TBI ??? Axial view ??? Sagittal view ??? Coronal view ??Fig.2 The 3D model of brain cavity in TBI rats in Mimics software ??Fig.3 Optimization and microarchitecture of the cavity scaffold design ??? Cleaning residual blood clots in the cavity via Meshmixer software ??? Surface mesh optimization ??? Filling in the orthogonal periodic porous architecture for scaffold by SolidWorks software ??Fig.4 Observation of 3D print scaffold ??? The appearance of scaffold ??? The internal structure through cross section view ??Fig.5 Scaning electron microscope images of 3D print scaffold ??? Internal microstructure of the scaffold (×60) ??? Surface microstructure of the scaffold (×500)
1.4 支架三維模型構建
①?將Dicom格式源文件導入Mimics軟件后，計算機自動生成冠狀面圖和矢狀面圖，采用定位導航功能確定空腔范圍。②?從“分割功能區（Segmentation）”中激活“動態區域增長（Dynamic region growing）”工具，選中“空隙填補”與“多層操作”選項，點擊圖像中的空腔，將所有相連的體素添加到新的蒙罩中。③?使用Crop Mask工具將感興趣的區域限制在空腔周圍。④?利用“圖像編輯（Edit）”功能，采用鏡像技術，即參照未損傷側大腦結構，進一步修整損傷側空腔結構。⑤?連續翻閱圖像確認空腔完整性后，利用“三維計算（Calculate 3D）”功能，選取輪廓內插法，清楚直觀地再現空腔三維形態，以STL格式保存[12]。見圖 2。⑥?在Meshmixer軟件中打開前期Mimics軟件生成的STL格式文件，運用“選擇（Select）”和“編輯（Edit）”工具仔細清除空腔內殘留的血塊（圖 3a），并通過減少三角形、光滑表面、邊減少、矩陣減少等方式獲取經過面網格優化后的模型（圖 3b）。⑦?在SolidWorks軟件中填充正交叉結構（圖 3c）。
1.5 3D打印支架及觀測
1.5.1 膠原-殼聚糖復合材料制備
膠原蛋白制備[13]：取新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/L Tris緩沖液浸泡后收集沉淀，加入含有胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清液；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d，制得膠原凝膠。將殼聚糖溶解于1%醋酸溶液，按殼聚糖:膠原質量比為1:1加入膠原蛋白，充分攪拌混合后，將復合材料裝填入低溫打印機料筒后，高速離心排除氣泡供3D打印備用。
1.5.2 3D打印
將支架三維模型以STL格式導入3D生物打印機控制軟件，采用160 μm噴頭并設置相應打印參數：擠出速度0.32 mm/min，行走速度12?mm/s，層厚100 μm，噴頭溫度15℃，平臺成型溫度-?20℃。由于大鼠大腦空腔較小，且需兼顧內部結構，3D打印制作有一定困難，因此在前期研究基礎上，將支架原型放大5倍。將填有膠原蛋白-殼聚糖復合材料的料筒安裝到打印操作桿，調節擠壓力至出絲順利后開始打印。3D打印機按照平臺掃描路徑在X、Y、Z軸上逐層噴涂，直至完成設計的仿生空腔支架，將成型支架放入真空冷凍干燥機中冷凍24 h后得到成品。
