引用本文： 徐良, 劉璠, 朱建煒, 朱立帆, 蔣富貴. 胞漿泛素蛋白連接酶2在大鼠脊髓損傷后星形膠質細胞中的表達及意義. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 978-985. doi: 10.7507/1002-1892.20150211 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的治療一直是醫學界難題。SCI包括原發性和繼發性兩種損傷機制[1]，后者可導致損傷部位膠質細胞反應性增生形成膠質瘢痕，局部微環境破壞，從而不利于軸突再生，損傷髓鞘無法修復，最終導致傷后功能恢復困難[2-3]。如何調控星形膠質細胞的激活增殖成為研究熱點[4-5]。有研究表明，SCI的病理生理過程離不開細胞周期機制的調控[6]。在細胞周期調節過程中，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin depedent kinase，CDK）和CDK抑制劑（CDK inhibitor，CDKI）通過相互作用來調控細胞周期進展。作為CDKI家族的主要成員之一，最令人注目的是p27kip1分子，它參與調節了神經發生的多個方面[7-8]。p27kip1表達量對機體功能維持發揮著至關重要的作用，其表達量的調節主要依賴于一些相關蛋白介導的泛素化降解機制。胞漿泛素蛋白連接酶2 （Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2，KPC2）是UBL-UBA蛋白家族成員之一，能夠與另一催化亞基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白連接酶復合體，NH2端的UBA結構域可結合多聚范素化蛋白，從而介導p27kip1在細胞G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平[9-11]。有研究表明，p27kip1和KPC1參與SCI修復過程的調節[12]。那么在SCI后KPC2的表達情況如何，KPC2是否參與SCI后膠質細胞活化增殖的調控，目前尚缺乏相關研究。本研究通過建立SD大鼠脊髓撞擊損傷和體外培養星形膠質細胞增殖模型，觀察KPC2在星形膠質細胞中的分布和表 達變 化，為探討SCI的修復機制提供新的分子基 礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年SD大鼠56只，雌雄不限，體重200～230 g；新生24 h內SD大鼠14只，體重5～6 g；均購于南通醫學院實驗動物中心。
抗p27kip1、抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、抗GAPDH抗體（Santa Cruz公司，美國）；抗KPC1、KPC2抗體（Abcam公司，美國）；抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶復合物液（上海源葉生物科技有限公司）；抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體（Cell-Signalling公司，美國）；抗神經元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體（Chemicon公司，美國）。低溫冷凍離心機（Beckman公司，美國）；電泳儀（上海西巴斯生物技術開發有限公司）；紫外分光光度儀（Eppendorf公司，德國）；熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；圖像分析系統（Syngene公司，英國）。
1.2 大鼠SCI模型制備及實驗方法
1.2.1 實驗分組及大鼠SCI模型制備
將成年SD大鼠隨機分為2組，對照組7只，實驗組49只。大鼠以水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取俯臥位，以T9為中心常規背部皮膚脫毛、消毒，對照組僅行單純T9椎板全切除術，保證硬脊膜完整；實驗組將顯露的T9脊髓用打擊器撞擊（10 g×10 cm），鼠尾痙攣性擺動、雙下肢回縮撲動后肢癱瘓提示造模成功。再次消毒后逐層縫合皮膚。傷后每天定時給予3次人工膀胱排尿，必要時人工排便。實驗組于傷后6、12 h及1、3、5、7、14 d分別取7只大鼠進行以下檢測。
1.2.2 Western
blot檢測 分別取對照組和各時間點實驗組大鼠（n=4），以SCI處為中心切取長約1 cm脊髓，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，4℃以離心半徑6 cm、10 000 r/min離心30 min，取上清用紫外分光光度儀測定蛋白含量，按蛋白量∶2×SDS上樣緩沖液∶二硫蘇糖醇為4∶1∶5比例處理蛋白，沸水煮5 min后行PAGE凝膠電泳；電泳結束后行濕式電轉移，轉移后的聚偏氟乙烯膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，然后用抗p27kip1、KPC2、PCNA和細胞周期蛋白A（CyclinA）抗體室溫封閉1 h后，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗，最后暗房膠片顯影。以目的條帶與內參GAPDH（1∶2 000）的平均吸光度（A）值比值表示相對表達量進行半定量分析。實驗組取KPC2表達最高的時間點取材進行免疫組織化學和免疫熒光雙標記染色檢測。
1.2.3 免疫組織化學染色觀察
