引用本文： 馬駿, 張晨, 張二洋, 班文瑞, 呂雷鋒, 黨曉謙, 王坤正. 巨噬細胞移動抑制因子對激素性股骨頭缺血性壞死血管修復影響的體外實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 998-1005. doi: 10.7507/1002-1892.20160202 復制
激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）是骨科常見病、多發病[1]。近年研究發現，SANFH臨床標本中可觀察到嚴重微血管損傷，骨細胞缺血性壞死，新生血管減少，血管修復障礙等病理現象[2-4]。糖皮質激素（glucocorticoids，Glc）誘發的嚴重血管修復障礙會導致股骨頭局部血供持續下降[5-7]，引發成骨-成血管耦聯失調[8]，且骨破壞速度快于骨修復，最終發生股骨頭塌陷以及髖關節病變等[2, 9]。
巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是Glc的生理性拮抗劑[10-11]，大劑量Glc會降低外周血MIF水平[12]。MIF具有細胞因子、趨化因子和血管生成因子等多重特性[13-15]。腫瘤學研究提示MIF能促進血管修復及穩定新生血管[16-19]。動物實驗提示缺氧缺血部位MIF分泌增多，募集血管內皮細胞（endothelial cells，ECs），促進新生血管形成及自我修復[17, 19-20]。
為明確Glc是否通過抑制MIF的表達，影響ECs的行為以及功能，引發SANFH血管修復障礙，本實驗模擬股骨頭壞死缺氧環境下培養ECs，驗證缺氧條件下血管修復加強機制，并予以高濃度地塞米松干預，探究其對上述過程的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
人臍靜脈ECs（human umbilical vein ECs，HU VECs）由西安交通大學前沿科學技術研究院再生醫學和組織工程中心提供，液氮凍存。DMEM培養液、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；AlamarBlue細胞活性檢測試劑、活/死細胞染色試劑盒（Molecular Probes公司，美國）；地塞米松、FITC-鬼筆環肽、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenglindole，DAPI）、戊二醛、MIF抗體、Ⅰ型膠原酶、明膠（Sigma公司，美國）；VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；人VEGF ELISA試劑盒（武漢博士德生物材料有限公司）；人MIF ELISA試劑盒（上海科興生化試劑有限公司）。
倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；低氧細胞培養罐（廣州尤德生物科技有限公司）；細胞培養箱（Thermo Fisher公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養及傳代
取凍存的HUVECs，37℃水浴1 min，完全培養液（含5%FBS及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM）稀釋細胞懸浮液。室溫下，以離心半徑7.5 cm、800 r/min離心3 min；棄上清，用10 mL完全培養液重懸后，接種至直徑為10 cm的無菌培養皿內，置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養，每3天更換1次培養液。待細胞達80%～90%融合后進行傳代。取第3代HUVECs，倒置相差顯微鏡下觀察細胞單層貼壁生長，呈多角形，細胞90%融合時為鋪路石樣，邊界清晰（圖 1）。調整細胞濃度為5.0×104個/ mL，進行后續實驗。
圖1
第3代HUVECs形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）
Figure1.