1.5.3 支架形態及表征觀測
肉眼觀察3D打印膠原蛋白-殼聚糖復合支架的大小及形狀。將3D打印支架表面噴金后，采用掃描電鏡觀察支架內部三維結構，包括細絲疊加孔隙結構和支架表面形態。
2 結果
3D打印支架不僅外部輪廓與大鼠腦組織缺損部位相近，支架內部還有細絲正交叉疊加結構（圖 4）。掃描電鏡觀察示，四邊形孔狀結構分布均勻，膠原蛋白-殼聚糖材料內部和表面還有微孔結構，孔徑大小不等，孔隙之間相通性好（圖 5）。
3 討論
TBI的病理生理機制較為復雜，原發性和繼發性腦損傷可能導致神經組織缺失，進而形成由神經膠質瘢痕包裹的空腔[2, 14]。空腔形成的物理和化學屏障抑制軸突再生，影響了神經組織再生和功能恢復[15-16]。空腔支架因可提供橋接損傷組織間的物理連接和提供細胞浸潤及增殖的支撐結構，逐漸成為了神經再生的關鍵因素[17]。近年來，人們基于組織工程學原理，正在探索各種方法修復神經組織。理想的神經組織空腔支架需要在宏觀和微觀水平上設計支架結構，以達到仿生效果[18]。腦創傷類型、損傷部位、受傷程度等均會影響缺損空腔的形狀與大小，空腔支架外部輪廓與缺損部位較好地契合，才能減少支架移動、錯位和對周圍組織的擠壓[19]。研究發現，支架植入復雜的腦組織后，即使是非常小的錯位也會引起潛在的災難性后果[20]。內部結構的控制對支架的力學性能、營養運輸和神經細胞-基質相互作用等非常重要[21]。3D打印技術是一種以數字模型文件為基礎，通過分層制造、逐層疊加的方式來構造物體的技術，它可將支架內部空隙、懸臂、狹窄的彎曲結構等復雜三維形狀簡化為點、線、圓等打印途徑[22]。因此，本研究基于大鼠個性化影像學資料，利用3D打印技術在宏觀和微觀水平控制大鼠腦組織空腔支架制造，高度仿生腦組織缺損結構，為探索制造有利于軸突定向生長、促進損傷區域有效修復的生物支架的方法奠定基礎。
組織工程學應用于神經組織修復的關鍵技術是設計和制造復雜的三維生物支架[23]。3D打印的基礎是三維模型的建立，本研究通過將影像學技術、三維重建技術、CAD技術和3D打印技術相結合，在一定程度上實現了個性化定制腦組織空腔支架。首先，個體特異性的影像學數據能如實提供缺損空腔信息，為精確化支架外部輪廓設計提供便利。常規方法批量生產的均碼生物支架為滿足受體，常存在長了需要截、短了需要接的情況。本研究利用大鼠MRI掃描數據重建空腔三維模型，獲取能使支架與缺損部位較好契合的個體化外部輪廓，可最大限度避免支架植入后的移動或錯位。同時，因3D打印過程是將模型分割成一系列有序的二維層面并在計算機控制下逐層打印制造，所以需要模型內部和外部結構層層連續，否則無法打印出完整空腔支架。本研究中，我們從Mimics軟件獲取的初始模型內部仍存在一些雜質。為此，我們將三維模型導入3D打印軟件Meshmixer中進行后期處理，清除空腔內殘留的血塊并通過減少三角形、光滑表面、邊減少、矩陣減少等方式得到經過面網格優化后的模型。其次，重建技術與CAD相結合，可通過優化支架內部結構更好地達到仿生效果。合適的內部結構有利于氧氣、營養物質與代謝產物的交換，為細胞的大量種植和增殖、細胞外基質的分泌以及血管和神經的內生長提供空間和環境[24]。Wong等[19]針對支架內部結構對大腦皮層損傷修復的影響進行了研究。結果顯示，支架內充分交叉的通道有利于細胞遷移和組織再生。而Domingos研究小組[25]系統分析了支架孔徑大小和幾何形狀對細胞生存能力的影響后指出，大的四邊形孔徑能增強BMSCs的生存力和增殖力。因此，本研究初步探索了在仿生腦組織空腔支架內填充打印正交叉結構的方法，為將來制備模擬細胞外基質的復雜內部結構奠定基礎。