取對照組和實驗組KPC2表達最高時間點大鼠（n=3），同上法麻醉后仰臥位固定，打開胸廓，自左心室插管，切開右心房，生理鹽水200 mL、4%多聚甲醛約500 mL灌注固定30 min，冰盒上打開椎管，暴露脊髓，以損傷處為中心切取兩側各約5 mm脊髓組織，常規脫水后，OCT包埋劑包埋，行冠狀面連續冰凍切片，厚10 μm。兩組選取3張切片，加10%驢血清封閉液室溫封閉2 h；去封閉液，加兔抗KPC2一抗（1∶100）4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌3次后加生物素偶聯試劑偶聯的驢抗兔二抗，37℃孵育2 h；PBS洗滌，滴加抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶復合物液37℃孵育40 min，PBS洗滌3次后DAB顯色，常規梯度脫水、透明，封片吹干后熒光顯微鏡觀察。鏡下于10 mm×10 mm視野下計數KPC2陽性細胞數。采用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。
1.2.4 免疫熒光雙標記染色觀察
兩組各取上述切片3張，10%驢血清封閉液室溫2 h封閉非特異性位點。去封閉液，加一抗[KPC2（1∶100），NeuN（1∶600），PCNA（1∶500），GFAP（1∶500）]，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，暗室加CY2和CY3標記的熒光二抗，避光室溫孵育2 h，PBS洗滌后碳酸鹽緩沖甘油封片，暗室內熒光顯微鏡觀察，于10 mm×10 mm視野內計數陽性細胞數。采用同濃度PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 體外星形膠質細胞增殖模型制備及實驗方法
1.3.1 新生大鼠脊髓星形膠質細胞分離、培養及傳代
取新生24 h內SD大鼠，參照McCarthy等[13]方法并進行改進分離培養星形膠質細胞。將大鼠于75%乙醇中浸泡1 min后，無菌條件下取其脊髓，置冰浴D-Hank液中，分離、剪碎脊髓組織；置離心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶37℃下消化15 min；用DMEM基礎培養基終止消化，過200目篩網，1 200 r/min離心5 min；棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基輕柔吹打制成細胞懸液，調節細胞密度為5×105個/cm2，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。每3天半量換液1次，9～10 d后細胞已基本融合。將培養瓶置于37℃恒溫旋轉搖床，200 r/min、20 h；更換新的含10%FBS的DMEM/F12培養基，以除去生長在星形膠質細胞上層的小膠質細胞和少突細胞。D-Hank液清洗3次，進行傳代培養即得到純化的星形膠質細胞。使用血清饑餓48 h療法使細胞同步在G0/G1期，隨后加入新生小牛血清刺激細胞增殖，模擬體內星形膠質細胞受損傷后增殖條件；以未加入血清為對照組。收獲對照組及實驗組刺激各時間點（1、3、6、12、24、48 h）培養細胞，加入適量細胞裂解緩沖液，提取細胞蛋白進行以下分析。
1.3.2 星形膠質細胞純度檢測
未行血清饑餓療法前，取體外培養純化的星形膠質細胞，以5×104 個 / mL密度接種于10 mm×10 mm小圓蓋玻片上，3 d后PBS洗滌細胞玻片，4%多聚甲醛固定1 h后，以正常兔血清室溫封閉1 h，加入抗GFAP（1∶800）單克隆抗體，等量抗體稀釋液作對照，4℃孵育過夜，FITC標記的熒光二抗孵育 1 h，Hoechst染核30 min，暗室內熒光顯微鏡下觀察。鏡下于10 mm×10 mm視野下計數GFAP陽性細胞數。
1.3.3 Western
blot檢測及免疫共沉淀分析 取各組各時間點細胞，按1.2.2蛋白處理方法裂解細胞，取部分細胞裂解后上清液行Western blot檢測。剩余細胞裂解液中加入1～2 μg KPC2、KPC1、p27kip1抗體，4℃搖床孵育過夜，加入經預處理的10 μL Protein A瓊脂糖珠，4℃搖床2～4 h，使抗體與Protein A瓊脂糖珠耦聯；免疫沉淀反應后，4℃以離心半徑6 cm、1 200 r/min離心3 min，將Protein A瓊脂糖珠離心至管底；去上清液，Protein A瓊脂糖珠用裂解緩沖液洗3次，最后加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心取上清，SDS-PAGE凝膠電泳行免疫共沉淀。
1.4 統計學方法
采用SPSS11.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 KPC2在大鼠SCI過程中的表達
2.1.1 Western
blot檢測 與對照組比較，實驗組p27kip1表達量在損傷后即開始降低，3 d時降至最低，之后逐漸升高，14 d時恢復至對照組水平；實驗組KPC2、CyclinA及PCNA表達量在損傷后即開始增加，3 d達峰值，之后緩慢下降，14 d時PCNA表達量仍維持較高水平。實驗組損傷后3、5、7 d p27kip1、KPC2、CyclinA及PCNA表達量與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1、表 1。
圖1
Western blot檢測兩組各時間點各蛋白表達 1：對照組 2：實驗組6 h 3：實驗組12 h 4：實驗組1 d 5：實驗組3 d 6：實驗組5 d 7：實驗組7 d 8：實驗組14 d ? ?