The morphology observation of the HUVECs at passage 3 (Inverted phase contrast microscope×100)
1.2.2 實驗分組
實驗分為4組，分別為正常對照組（A組）、地塞米松組（B組）、缺氧培養組（C組）及地塞米松+缺氧培養組（D組）。A組：細胞不作任何干預；B組：用含1.0×10-6 mol/L地塞米松的完全培養液干預細胞[21]；C組：細胞在低氧細胞培養罐內培養（氧濃度為5%）；D組：細胞在低氧細胞培養罐內培養（氧濃度為5%），同時用含1.0×10-6 mol/L地塞米松的完全培養液干預。
1.3 觀測指標
1.3.1 AlamarBlue細胞活性檢測
取HUVECs接種于96孔板，每孔100 μL。根據實驗分組進行培養，每組設6個復孔。24 h后移除細胞培養液，更換為檢測液（100 μL完全培養液+10 μL AlamarBlue），培養箱避光孵育4 h，吸取100 μL反應后的液體于黑色96孔板內，酶標儀檢測熒光強度，激發光波長為560 nm，發射光波長為600 nm；熒光強度越高，提示細胞活性越好。分別計算B～D組熒光強度與A組熒光強度的百分比，表示B～D組相對細胞活性。
1.3.2 細胞增殖檢測
取HUVECs同1.3.1方法分組培養24 h后，移除細胞培養液，參照活/死細胞染色試劑盒說明進行操作。倒置熒光顯微鏡下觀察，藍色激發光下活細胞呈綠色，綠色激發光下死細胞呈紅色。于100倍鏡下，每孔隨機取5個視野計數活細胞，取均值。分別計算B～D組活細胞數與A組活細胞數百分比，表示B～D組活細胞相對百分比。
1.3.3 細胞骨架形態觀察
取HUVECs同1.3.1方法分組培養24 h后，移除細胞培養液，PBS清洗3次；2.5%戊二醛室溫固定30 min，PBS清洗3次；加入5 μg/mL FITC-鬼筆環肽工作液，室溫避光孵育90 min，PBS清洗3次；加入14 μmol/L DAPI工作液，室溫避光孵育10 min。倒置熒光顯微鏡下觀察，藍色激發光下細胞骨架結構呈綠色，紫外激發光下細胞核呈藍色。
1.3.4 細胞遷徙能力檢測
取HUVECs接種于6孔板，每孔2 mL。按照實驗分組進行培養，每組設3個復孔。培養12 h后完全貼壁，用移液槍連接10 μL槍頭，垂直于培養板劃線。PBS清洗3次移除漂浮的細胞。每孔添加2 mL無血清DMEM培養液，分別在劃線后0、24、36 h觀察細胞遷移情況。
1.3.5 ELISA檢測細胞MIF及VEGF表達水平
取HUVECs同1.3.1方法分組培養，于0、0.5、1、1.5、2、8、24 h分別收集各組細胞培養上清液，根據人VEGF、MIF ELISA試劑盒說明進行操作，酶標儀于波長450 nm處測量，通過標準曲線計算樣品中MIF和VEGF濃度。記錄各組0、1、8、24 h VEGF、MIF累積濃度；計算不同時間段的階段濃度，包括干預培養24 h內0～1、1～8、8～24 h時間段，以及培養2 h內0～0.5、0.5～1、1～1.5、1.5～2 h時間段，階段濃度為各時間點間濃度差值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 AlamarBlue細胞活性檢測
B、C、D組相對細胞活性分別為155.2%±12.9%、93.4%±15.2%、75.2%±6.7%。其中，B組相對細胞活性顯著高于C、D組，C組高于D組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.2 細胞增殖檢測
鏡下觀察，A組細胞增殖活性好，活細胞較多；B組細胞增殖活性較A組稍低，細胞體積較大；C組細胞增殖活性高于A、B組，活細胞數量及比例均高于其他組；D組細胞增殖活性明顯低于其他組，死細胞多。見圖 2。
圖2
各組活/死細胞染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）???A組???B組???C組???D組??圖 3?各組細胞骨架形態觀察（倒置熒光顯微鏡×200）???A組???B組???C組???D組??圖 4?各組劃線后0、24、36 h細胞遷徙觀察從左至右分別為A、B、C、D組???0 h???24 h???36 h
Figure2.