支架材料擁有良好的生物相容性是修復神經損傷的前提，而探尋適合3D生物打印條件的材料是構建復雜支架結構的基礎。膠原蛋白是最豐富的哺乳動物蛋白，具有良好的生物相容性和低抗原性[26]。在嚙齒動物脊髓損傷和腦外傷模型中的體內植入實驗已表明膠原具有橋接神經組織、促進軸突再生和血管生成等功能[27-28]。然而，因膠原蛋白存在機械強度低和降解速度快等缺點，常需與其他材料復合以改善其性能。前期研究發現，帶正電荷的殼聚糖和帶負電荷的膠原蛋白之間可形成離子配合物，從而增強膠原蛋白機械性能并降低其降解率[29]。本研究中，我們將制備好的液態膠原-殼聚糖復合材料灌入打印噴頭，選擇低溫成型模式，調控噴頭“出絲速度”和“走絲速度”兩個關鍵參數，使材料從打印噴頭被高壓擠出后在冷卻平臺上迅速成型。根據前期研究結果，我們選擇采用正交叉結構填充支架內部并成功打印。空腔支架與植入腦組織部位相匹配的力學強度，能為細胞提供合適的微應力環境，并在體內力學微環境中保持結構穩定性和完整性。因此，簡單的正交叉結構仍不能高度仿真神經細胞周圍環境。下一步研究可在測量腦組織彈性模量的基礎上[30]，通過在3D打印過程中調整材料疊加角度、架孔徑和孔隙率等方式，使空腔支架具有與植入腦組織部位相匹配的力學強度。支架材料的降解性也是一個需要考慮的重要因素。支架植入體內后，應隨著新生組織的形成而逐漸溶解，并最終被機體吸收[31]。若降解速率太快，支架三維結構可能崩潰，無法指導細胞的生長和分化；若降解太慢，生物材料的殘留物可能阻礙營養轉移并導致組織壞死[32]。因此，使支架材料降解率與腦組織修復速度相適應十分必要。在此基礎上，還可探索在3D打印過程中添加NGF、定向分化誘導因子等修飾物質。需要指出的是，清除大鼠TBI后血腫形成的空腔可能會因水腫、繼發性出血、軟化灶形成等發生變化，動態觀測大鼠空腔變化以找到支架制備和植入的最佳時間點也是很重要的。以上問題均有待進一步研究。
綜上述，基于MRI數據的三維重建技術和CAD技術獲取腦組織空腔三維模型，以膠原蛋白-殼聚糖復合材料在3D打印機上制備的個性化神經組織工程支架，其外部輪廓與缺損部位形狀相似，內部正交叉結構符合腦皮層修復原則，且生物打印材料能滿足體內移植條件。未來集成生物材料學、細胞生物學、物理學和組織工程學等學科，有望使此技術成為定制空腔支架修復TBI后腦組織空腔的一種新方法。
創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）因其高死亡率和高致殘率，一直以來都是威脅人類生命和影響生活質量的全球性疾病[1]。TBI導致的神經組織缺損可能會形成瘢痕空腔，進而阻礙軸突再生，影響患者預后[2]。近年來，組織工程及神經科學在發展中不斷融合，研究能夠填補腦組織缺損的生物替代品成為了熱點，這為臨床上TBI后腦組織缺損修復提供了新的思路和方向[3]。顆粒瀝濾和溶劑蒸發等常規方法制備的空腔支架在神經修復中的作用雖已被證實[4-5]，但大多采取固定模式進行統一化生產，故單一化的外部輪廓不能與特異化的損傷部位吻合，隨機化的內部結構會阻礙營養物質的運輸，并限制神經細胞遷移和生存[6]。3D打印技術為解決上述問題提供了思路。結合計算機輔助設計（computer aided design，CAD）、先進的影像學技術和3D打印技術，人們可基于患者特異性影像學數據精確控制支架外部輪廓和內部結構，實現個性化定制空腔支架修復腦組織損傷[7-9]。本研究采用電子控制性腦皮質撞擊儀（electric controlled cortical impactor，eCCI）建立TBI大鼠模型，基于MRI數據集采用Mimics軟件重建損傷空腔表面輪廓，CAD構建內部正交叉結構，通過3D生物打印機制作腦組織空腔支架，為支架聯合干細胞治療TBI奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠5只，體質量（300±10）g，由軍事醫學科學院提供。殼聚糖（脫乙酰度75%~85%；Sigma公司，美國）；膠原蛋白（牛肌腱）購自當地農貿市場。3.0T MRI掃描儀（Siemens公司，德國）；大鼠專用線圈（上海辰光醫療科技股份有限公司）；3D生物打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；FEI QUANTA 200掃描電鏡（Phenom公司，荷蘭）；eCCI（Custom & Design公司，美國）。三維重建軟件Mimics（Materialise公司，比利時）；SolidWorks軟件、3D打印軟件Meshmixer（Autodesk公司，美國）。