表1
Western blot檢測對照組、實驗組SCI過程中各時間點各蛋白表達（n=4，2.1.2 免疫組織化學染色觀察
低倍鏡下發現兩組KPC2陽性信號廣泛分布，包括脊髓灰質和白質。高倍鏡下觀察到對照組KPC2陽性信號較弱；而實驗組SCI后3 d KPC2陽性細胞數量及陽性信號強度均明顯增加（圖 2），陽性細胞數為（320.40±34.20）個 /視野，顯著高于對照組的（145.67±24.55）個/視野，差異有統計學意義（t=10.982，P=0.000）。
2.1.3 免疫熒光雙標記染色觀察
在脊髓灰質，兩組KPC2與NeuN標記的神經元均有共定位；對照組和實驗組KPC2與NeuN雙標記陽性細胞數分別為（0.43±0.53）、（0.57±0.53）個/視野，比較差異無統計學意義（t=0.548，P=0.604）。在脊髓白質，兩組KPC2與GFAP標記的星形膠質細胞共定位明顯，并且實驗組較對照組細胞形態有所改變，且陽性信號細胞數量（3.86±0.90）個/視野較對照組（0.71±0.49） 個/視野明顯增加，差異有統計學意義（t=7.778，P=0.000）。在脊髓白質，兩組KPC2與PCNA標記的星形膠質細胞共定位明顯，且實驗組陽性細胞數（5.57±1.13）個/視野較對照組（0.57±0.53）個/視野明顯增加，差異有統計學意義（t=8.101，P=0.000）。見圖 3。
圖3
兩組免疫熒光雙標記染色觀察（熒光顯微鏡×400） ? 實驗組KPC2 ? 實驗組NeuN ? 實驗組KPC2/NeuN合圖 ? 對照組KPC2/NeuN合圖 ? 實驗組KPC2 ? 實驗組GFAP ? 實驗組KPC2/GFAP合圖 ? 對照組KPC2/GFAP合圖 ? 實驗組KPC2 ? 實驗組PCNA ? 實驗組KPC2/PCNA合圖 ? 對照組KPC2/PCNA合圖 ? ?2.2 KPC2在體外培養星形膠質細胞中的表達
熒光細胞化學分析法檢測示，分離純化的星形膠質細胞純度達98.5%（圖 4）。提取細胞蛋白行Western blot檢測示，PCNA和KPC2蛋白表達在血清刺激增殖后即開始增加，24 h達峰值，而p27kip1表達則逐漸減少（圖 5）。免疫共沉淀分析示，KPC2可沉淀p27kip1、KPC1，p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1，且在刺激后相互作用明顯增加（圖 6）。
圖5
Western blot檢測體外培養星形膠質細胞增殖模型中各蛋白表達 1：對照組 2：實驗組1 h 3：實驗組3 h 4：實驗組6 h 5：實驗組12 h 6：實驗組24 h 7：實驗組48 h ? ?3 討論
SCI是臨床常見的高致殘性損傷，可造成患者神經功能永久性障礙。通過對SCI的病理改變和繼發損傷深入研究，目前認為影響脊髓有效修復的原因可歸結于以下兩個主要方面[14-16]：① 原發性損傷后造成大量神經元細胞凋亡，而神經元本身缺乏再生能力；② 繼發性損傷引發的包括損傷區域炎性反應、神經營養因子缺乏、膠質細胞為主要成分的致密膠質瘢痕形成，以及抑制軸突生長乃至妨礙軸突正確尋靶的抑制性分子的存在等，造成抑制神經再生的微環境。近年來，改善SCI后的局部微環境，特別是減少局部膠質瘢痕形成，成為研究熱點之一。
SCI后巨噬細胞聚集、激活并釋放一些細胞因子，促使星形膠質細胞和小膠質細胞遷移，同時星形膠質細胞增殖、肥大，細胞較正常時出現更多的膠質絲和突起，隨后包圍受損和變性的神經元，最終導致膠質瘢痕形成[17]。雖然膠質瘢痕在隔離損傷組織中起到有益作用[18]，但同時也構成了神經元突起生長的屏障而阻礙軸突再生，干擾神經元功能恢復，既往研究已證實膠質瘢痕是影響軸突再生和中樞系統損傷后功能恢復的主要障礙[19-20]。星形膠質細胞是膠質瘢痕的主要形成細胞，因此研究SCI后反應性膠質增生、瘢痕形成的內在分子機制，進而探索出有效調節、平衡該過程的方法，也許可為我們治療SCI提供新的思路。
研究證實，SCI的病理生理過程受細胞周期的調控。抑制細胞周期進程有助于減少膠質細胞的增生和瘢痕形成[21]；反之，促進細胞周期進程會引起細胞死亡和膠質細胞活化增生[22]。細胞周期內源性調控主要通過細胞周期蛋白、CDK和其抑制劑CDKI的參與。細胞周期的正性調節蛋白不僅可促進膠質細胞的激活，并且由于神經元屬于終末分化細胞，當細胞周期調節蛋白高表達時，神經元常出現凋亡，而運用細胞周期抑制劑可抑制神經系統損傷后神經元的凋亡及膠質細胞激活，有效改善臨床癥狀。p27kip1為細胞周期蛋白負性調控分子的典型代表，由于它對激酶的抑制作用，周期蛋白復合物不能有效地磷酸化Rb蛋白，E2F轉錄因子不能被釋放，下游的基因不能被轉錄，從而阻斷了細胞周期的進程。由此可見p27kip1表達量對機體維持正常功能發揮著至關重要的作用。由于 P27kip1的基因突變非常罕見，其mRNA在整個細胞周期的水平也基本恒定，其表達量的調節主要依賴于一些相關蛋白介導的泛素化降解機制。其降解形式主要是在核內S10、Thr187位磷酸化，然后出核轉運至細胞質，通過26S蛋白酶體途徑降解。細胞質E3復合體KPC是細胞 G1～S期p27kip1泛素化降解所需的一種胞漿泛素蛋白連接酶復合體。KPC包括KPC1和KPC2兩個亞基。KPC2是UBL-UBA 蛋白家族成員之一，能夠與另一催化亞基KPC1共同形成KPC。KPC2通過其COOH端的UBL結構域可促進p27kip1運輸至26S 蛋白酶并對KPC1亞基起到穩定作用；NH2端的UBA結構域可結合多聚范素化蛋白，從而介導p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平。