The viability of HUVECs by live/dead cell staining (Inverted fluorescence microscope×100)???Group A???Group B???Group C???Group D ?Fig.3 The cytoskeleton morphology of HUVECs in each group (Inverted fluorescence microscope×200)???Group A???Group B???Group C???Group D ?Fig.4 The cells migration in each group at immediate, 24, and 36 hours after scratch From left to right: group A, group B, group C, and group D???At immediate???At 24 hours???At 36 hours
B、C、D組活細胞相對百分比分別為90.4%±10.7%、132.3%±11.2%、71.9%±5.6%；C組顯著高于B、D組，B組高于D組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 細胞骨架形態觀察
鏡下見，A組細胞形態正常，大小均勻，骨架形態均質性好，增殖狀況良好，細胞質中偶見分泌顆粒。B組細胞形態正常，但細胞體積較A組增大，少量細胞融合，細胞骨架基本正常，少見偽足形成，細胞質較清亮，少量異形細胞核。C組細胞大量增殖，細胞接觸增多，細胞骨架呈強陽性染色，多數細胞具有偽足結構，多數細胞內見大量分泌顆粒。D組細胞形態異常，細胞大小不等，均質性差，細胞骨架染色不均勻，基本無偽足形成，可見細胞融合，細胞質少，可見部分細胞核形態異常。見圖 3。
2.4 細胞遷徙能力檢測
A組細胞劃線后24 h內遷徙速度正常，24 h時劃痕仍然可見，36 h時部分劃痕消失。B組24 h內細胞遷徙能力較低，36 h時劃痕仍存在，且劃痕較寬。C組24 h內細胞遷移能力最強，24 h時已有部分細胞接觸，36 h時劃痕完全消失。D組24 h內細胞遷移能力最低，36 h時劃痕寬度與B組無明顯差異。見圖 4。
2.5 ELISA檢測細胞MIF及VEGF表達水平
2.5.1 MIF表達
各組MIF累積濃度隨時間延長呈上升趨勢，組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。0、1、8、24 h時C組MIF累積濃度均顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。0 h時，A、B、D組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。1 h時，A組與B、D組間比較差異有統計學意義（P < 0.05），B、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）。8、24 h時，A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
干預培養0、1、8、24 h各組MIF累積濃度??圖 6?干預培養24 h內不同時間段MIF階段濃度??圖 7?干預培養2 h內不同時間段MIF階段濃度??圖 8?干預培養0、1、8、24 h各組VEGF累積濃度??圖 9?干預培養24 h內不同時間段VEGF階段濃度??圖 10?干預培養2 h內不同時間段VEGF階段濃度
Figure5.
Accumulated concentration of MIF in 4 groups at immediate, 1, 8, and 24 hours after treatment ?Fig.6 The stage concentration of MIF in 4 groups within 24 hours after treatment ?Fig.7 The stage concentration of MIF in 4 groups within 2 hours after treatment ?Fig.8 Accumulated concentration of VEGF in 4 groups at immediate, 1, 8, and 24 hours after treatment ?Fig.9 The stage concentration of VEGF in 4 groups within 24 hours after treatment ?Fig.10 The stage concentration of VEGF in 4 groups within 2 hours after treatment
干預培養24 h內，0～1 h時各組MIF階段濃度最高，1～8 h時顯著降低，8～24 h再增高，但未達0～1 h時水平；各組1～8 h時MIF階段濃度顯著低于0～1 h及8～24 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05），0～1 h與8～24 h間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。0～1 h和8～24 h時，C組MIF階段濃度顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；1～8 h時，C組雖仍高于其他各組，但比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6。