1.2 大鼠TBI模型建立
取5只SD大鼠，參照文獻[10]方法制備TBI模型。大鼠經腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）麻醉，俯臥位固定后常規消毒。無菌條件下，于SD大鼠前囟與“人”字點連線上3.8 mm，向右旁開2.5 mm顱鉆鉆孔，直徑5 mm，暴露完整硬腦膜，應用eCCI，調整打擊參數：打擊速度5 m/s，打擊深度3 mm，打擊最低點持續時間200 ms。仔細檢查大腦損傷區域后，及時清除血腫并充分止血，逐層縫合關閉傷口，待大鼠蘇醒后放回籠中。
1.3 大鼠大腦MRI掃描
致傷24 h后，采用MRI掃描儀和大鼠專用線圈對損傷后大鼠進行頭顱掃描。實驗大鼠同上法麻醉后俯臥，自嗅溝水平向尾側作連續冠狀位掃描，獲取常規T2 3D成像，具體參數[11]：重復時間TR 1?000?ms，回波時間TE 146 ms，層厚2 mm，矩陣256×128。掃描數據以Dicom格式保存。MRI顯示致傷側腦組織損傷改變，皮層的低信號區域提示損傷灶空腔范圍。5只大鼠空腔位置均限于大腦右側皮層區，中線未發生明顯偏移。見圖 1。
圖1
MRI觀察大鼠TBI后腦組織空腔???橫斷位???矢狀位???冠狀位??圖 2 Mimics軟件中重建的大鼠TBI后空腔三維模型??圖 3支架三維模型構建及結構優化??? 3D打印軟件Meshmixer中清除空腔內殘留血塊???面網格優化???在SolidWorks軟件中填充正交叉結構??圖 4 3D打印支架觀察???支架外觀???支架橫截面觀察內部結構??圖 5 3D打印支架掃描電鏡觀察???支架內部微觀結構（×60）???支架表面微觀結構（×500）
Figure1.
MRI images of rats' brain tissue cavity after TBI ??? Axial view ??? Sagittal view ??? Coronal view ??Fig.2 The 3D model of brain cavity in TBI rats in Mimics software ??Fig.3 Optimization and microarchitecture of the cavity scaffold design ??? Cleaning residual blood clots in the cavity via Meshmixer software ??? Surface mesh optimization ??? Filling in the orthogonal periodic porous architecture for scaffold by SolidWorks software ??Fig.4 Observation of 3D print scaffold ??? The appearance of scaffold ??? The internal structure through cross section view ??Fig.5 Scaning electron microscope images of 3D print scaffold ??? Internal microstructure of the scaffold (×60) ??? Surface microstructure of the scaffold (×500)
1.4 支架三維模型構建