研究發現，p27kip1作為一種細胞周期相關性抑制蛋白，在細胞中靜息期表達較高，某些刺激因素導致細胞進入增殖期后，其表達就會有明顯下降。對這一分子表達量的調節主要發生在轉錄后水平，KPC2對其有泛素化降解作用。本實驗結果顯示，SCI后p27kip1的表達先降低后恢復正常，相應時間點KPC2表達則明顯增加，二者蛋白表達量存在負相關，說明撞擊損傷初期既有熟知的細胞凋亡，還會有相關細胞的增殖修復，才會造成p27kip1蛋白表達下調；修復后期大部分細胞則重新進入G0期，p27kip1蛋白表達則又上升。免疫組織化學結果雖然驗證了Western blot實驗結果，但免疫組織化學結果只能顯示KPC2廣泛定位于脊髓灰質和白質中，為了確定KPC2在損傷脊髓后的高表達具體與哪種細胞類型相關，我們運用免疫熒光雙標記觀察KPC2的細胞定位情況。免疫熒光雙標記結果顯示在脊髓灰質前角和后角，KPC2與神經元在損傷前后均有共定位；在白質，KPC2與GFAP標記的星形膠質細胞有明顯共定位，且在損傷后陽性信號增加，KPC2表達的這種差異主要在白質的膠質細胞中顯現。在空間形態上，免疫熒光雙標記結果顯示損傷3 d左右較對照組星形膠質細胞數目增加、胞體肥大、分支增多交織成網狀；GFAP和PCNA在此時有明顯的共定位。因此，我們推測SCI激發了細胞周期的進程（G1～S期），造成了星形膠質細胞的活化與增殖。同時檢測到增殖指標CyclinA和PCNA表達量在損傷后表達開始逐漸升高，傷后3 d表達量最高，一直維持較高水平至損傷后14 d左右，更驗證了這一時期膠質細胞增殖。熒光結果顯示KPC2與GFAP、PCNA有明顯共定位，且損傷后共定位明顯增加。以上結果更加明確了KPC2與SCI后星形膠質細胞的增殖相關。結合既往研究p27kip1和KPC1參與SCI過程的調節，且KPC2能夠與催化亞基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白連接酶復合體，從而介導p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平[12]。在本實驗中發現p27kip1在SCI后的確存在著時空表達變化，為了研究KPC2、KPC1和p27kip1之間在損傷后脊髓中存在相互作用，我們運用了免疫共沉淀實驗方法，結果表明三者間可互相作用，且在細胞增殖期作用明顯增強。以上結果顯示KPC2與SCI后星形膠質細胞的增殖相關。為了進一步闡述這一問題，本研究采用新生24 h內SD大鼠脊髓，體外培養原代星形膠質細胞，使用血清饑餓48 h療法致使細胞同步在G0/G1期，隨后加入血清刺激細胞增殖，模擬體內星形膠質細胞受損傷后增殖條件。熒光細胞化學分析法檢測示，分離純化的星形膠質細胞純度達98.5%。提取細胞蛋白行Western blot檢測示，PCNA和KPC2蛋白表達在血清刺激增殖后即開始增加，24 h達峰值，而p27kip1表達則逐漸減少。這一結果進一步驗證了大體水平結論的正確性。
綜上述，本研究首次報道了KPC2在SCI前后的空間表達變化，指出KPC2依賴的p27kip1泛素化降解過程，可能為SCI后抑制星形膠質細胞的過度活化增殖起到作用，為今后進一步研究p27kip1及其調控分子網絡在SCI后膠質細胞增殖、瘢痕形成生理和病理過程中發揮的作用奠定了形態學基礎。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的治療一直是醫學界難題。SCI包括原發性和繼發性兩種損傷機制[1]，后者可導致損傷部位膠質細胞反應性增生形成膠質瘢痕，局部微環境破壞，從而不利于軸突再生，損傷髓鞘無法修復，最終導致傷后功能恢復困難[2-3]。如何調控星形膠質細胞的激活增殖成為研究熱點[4-5]。有研究表明，SCI的病理生理過程離不開細胞周期機制的調控[6]。在細胞周期調節過程中，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin depedent kinase，CDK）和CDK抑制劑（CDK inhibitor，CDKI）通過相互作用來調控細胞周期進展。作為CDKI家族的主要成員之一，最令人注目的是p27kip1分子，它參與調節了神經發生的多個方面[7-8]。p27kip1表達量對機體功能維持發揮著至關重要的作用，其表達量的調節主要依賴于一些相關蛋白介導的泛素化降解機制。