干預培養2 h內，各組MIF階段濃度逐漸增加，于0.5～1 h達峰值，之后逐漸降低；其中A、C、D組組內0.5～1 h時MIF階段濃度顯著高于其他各時間段，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；其他各時間段間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。B組組內0.5～1 h時MIF階段濃度顯著高于其他各時間段，0～0.5 h高于1.5～2 h，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其他各時間段比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。0～0.5 h和0.5～1 h時，C組MIF階段濃度均顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余時間段C組雖高于其他各組，但比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 7。
2.5.2 VEGF表達
各組VEGF累積濃度隨時間延長，呈逐漸增加趨勢；其中24 h時VEGF累積濃度顯著高于0、1、8 h時，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；0、1、8 h間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。0 h時，C組VEGF累積濃度低于B、D組，差異有統計學意義（P < 0.05），與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05)；1 h時，C組與其余各組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；8、24 h時，C組顯著高于其他各組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。除0 h時A組與B、D組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）外，其余各時間點A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 8。
干預培養24 h內，各組VEGF階段濃度呈逐漸增加趨勢，其中C、D組8～24 h時VEGF階段濃度顯著高于0～1、1～8 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；0～1 h與1～8 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。A組0～1 h時VEGF階段濃度低于8～24 h時，差異具有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；B組各時間段VEGF階段濃度比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。各時間段，C組VEGF階段濃度均高于其他各組，其中1～8、8～24 h時比較差異有統計學意義（P < 0.05）；各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 9。
干預培養2 h內，A、B、C、D組組內各時間段間以及各組間VEGF階段濃度比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 10。
3 討論
有關激素導致SANFH的作用機制目前尚未明確，學者們提出了脂肪栓塞學說、血管內凝血學說、骨內高壓理論學說、骨質疏松學說、免疫紊亂學說等[22-24]。嚴重微血管損傷、新生血管減少、血管修復障礙是激素性骨壞死發病過程中常見的病理現象。血管修復過程由成血管因子與血管抑素共同調控[25]，氧分子在此過程中的作用至關重要。細胞對缺氧的反應過程主要由低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）家族調控，HIF上調大量基因轉錄，其中包括MIF基因，HIF能強力誘導VEGF生成[26]。后者是血管化過程中的主要內皮細胞生長因子以及血管化的誘導劑。本實驗結果提示，缺氧條件下HUVECs增殖能力、細胞活性明顯增強。細胞多有偽足伸出，可見大量分泌顆粒。劃痕實驗結果也提示，缺氧培養后HUVECs的遷徙能力顯著增高，細胞遷徙能力越強，其向缺血缺氧部位移動的能力越強。ECs分泌的細胞因子是形成新生血管及調控ECs生物學功能的重要成分。自分泌/旁分泌細胞因子是重要的細胞間通訊方式[27]，缺氧條件下ECs分泌功能增強，MIF以及VEGF表達增高，會同時作用自身以及其他細胞，形成正反饋機制。