①?將Dicom格式源文件導入Mimics軟件后，計算機自動生成冠狀面圖和矢狀面圖，采用定位導航功能確定空腔范圍。②?從“分割功能區（Segmentation）”中激活“動態區域增長（Dynamic region growing）”工具，選中“空隙填補”與“多層操作”選項，點擊圖像中的空腔，將所有相連的體素添加到新的蒙罩中。③?使用Crop Mask工具將感興趣的區域限制在空腔周圍。④?利用“圖像編輯（Edit）”功能，采用鏡像技術，即參照未損傷側大腦結構，進一步修整損傷側空腔結構。⑤?連續翻閱圖像確認空腔完整性后，利用“三維計算（Calculate 3D）”功能，選取輪廓內插法，清楚直觀地再現空腔三維形態，以STL格式保存[12]。見圖 2。⑥?在Meshmixer軟件中打開前期Mimics軟件生成的STL格式文件，運用“選擇（Select）”和“編輯（Edit）”工具仔細清除空腔內殘留的血塊（圖 3a），并通過減少三角形、光滑表面、邊減少、矩陣減少等方式獲取經過面網格優化后的模型（圖 3b）。⑦?在SolidWorks軟件中填充正交叉結構（圖 3c）。
1.5 3D打印支架及觀測
1.5.1 膠原-殼聚糖復合材料制備
膠原蛋白制備[13]：取新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/L Tris緩沖液浸泡后收集沉淀，加入含有胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清液；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d，制得膠原凝膠。將殼聚糖溶解于1%醋酸溶液，按殼聚糖:膠原質量比為1:1加入膠原蛋白，充分攪拌混合后，將復合材料裝填入低溫打印機料筒后，高速離心排除氣泡供3D打印備用。
1.5.2 3D打印
將支架三維模型以STL格式導入3D生物打印機控制軟件，采用160 μm噴頭并設置相應打印參數：擠出速度0.32 mm/min，行走速度12?mm/s，層厚100 μm，噴頭溫度15℃，平臺成型溫度-?20℃。由于大鼠大腦空腔較小，且需兼顧內部結構，3D打印制作有一定困難，因此在前期研究基礎上，將支架原型放大5倍。將填有膠原蛋白-殼聚糖復合材料的料筒安裝到打印操作桿，調節擠壓力至出絲順利后開始打印。3D打印機按照平臺掃描路徑在X、Y、Z軸上逐層噴涂，直至完成設計的仿生空腔支架，將成型支架放入真空冷凍干燥機中冷凍24 h后得到成品。
1.5.3 支架形態及表征觀測
肉眼觀察3D打印膠原蛋白-殼聚糖復合支架的大小及形狀。將3D打印支架表面噴金后，采用掃描電鏡觀察支架內部三維結構，包括細絲疊加孔隙結構和支架表面形態。
2 結果
3D打印支架不僅外部輪廓與大鼠腦組織缺損部位相近，支架內部還有細絲正交叉疊加結構（圖 4）。掃描電鏡觀察示，四邊形孔狀結構分布均勻，膠原蛋白-殼聚糖材料內部和表面還有微孔結構，孔徑大小不等，孔隙之間相通性好（圖 5）。
3 討論
TBI的病理生理機制較為復雜，原發性和繼發性腦損傷可能導致神經組織缺失，進而形成由神經膠質瘢痕包裹的空腔[2, 14]。空腔形成的物理和化學屏障抑制軸突再生，影響了神經組織再生和功能恢復[15-16]。空腔支架因可提供橋接損傷組織間的物理連接和提供細胞浸潤及增殖的支撐結構，逐漸成為了神經再生的關鍵因素[17]。近年來，人們基于組織工程學原理，正在探索各種方法修復神經組織。理想的神經組織空腔支架需要在宏觀和微觀水平上設計支架結構，以達到仿生效果[18]。腦創傷類型、損傷部位、受傷程度等均會影響缺損空腔的形狀與大小，空腔支架外部輪廓與缺損部位較好地契合，才能減少支架移動、錯位和對周圍組織的擠壓[19]。研究發現，支架植入復雜的腦組織后，即使是非常小的錯位也會引起潛在的災難性后果[20]。內部結構的控制對支架的力學性能、營養運輸和神經細胞-基質相互作用等非常重要[21]。3D打印技術是一種以數字模型文件為基礎，通過分層制造、逐層疊加的方式來構造物體的技術，它可將支架內部空隙、懸臂、狹窄的彎曲結構等復雜三維形狀簡化為點、線、圓等打印途徑[22]。因此，本研究基于大鼠個性化影像學資料，利用3D打印技術在宏觀和微觀水平控制大鼠腦組織空腔支架制造，高度仿生腦組織缺損結構，為探索制造有利于軸突定向生長、促進損傷區域有效修復的生物支架的方法奠定基礎。