胞漿泛素蛋白連接酶2 （Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2，KPC2）是UBL-UBA蛋白家族成員之一，能夠與另一催化亞基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白連接酶復合體，NH2端的UBA結構域可結合多聚范素化蛋白，從而介導p27kip1在細胞G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平[9-11]。有研究表明，p27kip1和KPC1參與SCI修復過程的調節[12]。那么在SCI后KPC2的表達情況如何，KPC2是否參與SCI后膠質細胞活化增殖的調控，目前尚缺乏相關研究。本研究通過建立SD大鼠脊髓撞擊損傷和體外培養星形膠質細胞增殖模型，觀察KPC2在星形膠質細胞中的分布和表 達變 化，為探討SCI的修復機制提供新的分子基 礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年SD大鼠56只，雌雄不限，體重200～230 g；新生24 h內SD大鼠14只，體重5～6 g；均購于南通醫學院實驗動物中心。
抗p27kip1、抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、抗GAPDH抗體（Santa Cruz公司，美國）；抗KPC1、KPC2抗體（Abcam公司，美國）；抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶復合物液（上海源葉生物科技有限公司）；抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體（Cell-Signalling公司，美國）；抗神經元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體（Chemicon公司，美國）。低溫冷凍離心機（Beckman公司，美國）；電泳儀（上海西巴斯生物技術開發有限公司）；紫外分光光度儀（Eppendorf公司，德國）；熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；圖像分析系統（Syngene公司，英國）。
1.2 大鼠SCI模型制備及實驗方法
1.2.1 實驗分組及大鼠SCI模型制備
將成年SD大鼠隨機分為2組，對照組7只，實驗組49只。大鼠以水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取俯臥位，以T9為中心常規背部皮膚脫毛、消毒，對照組僅行單純T9椎板全切除術，保證硬脊膜完整；實驗組將顯露的T9脊髓用打擊器撞擊（10 g×10 cm），鼠尾痙攣性擺動、雙下肢回縮撲動后肢癱瘓提示造模成功。再次消毒后逐層縫合皮膚。傷后每天定時給予3次人工膀胱排尿，必要時人工排便。實驗組于傷后6、12 h及1、3、5、7、14 d分別取7只大鼠進行以下檢測。
1.2.2 Western
blot檢測 分別取對照組和各時間點實驗組大鼠（n=4），以SCI處為中心切取長約1 cm脊髓，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，4℃以離心半徑6 cm、10 000 r/min離心30 min，取上清用紫外分光光度儀測定蛋白含量，按蛋白量∶2×SDS上樣緩沖液∶二硫蘇糖醇為4∶1∶5比例處理蛋白，沸水煮5 min后行PAGE凝膠電泳；電泳結束后行濕式電轉移，轉移后的聚偏氟乙烯膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，然后用抗p27kip1、KPC2、PCNA和細胞周期蛋白A（CyclinA）抗體室溫封閉1 h后，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗，最后暗房膠片顯影。以目的條帶與內參GAPDH（1∶2 000）的平均吸光度（A）值比值表示相對表達量進行半定量分析。實驗組取KPC2表達最高的時間點取材進行免疫組織化學和免疫熒光雙標記染色檢測。
1.2.3 免疫組織化學染色觀察
取對照組和實驗組KPC2表達最高時間點大鼠（n=3），同上法麻醉后仰臥位固定，打開胸廓，自左心室插管，切開右心房，生理鹽水200 mL、4%多聚甲醛約500 mL灌注固定30 min，冰盒上打開椎管，暴露脊髓，以損傷處為中心切取兩側各約5 mm脊髓組織，常規脫水后，OCT包埋劑包埋，行冠狀面連續冰凍切片，厚10 μm。兩組選取3張切片，加10%驢血清封閉液室溫封閉2 h；去封閉液，加兔抗KPC2一抗（1∶100）4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌3次后加生物素偶聯試劑偶聯的驢抗兔二抗，37℃孵育2 h；PBS洗滌，滴加抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶復合物液37℃孵育40 min，PBS洗滌3次后DAB顯色，常規梯度脫水、透明，封片吹干后熒光顯微鏡觀察。鏡下于10 mm×10 mm視野下計數KPC2陽性細胞數。采用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。