目前，有關Glc對ECs的影響研究結果不一致。有學者認為在骨壞死疾病中Glc可以誘導ECs的凋亡、壞死[6]，還有研究提示Glc可以保護ECs免受內毒素的破壞[28]。本實驗中使用高濃度地塞米松干預培養ECs，超過成骨細胞分化所需濃度。檢測結果顯示，地塞米松干預培養后，ECs增殖能力與正常細胞基本一致，細胞分泌功能相近，但細胞遷徙能力較低。提示高濃度Glc對ECs無誘導凋亡或者直接致死作用，對其增殖能力無顯著影響，但可能會抑制細胞遷徙能力。
但是Glc會抑制缺氧條件下ECs的代償反應。在缺氧條件下并經地塞米松干預后，細胞活性明顯下降，活細胞數減少，鏡下可見大量死亡細胞，細胞遷徙能力顯著降低，MIF、VEGF表達降低。分析原因可能為：①高濃度Glc對MIF表達的抑制作用，導致MIF及其下游產物VEGF的表達下調，進而影響細胞增殖和遷徙；②ECs數目減少和活性降低；③Glc抑制ECs自分泌/旁分泌功能，細胞間協同效應降低；④上述過程形成惡性循環機制。結合單純地塞米松干預組結果分析，我們認為Glc對MIF表達的直接抑制占主要作用。
MIF在缺氧刺激后的表達水平具有雙峰型特點，與文獻報道一致[29]。缺氧刺激后MIF的首個分泌高峰考慮是由于細胞質內儲存的MIF蛋白以胞吐形式大量分泌至細胞間質[30]，第2個分泌高峰是MIF相關基因大量轉錄及表達的結果。VEGF的分泌高峰落后于MIF的出現，提示VEGF為MIF的下游產物，但需進一步實驗驗證。
綜上述，缺氧環境下ECs增殖及遷徙能力增強，MIF分泌增加，該變化可被高濃度地塞米松抑制，后者直接抑制MIF的分泌，減少ECs通過自分泌/旁分泌機制獲取足量MIF，導致細胞增殖及遷徙能力下降。但由于本實驗缺乏SANFH模型動物或者臨床患者來源的ECs作為研究對象，實驗細胞在細胞行為學上擬合度欠佳，所得結論需要進一步干預實驗驗證；另外，Glc對MIF表達調控的具體生物信息仍需進一步研究。
激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）是骨科常見病、多發病[1]。近年研究發現，SANFH臨床標本中可觀察到嚴重微血管損傷，骨細胞缺血性壞死，新生血管減少，血管修復障礙等病理現象[2-4]。糖皮質激素（glucocorticoids，Glc）誘發的嚴重血管修復障礙會導致股骨頭局部血供持續下降[5-7]，引發成骨-成血管耦聯失調[8]，且骨破壞速度快于骨修復，最終發生股骨頭塌陷以及髖關節病變等[2, 9]。
巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是Glc的生理性拮抗劑[10-11]，大劑量Glc會降低外周血MIF水平[12]。MIF具有細胞因子、趨化因子和血管生成因子等多重特性[13-15]。腫瘤學研究提示MIF能促進血管修復及穩定新生血管[16-19]。動物實驗提示缺氧缺血部位MIF分泌增多，募集血管內皮細胞（endothelial cells，ECs），促進新生血管形成及自我修復[17, 19-20]。
為明確Glc是否通過抑制MIF的表達，影響ECs的行為以及功能，引發SANFH血管修復障礙，本實驗模擬股骨頭壞死缺氧環境下培養ECs，驗證缺氧條件下血管修復加強機制，并予以高濃度地塞米松干預，探究其對上述過程的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
人臍靜脈ECs（human umbilical vein ECs，HU VECs）由西安交通大學前沿科學技術研究院再生醫學和組織工程中心提供，液氮凍存。DMEM培養液、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；AlamarBlue細胞活性檢測試劑、活/死細胞染色試劑盒（Molecular Probes公司，美國）；地塞米松、FITC-鬼筆環肽、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenglindole，DAPI）、戊二醛、MIF抗體、Ⅰ型膠原酶、明膠（Sigma公司，美國）；VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；人VEGF ELISA試劑盒（武漢博士德生物材料有限公司）；人MIF ELISA試劑盒（上海科興生化試劑有限公司）。
倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；低氧細胞培養罐（廣州尤德生物科技有限公司）；細胞培養箱（Thermo Fisher公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養及傳代
取凍存的HUVECs，37℃水浴1 min，完全培養液（含5%FBS及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM）稀釋細胞懸浮液。室溫下，以離心半徑7.5 cm、800 r/min離心3 min；棄上清，用10 mL完全培養液重懸后，接種至直徑為10 cm的無菌培養皿內，置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養，每3天更換1次培養液。待細胞達80%～90%融合后進行傳代。取第3代HUVECs，倒置相差顯微鏡下觀察細胞單層貼壁生長，呈多角形，細胞90%融合時為鋪路石樣，邊界清晰（圖 1）。調整細胞濃度為5.0×104個/ mL，進行后續實驗。
圖1
第3代HUVECs形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）
Figure1.