組織工程學應用于神經組織修復的關鍵技術是設計和制造復雜的三維生物支架[23]。3D打印的基礎是三維模型的建立，本研究通過將影像學技術、三維重建技術、CAD技術和3D打印技術相結合，在一定程度上實現了個性化定制腦組織空腔支架。首先，個體特異性的影像學數據能如實提供缺損空腔信息，為精確化支架外部輪廓設計提供便利。常規方法批量生產的均碼生物支架為滿足受體，常存在長了需要截、短了需要接的情況。本研究利用大鼠MRI掃描數據重建空腔三維模型，獲取能使支架與缺損部位較好契合的個體化外部輪廓，可最大限度避免支架植入后的移動或錯位。同時，因3D打印過程是將模型分割成一系列有序的二維層面并在計算機控制下逐層打印制造，所以需要模型內部和外部結構層層連續，否則無法打印出完整空腔支架。本研究中，我們從Mimics軟件獲取的初始模型內部仍存在一些雜質。為此，我們將三維模型導入3D打印軟件Meshmixer中進行后期處理，清除空腔內殘留的血塊并通過減少三角形、光滑表面、邊減少、矩陣減少等方式得到經過面網格優化后的模型。其次，重建技術與CAD相結合，可通過優化支架內部結構更好地達到仿生效果。合適的內部結構有利于氧氣、營養物質與代謝產物的交換，為細胞的大量種植和增殖、細胞外基質的分泌以及血管和神經的內生長提供空間和環境[24]。Wong等[19]針對支架內部結構對大腦皮層損傷修復的影響進行了研究。結果顯示，支架內充分交叉的通道有利于細胞遷移和組織再生。而Domingos研究小組[25]系統分析了支架孔徑大小和幾何形狀對細胞生存能力的影響后指出，大的四邊形孔徑能增強BMSCs的生存力和增殖力。因此，本研究初步探索了在仿生腦組織空腔支架內填充打印正交叉結構的方法，為將來制備模擬細胞外基質的復雜內部結構奠定基礎。
支架材料擁有良好的生物相容性是修復神經損傷的前提，而探尋適合3D生物打印條件的材料是構建復雜支架結構的基礎。膠原蛋白是最豐富的哺乳動物蛋白，具有良好的生物相容性和低抗原性[26]。在嚙齒動物脊髓損傷和腦外傷模型中的體內植入實驗已表明膠原具有橋接神經組織、促進軸突再生和血管生成等功能[27-28]。然而，因膠原蛋白存在機械強度低和降解速度快等缺點，常需與其他材料復合以改善其性能。前期研究發現，帶正電荷的殼聚糖和帶負電荷的膠原蛋白之間可形成離子配合物，從而增強膠原蛋白機械性能并降低其降解率[29]。本研究中，我們將制備好的液態膠原-殼聚糖復合材料灌入打印噴頭，選擇低溫成型模式，調控噴頭“出絲速度”和“走絲速度”兩個關鍵參數，使材料從打印噴頭被高壓擠出后在冷卻平臺上迅速成型。根據前期研究結果，我們選擇采用正交叉結構填充支架內部并成功打印。空腔支架與植入腦組織部位相匹配的力學強度，能為細胞提供合適的微應力環境，并在體內力學微環境中保持結構穩定性和完整性。因此，簡單的正交叉結構仍不能高度仿真神經細胞周圍環境。下一步研究可在測量腦組織彈性模量的基礎上[30]，通過在3D打印過程中調整材料疊加角度、架孔徑和孔隙率等方式，使空腔支架具有與植入腦組織部位相匹配的力學強度。支架材料的降解性也是一個需要考慮的重要因素。支架植入體內后，應隨著新生組織的形成而逐漸溶解，并最終被機體吸收[31]。若降解速率太快，支架三維結構可能崩潰，無法指導細胞的生長和分化；若降解太慢，生物材料的殘留物可能阻礙營養轉移并導致組織壞死[32]。因此，使支架材料降解率與腦組織修復速度相適應十分必要。在此基礎上，還可探索在3D打印過程中添加NGF、定向分化誘導因子等修飾物質。需要指出的是，清除大鼠TBI后血腫形成的空腔可能會因水腫、繼發性出血、軟化灶形成等發生變化，動態觀測大鼠空腔變化以找到支架制備和植入的最佳時間點也是很重要的。以上問題均有待進一步研究。
綜上述，基于MRI數據的三維重建技術和CAD技術獲取腦組織空腔三維模型，以膠原蛋白-殼聚糖復合材料在3D打印機上制備的個性化神經組織工程支架，其外部輪廓與缺損部位形狀相似，內部正交叉結構符合腦皮層修復原則，且生物打印材料能滿足體內移植條件。未來集成生物材料學、細胞生物學、物理學和組織工程學等學科，有望使此技術成為定制空腔支架修復TBI后腦組織空腔的一種新方法。