1.2.4 免疫熒光雙標記染色觀察
兩組各取上述切片3張，10%驢血清封閉液室溫2 h封閉非特異性位點。去封閉液，加一抗[KPC2（1∶100），NeuN（1∶600），PCNA（1∶500），GFAP（1∶500）]，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，暗室加CY2和CY3標記的熒光二抗，避光室溫孵育2 h，PBS洗滌后碳酸鹽緩沖甘油封片，暗室內熒光顯微鏡觀察，于10 mm×10 mm視野內計數陽性細胞數。采用同濃度PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 體外星形膠質細胞增殖模型制備及實驗方法
1.3.1 新生大鼠脊髓星形膠質細胞分離、培養及傳代
取新生24 h內SD大鼠，參照McCarthy等[13]方法并進行改進分離培養星形膠質細胞。將大鼠于75%乙醇中浸泡1 min后，無菌條件下取其脊髓，置冰浴D-Hank液中，分離、剪碎脊髓組織；置離心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶37℃下消化15 min；用DMEM基礎培養基終止消化，過200目篩網，1 200 r/min離心5 min；棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基輕柔吹打制成細胞懸液，調節細胞密度為5×105個/cm2，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。每3天半量換液1次，9～10 d后細胞已基本融合。將培養瓶置于37℃恒溫旋轉搖床，200 r/min、20 h；更換新的含10%FBS的DMEM/F12培養基，以除去生長在星形膠質細胞上層的小膠質細胞和少突細胞。D-Hank液清洗3次，進行傳代培養即得到純化的星形膠質細胞。使用血清饑餓48 h療法使細胞同步在G0/G1期，隨后加入新生小牛血清刺激細胞增殖，模擬體內星形膠質細胞受損傷后增殖條件；以未加入血清為對照組。收獲對照組及實驗組刺激各時間點（1、3、6、12、24、48 h）培養細胞，加入適量細胞裂解緩沖液，提取細胞蛋白進行以下分析。
1.3.2 星形膠質細胞純度檢測
未行血清饑餓療法前，取體外培養純化的星形膠質細胞，以5×104 個 / mL密度接種于10 mm×10 mm小圓蓋玻片上，3 d后PBS洗滌細胞玻片，4%多聚甲醛固定1 h后，以正常兔血清室溫封閉1 h，加入抗GFAP（1∶800）單克隆抗體，等量抗體稀釋液作對照，4℃孵育過夜，FITC標記的熒光二抗孵育 1 h，Hoechst染核30 min，暗室內熒光顯微鏡下觀察。鏡下于10 mm×10 mm視野下計數GFAP陽性細胞數。
1.3.3 Western
blot檢測及免疫共沉淀分析 取各組各時間點細胞，按1.2.2蛋白處理方法裂解細胞，取部分細胞裂解后上清液行Western blot檢測。剩余細胞裂解液中加入1～2 μg KPC2、KPC1、p27kip1抗體，4℃搖床孵育過夜，加入經預處理的10 μL Protein A瓊脂糖珠，4℃搖床2～4 h，使抗體與Protein A瓊脂糖珠耦聯；免疫沉淀反應后，4℃以離心半徑6 cm、1 200 r/min離心3 min，將Protein A瓊脂糖珠離心至管底；去上清液，Protein A瓊脂糖珠用裂解緩沖液洗3次，最后加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心取上清，SDS-PAGE凝膠電泳行免疫共沉淀。
1.4 統計學方法
采用SPSS11.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 KPC2在大鼠SCI過程中的表達
2.1.1 Western
blot檢測 與對照組比較，實驗組p27kip1表達量在損傷后即開始降低，3 d時降至最低，之后逐漸升高，14 d時恢復至對照組水平；實驗組KPC2、CyclinA及PCNA表達量在損傷后即開始增加，3 d達峰值，之后緩慢下降，14 d時PCNA表達量仍維持較高水平。實驗組損傷后3、5、7 d p27kip1、KPC2、CyclinA及PCNA表達量與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1、表 1。
圖1
Western blot檢測兩組各時間點各蛋白表達 1：對照組 2：實驗組6 h 3：實驗組12 h 4：實驗組1 d 5：實驗組3 d 6：實驗組5 d 7：實驗組7 d 8：實驗組14 d ? ?