The morphology observation of the HUVECs at passage 3 (Inverted phase contrast microscope×100)
1.2.2 實驗分組
實驗分為4組，分別為正常對照組（A組）、地塞米松組（B組）、缺氧培養組（C組）及地塞米松+缺氧培養組（D組）。A組：細胞不作任何干預；B組：用含1.0×10-6 mol/L地塞米松的完全培養液干預細胞[21]；C組：細胞在低氧細胞培養罐內培養（氧濃度為5%）；D組：細胞在低氧細胞培養罐內培養（氧濃度為5%），同時用含1.0×10-6 mol/L地塞米松的完全培養液干預。
1.3 觀測指標
1.3.1 AlamarBlue細胞活性檢測
取HUVECs接種于96孔板，每孔100 μL。根據實驗分組進行培養，每組設6個復孔。24 h后移除細胞培養液，更換為檢測液（100 μL完全培養液+10 μL AlamarBlue），培養箱避光孵育4 h，吸取100 μL反應后的液體于黑色96孔板內，酶標儀檢測熒光強度，激發光波長為560 nm，發射光波長為600 nm；熒光強度越高，提示細胞活性越好。分別計算B～D組熒光強度與A組熒光強度的百分比，表示B～D組相對細胞活性。
1.3.2 細胞增殖檢測
取HUVECs同1.3.1方法分組培養24 h后，移除細胞培養液，參照活/死細胞染色試劑盒說明進行操作。倒置熒光顯微鏡下觀察，藍色激發光下活細胞呈綠色，綠色激發光下死細胞呈紅色。于100倍鏡下，每孔隨機取5個視野計數活細胞，取均值。分別計算B～D組活細胞數與A組活細胞數百分比，表示B～D組活細胞相對百分比。
1.3.3 細胞骨架形態觀察
取HUVECs同1.3.1方法分組培養24 h后，移除細胞培養液，PBS清洗3次；2.5%戊二醛室溫固定30 min，PBS清洗3次；加入5 μg/mL FITC-鬼筆環肽工作液，室溫避光孵育90 min，PBS清洗3次；加入14 μmol/L DAPI工作液，室溫避光孵育10 min。倒置熒光顯微鏡下觀察，藍色激發光下細胞骨架結構呈綠色，紫外激發光下細胞核呈藍色。
1.3.4 細胞遷徙能力檢測
取HUVECs接種于6孔板，每孔2 mL。按照實驗分組進行培養，每組設3個復孔。培養12 h后完全貼壁，用移液槍連接10 μL槍頭，垂直于培養板劃線。PBS清洗3次移除漂浮的細胞。每孔添加2 mL無血清DMEM培養液，分別在劃線后0、24、36 h觀察細胞遷移情況。
1.3.5 ELISA檢測細胞MIF及VEGF表達水平
取HUVECs同1.3.1方法分組培養，于0、0.5、1、1.5、2、8、24 h分別收集各組細胞培養上清液，根據人VEGF、MIF ELISA試劑盒說明進行操作，酶標儀于波長450 nm處測量，通過標準曲線計算樣品中MIF和VEGF濃度。記錄各組0、1、8、24 h VEGF、MIF累積濃度；計算不同時間段的階段濃度，包括干預培養24 h內0～1、1～8、8～24 h時間段，以及培養2 h內0～0.5、0.5～1、1～1.5、1.5～2 h時間段，階段濃度為各時間點間濃度差值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 AlamarBlue細胞活性檢測
B、C、D組相對細胞活性分別為155.2%±12.9%、93.4%±15.2%、75.2%±6.7%。其中，B組相對細胞活性顯著高于C、D組，C組高于D組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.2 細胞增殖檢測
鏡下觀察，A組細胞增殖活性好，活細胞較多；B組細胞增殖活性較A組稍低，細胞體積較大；C組細胞增殖活性高于A、B組，活細胞數量及比例均高于其他組；D組細胞增殖活性明顯低于其他組，死細胞多。見圖 2。
圖2
各組活/死細胞染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）???A組???B組???C組???D組??圖 3?各組細胞骨架形態觀察（倒置熒光顯微鏡×200）???A組???B組???C組???D組??圖 4?各組劃線后0、24、36 h細胞遷徙觀察從左至右分別為A、B、C、D組???0 h???24 h???36 h
Figure2.