表1
Western blot檢測對照組、實驗組SCI過程中各時間點各蛋白表達（n=4，2.1.2 免疫組織化學染色觀察
低倍鏡下發現兩組KPC2陽性信號廣泛分布，包括脊髓灰質和白質。高倍鏡下觀察到對照組KPC2陽性信號較弱；而實驗組SCI后3 d KPC2陽性細胞數量及陽性信號強度均明顯增加（圖 2），陽性細胞數為（320.40±34.20）個 /視野，顯著高于對照組的（145.67±24.55）個/視野，差異有統計學意義（t=10.982，P=0.000）。
2.1.3 免疫熒光雙標記染色觀察
在脊髓灰質，兩組KPC2與NeuN標記的神經元均有共定位；對照組和實驗組KPC2與NeuN雙標記陽性細胞數分別為（0.43±0.53）、（0.57±0.53）個/視野，比較差異無統計學意義（t=0.548，P=0.604）。在脊髓白質，兩組KPC2與GFAP標記的星形膠質細胞共定位明顯，并且實驗組較對照組細胞形態有所改變，且陽性信號細胞數量（3.86±0.90）個/視野較對照組（0.71±0.49） 個/視野明顯增加，差異有統計學意義（t=7.778，P=0.000）。在脊髓白質，兩組KPC2與PCNA標記的星形膠質細胞共定位明顯，且實驗組陽性細胞數（5.57±1.13）個/視野較對照組（0.57±0.53）個/視野明顯增加，差異有統計學意義（t=8.101，P=0.000）。見圖 3。
圖3
兩組免疫熒光雙標記染色觀察（熒光顯微鏡×400） ? 實驗組KPC2 ? 實驗組NeuN ? 實驗組KPC2/NeuN合圖 ? 對照組KPC2/NeuN合圖 ? 實驗組KPC2 ? 實驗組GFAP ? 實驗組KPC2/GFAP合圖 ? 對照組KPC2/GFAP合圖 ? 實驗組KPC2 ? 實驗組PCNA ? 實驗組KPC2/PCNA合圖 ? 對照組KPC2/PCNA合圖 ? ?2.2 KPC2在體外培養星形膠質細胞中的表達
熒光細胞化學分析法檢測示，分離純化的星形膠質細胞純度達98.5%（圖 4）。提取細胞蛋白行Western blot檢測示，PCNA和KPC2蛋白表達在血清刺激增殖后即開始增加，24 h達峰值，而p27kip1表達則逐漸減少（圖 5）。免疫共沉淀分析示，KPC2可沉淀p27kip1、KPC1，p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1，且在刺激后相互作用明顯增加（圖 6）。
圖5
Western blot檢測體外培養星形膠質細胞增殖模型中各蛋白表達 1：對照組 2：實驗組1 h 3：實驗組3 h 4：實驗組6 h 5：實驗組12 h 6：實驗組24 h 7：實驗組48 h ? ?3 討論
SCI是臨床常見的高致殘性損傷，可造成患者神經功能永久性障礙。通過對SCI的病理改變和繼發損傷深入研究，目前認為影響脊髓有效修復的原因可歸結于以下兩個主要方面[14-16]：① 原發性損傷后造成大量神經元細胞凋亡，而神經元本身缺乏再生能力；② 繼發性損傷引發的包括損傷區域炎性反應、神經營養因子缺乏、膠質細胞為主要成分的致密膠質瘢痕形成，以及抑制軸突生長乃至妨礙軸突正確尋靶的抑制性分子的存在等，造成抑制神經再生的微環境。近年來，改善SCI后的局部微環境，特別是減少局部膠質瘢痕形成，成為研究熱點之一。
SCI后巨噬細胞聚集、激活并釋放一些細胞因子，促使星形膠質細胞和小膠質細胞遷移，同時星形膠質細胞增殖、肥大，細胞較正常時出現更多的膠質絲和突起，隨后包圍受損和變性的神經元，最終導致膠質瘢痕形成[17]。雖然膠質瘢痕在隔離損傷組織中起到有益作用[18]，但同時也構成了神經元突起生長的屏障而阻礙軸突再生，干擾神經元功能恢復，既往研究已證實膠質瘢痕是影響軸突再生和中樞系統損傷后功能恢復的主要障礙[19-20]。星形膠質細胞是膠質瘢痕的主要形成細胞，因此研究SCI后反應性膠質增生、瘢痕形成的內在分子機制，進而探索出有效調節、平衡該過程的方法，也許可為我們治療SCI提供新的思路。