The viability of HUVECs by live/dead cell staining (Inverted fluorescence microscope×100)???Group A???Group B???Group C???Group D ?Fig.3 The cytoskeleton morphology of HUVECs in each group (Inverted fluorescence microscope×200)???Group A???Group B???Group C???Group D ?Fig.4 The cells migration in each group at immediate, 24, and 36 hours after scratch From left to right: group A, group B, group C, and group D???At immediate???At 24 hours???At 36 hours
B、C、D組活細胞相對百分比分別為90.4%±10.7%、132.3%±11.2%、71.9%±5.6%；C組顯著高于B、D組，B組高于D組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 細胞骨架形態觀察
鏡下見，A組細胞形態正常，大小均勻，骨架形態均質性好，增殖狀況良好，細胞質中偶見分泌顆粒。B組細胞形態正常，但細胞體積較A組增大，少量細胞融合，細胞骨架基本正常，少見偽足形成，細胞質較清亮，少量異形細胞核。C組細胞大量增殖，細胞接觸增多，細胞骨架呈強陽性染色，多數細胞具有偽足結構，多數細胞內見大量分泌顆粒。D組細胞形態異常，細胞大小不等，均質性差，細胞骨架染色不均勻，基本無偽足形成，可見細胞融合，細胞質少，可見部分細胞核形態異常。見圖 3。
2.4 細胞遷徙能力檢測
A組細胞劃線后24 h內遷徙速度正常，24 h時劃痕仍然可見，36 h時部分劃痕消失。B組24 h內細胞遷徙能力較低，36 h時劃痕仍存在，且劃痕較寬。C組24 h內細胞遷移能力最強，24 h時已有部分細胞接觸，36 h時劃痕完全消失。D組24 h內細胞遷移能力最低，36 h時劃痕寬度與B組無明顯差異。見圖 4。
2.5 ELISA檢測細胞MIF及VEGF表達水平
2.5.1 MIF表達
各組MIF累積濃度隨時間延長呈上升趨勢，組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。0、1、8、24 h時C組MIF累積濃度均顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。0 h時，A、B、D組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。1 h時，A組與B、D組間比較差異有統計學意義（P < 0.05），B、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）。8、24 h時，A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
干預培養0、1、8、24 h各組MIF累積濃度??圖 6?干預培養24 h內不同時間段MIF階段濃度??圖 7?干預培養2 h內不同時間段MIF階段濃度??圖 8?干預培養0、1、8、24 h各組VEGF累積濃度??圖 9?干預培養24 h內不同時間段VEGF階段濃度??圖 10?干預培養2 h內不同時間段VEGF階段濃度
Figure5.
Accumulated concentration of MIF in 4 groups at immediate, 1, 8, and 24 hours after treatment ?Fig.6 The stage concentration of MIF in 4 groups within 24 hours after treatment ?Fig.7 The stage concentration of MIF in 4 groups within 2 hours after treatment ?Fig.8 Accumulated concentration of VEGF in 4 groups at immediate, 1, 8, and 24 hours after treatment ?Fig.9 The stage concentration of VEGF in 4 groups within 24 hours after treatment ?Fig.10 The stage concentration of VEGF in 4 groups within 2 hours after treatment
干預培養24 h內，0～1 h時各組MIF階段濃度最高，1～8 h時顯著降低，8～24 h再增高，但未達0～1 h時水平；各組1～8 h時MIF階段濃度顯著低于0～1 h及8～24 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05），0～1 h與8～24 h間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。0～1 h和8～24 h時，C組MIF階段濃度顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；1～8 h時，C組雖仍高于其他各組，但比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6。