研究證實，SCI的病理生理過程受細胞周期的調控。抑制細胞周期進程有助于減少膠質細胞的增生和瘢痕形成[21]；反之，促進細胞周期進程會引起細胞死亡和膠質細胞活化增生[22]。細胞周期內源性調控主要通過細胞周期蛋白、CDK和其抑制劑CDKI的參與。細胞周期的正性調節蛋白不僅可促進膠質細胞的激活，并且由于神經元屬于終末分化細胞，當細胞周期調節蛋白高表達時，神經元常出現凋亡，而運用細胞周期抑制劑可抑制神經系統損傷后神經元的凋亡及膠質細胞激活，有效改善臨床癥狀。p27kip1為細胞周期蛋白負性調控分子的典型代表，由于它對激酶的抑制作用，周期蛋白復合物不能有效地磷酸化Rb蛋白，E2F轉錄因子不能被釋放，下游的基因不能被轉錄，從而阻斷了細胞周期的進程。由此可見p27kip1表達量對機體維持正常功能發揮著至關重要的作用。由于 P27kip1的基因突變非常罕見，其mRNA在整個細胞周期的水平也基本恒定，其表達量的調節主要依賴于一些相關蛋白介導的泛素化降解機制。其降解形式主要是在核內S10、Thr187位磷酸化，然后出核轉運至細胞質，通過26S蛋白酶體途徑降解。細胞質E3復合體KPC是細胞 G1～S期p27kip1泛素化降解所需的一種胞漿泛素蛋白連接酶復合體。KPC包括KPC1和KPC2兩個亞基。KPC2是UBL-UBA 蛋白家族成員之一，能夠與另一催化亞基KPC1共同形成KPC。KPC2通過其COOH端的UBL結構域可促進p27kip1運輸至26S 蛋白酶并對KPC1亞基起到穩定作用；NH2端的UBA結構域可結合多聚范素化蛋白，從而介導p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平。
研究發現，p27kip1作為一種細胞周期相關性抑制蛋白，在細胞中靜息期表達較高，某些刺激因素導致細胞進入增殖期后，其表達就會有明顯下降。對這一分子表達量的調節主要發生在轉錄后水平，KPC2對其有泛素化降解作用。本實驗結果顯示，SCI后p27kip1的表達先降低后恢復正常，相應時間點KPC2表達則明顯增加，二者蛋白表達量存在負相關，說明撞擊損傷初期既有熟知的細胞凋亡，還會有相關細胞的增殖修復，才會造成p27kip1蛋白表達下調；修復后期大部分細胞則重新進入G0期，p27kip1蛋白表達則又上升。免疫組織化學結果雖然驗證了Western blot實驗結果，但免疫組織化學結果只能顯示KPC2廣泛定位于脊髓灰質和白質中，為了確定KPC2在損傷脊髓后的高表達具體與哪種細胞類型相關，我們運用免疫熒光雙標記觀察KPC2的細胞定位情況。免疫熒光雙標記結果顯示在脊髓灰質前角和后角，KPC2與神經元在損傷前后均有共定位；在白質，KPC2與GFAP標記的星形膠質細胞有明顯共定位，且在損傷后陽性信號增加，KPC2表達的這種差異主要在白質的膠質細胞中顯現。在空間形態上，免疫熒光雙標記結果顯示損傷3 d左右較對照組星形膠質細胞數目增加、胞體肥大、分支增多交織成網狀；GFAP和PCNA在此時有明顯的共定位。因此，我們推測SCI激發了細胞周期的進程（G1～S期），造成了星形膠質細胞的活化與增殖。同時檢測到增殖指標CyclinA和PCNA表達量在損傷后表達開始逐漸升高，傷后3 d表達量最高，一直維持較高水平至損傷后14 d左右，更驗證了這一時期膠質細胞增殖。熒光結果顯示KPC2與GFAP、PCNA有明顯共定位，且損傷后共定位明顯增加。以上結果更加明確了KPC2與SCI后星形膠質細胞的增殖相關。結合既往研究p27kip1和KPC1參與SCI過程的調節，且KPC2能夠與催化亞基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白連接酶復合體，從而介導p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影響p27kip1蛋白量的表達水平[12]。在本實驗中發現p27kip1在SCI后的確存在著時空表達變化，為了研究KPC2、KPC1和p27kip1之間在損傷后脊髓中存在相互作用，我們運用了免疫共沉淀實驗方法，結果表明三者間可互相作用，且在細胞增殖期作用明顯增強。以上結果顯示KPC2與SCI后星形膠質細胞的增殖相關。為了進一步闡述這一問題，本研究采用新生24 h內SD大鼠脊髓，體外培養原代星形膠質細胞，使用血清饑餓48 h療法致使細胞同步在G0/G1期，隨后加入血清刺激細胞增殖，模擬體內星形膠質細胞受損傷后增殖條件。熒光細胞化學分析法檢測示，分離純化的星形膠質細胞純度達98.5%。提取細胞蛋白行Western blot檢測示，PCNA和KPC2蛋白表達在血清刺激增殖后即開始增加，24 h達峰值，而p27kip1表達則逐漸減少。這一結果進一步驗證了大體水平結論的正確性。
綜上述，本研究首次報道了KPC2在SCI前后的空間表達變化，指出KPC2依賴的p27kip1泛素化降解過程，可能為SCI后抑制星形膠質細胞的過度活化增殖起到作用，為今后進一步研究p27kip1及其調控分子網絡在SCI后膠質細胞增殖、瘢痕形成生理和病理過程中發揮的作用奠定了形態學基礎。