干預培養2 h內，各組MIF階段濃度逐漸增加，于0.5～1 h達峰值，之后逐漸降低；其中A、C、D組組內0.5～1 h時MIF階段濃度顯著高于其他各時間段，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；其他各時間段間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。B組組內0.5～1 h時MIF階段濃度顯著高于其他各時間段，0～0.5 h高于1.5～2 h，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其他各時間段比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。0～0.5 h和0.5～1 h時，C組MIF階段濃度均顯著高于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余時間段C組雖高于其他各組，但比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 7。
2.5.2 VEGF表達
各組VEGF累積濃度隨時間延長，呈逐漸增加趨勢；其中24 h時VEGF累積濃度顯著高于0、1、8 h時，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；0、1、8 h間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。0 h時，C組VEGF累積濃度低于B、D組，差異有統計學意義（P < 0.05），與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05)；1 h時，C組與其余各組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；8、24 h時，C組顯著高于其他各組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。除0 h時A組與B、D組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）外，其余各時間點A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 8。
干預培養24 h內，各組VEGF階段濃度呈逐漸增加趨勢，其中C、D組8～24 h時VEGF階段濃度顯著高于0～1、1～8 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；0～1 h與1～8 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。A組0～1 h時VEGF階段濃度低于8～24 h時，差異具有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；B組各時間段VEGF階段濃度比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。各時間段，C組VEGF階段濃度均高于其他各組，其中1～8、8～24 h時比較差異有統計學意義（P < 0.05）；各時間段A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 9。
干預培養2 h內，A、B、C、D組組內各時間段間以及各組間VEGF階段濃度比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 10。
3 討論
有關激素導致SANFH的作用機制目前尚未明確，學者們提出了脂肪栓塞學說、血管內凝血學說、骨內高壓理論學說、骨質疏松學說、免疫紊亂學說等[22-24]。嚴重微血管損傷、新生血管減少、血管修復障礙是激素性骨壞死發病過程中常見的病理現象。血管修復過程由成血管因子與血管抑素共同調控[25]，氧分子在此過程中的作用至關重要。細胞對缺氧的反應過程主要由低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）家族調控，HIF上調大量基因轉錄，其中包括MIF基因，HIF能強力誘導VEGF生成[26]。后者是血管化過程中的主要內皮細胞生長因子以及血管化的誘導劑。本實驗結果提示，缺氧條件下HUVECs增殖能力、細胞活性明顯增強。細胞多有偽足伸出，可見大量分泌顆粒。劃痕實驗結果也提示，缺氧培養后HUVECs的遷徙能力顯著增高，細胞遷徙能力越強，其向缺血缺氧部位移動的能力越強。ECs分泌的細胞因子是形成新生血管及調控ECs生物學功能的重要成分。自分泌/旁分泌細胞因子是重要的細胞間通訊方式[27]，缺氧條件下ECs分泌功能增強，MIF以及VEGF表達增高，會同時作用自身以及其他細胞，形成正反饋機制。
目前，有關Glc對ECs的影響研究結果不一致。有學者認為在骨壞死疾病中Glc可以誘導ECs的凋亡、壞死[6]，還有研究提示Glc可以保護ECs免受內毒素的破壞[28]。本實驗中使用高濃度地塞米松干預培養ECs，超過成骨細胞分化所需濃度。檢測結果顯示，地塞米松干預培養后，ECs增殖能力與正常細胞基本一致，細胞分泌功能相近，但細胞遷徙能力較低。提示高濃度Glc對ECs無誘導凋亡或者直接致死作用，對其增殖能力無顯著影響，但可能會抑制細胞遷徙能力。
但是Glc會抑制缺氧條件下ECs的代償反應。在缺氧條件下并經地塞米松干預后，細胞活性明顯下降，活細胞數減少，鏡下可見大量死亡細胞，細胞遷徙能力顯著降低，MIF、VEGF表達降低。分析原因可能為：①高濃度Glc對MIF表達的抑制作用，導致MIF及其下游產物VEGF的表達下調，進而影響細胞增殖和遷徙；②ECs數目減少和活性降低；③Glc抑制ECs自分泌/旁分泌功能，細胞間協同效應降低；④上述過程形成惡性循環機制。結合單純地塞米松干預組結果分析，我們認為Glc對MIF表達的直接抑制占主要作用。
MIF在缺氧刺激后的表達水平具有雙峰型特點，與文獻報道一致[29]。缺氧刺激后MIF的首個分泌高峰考慮是由于細胞質內儲存的MIF蛋白以胞吐形式大量分泌至細胞間質[30]，第2個分泌高峰是MIF相關基因大量轉錄及表達的結果。VEGF的分泌高峰落后于MIF的出現，提示VEGF為MIF的下游產物，但需進一步實驗驗證。
綜上述，缺氧環境下ECs增殖及遷徙能力增強，MIF分泌增加，該變化可被高濃度地塞米松抑制，后者直接抑制MIF的分泌，減少ECs通過自分泌/旁分泌機制獲取足量MIF，導致細胞增殖及遷徙能力下降。但由于本實驗缺乏SANFH模型動物或者臨床患者來源的ECs作為研究對象，實驗細胞在細胞行為學上擬合度欠佳，所得結論需要進一步干預實驗驗證；另外，Glc對MIF表達調控的具體生物信息仍需進一步研究。
