引用本文： 龍毅, 何愛珊, 張志奇, 孟繁鋼, 侯昌禾, 張紫機, 黃廣鑫, 廖威明. 撕裂半月板中軟骨退變相關基因及miRNAs的表達. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 301-306. doi: 10.7507/1002-1892.20150065 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨進行性退變和骨贅形成為特征的關節疾病，但OA不僅是關節軟骨的退變，還涉及整個關節[1-2]，包括軟骨、滑膜和半月板等[3-4]。研究表明，半月板撕裂或退變后，關節缺乏半月板對軟骨的緩沖保護作用，發生OA的風險顯著上升[5]。但有學者發現半月板撕裂后，膝關節軟骨損傷的位置不一定在撕裂半月板對應處，局限的半月板撕裂可能影響整個關節軟骨[6]。提示半月板對軟骨的影響可能不僅在生物力學方面，其細胞和分子的相關病理改變也起到關鍵作用。目前已有大量臨床隨訪發現半月板撕裂和OA密切相關，但從分子水平探究撕裂半月板對軟骨影響的報道極少。本實驗旨在驗證半月板撕裂后相關軟骨退變基因是否發生改變，在分子水平分析半月板對軟骨退變的潛在影響，以及miRNAs和軟骨退變的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本收集及處理
以2012年9月－2013年10月于中山大學附屬第一醫院行關節鏡下撕裂半月板部分切除的5例患者自愿捐贈半月板組織作為實驗組。其中男2例，女3例；年齡16～38歲，平均25.2歲。病程（出現癥狀至手術時間）5～14個月，平均9個月。以同期4例截肢患者自愿捐贈的正常未撕裂半月板組織作為對照組。其中男3例，女1例；年齡16～23歲，平均20歲。所有患者軟骨損傷按照改良Outerbridge分級均≤Ⅱ級，其中對照組3例0級、1例Ⅰ級，實驗組1例0級、2例Ⅰ級、2例Ⅱ級；無痛風、類風濕性關節炎、OA及韌帶損傷。本研究經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準。
所有標本用生理鹽水清洗2遍，切成碎片裝入2 mL凍存管中；按每50～100 毫克組織加入1 mL RNAlater試劑（Ambion公司，美國），置于-200℃液氮10 min，再轉入-80℃低溫冰箱中凍存。
1.2 組織學觀察
取兩組低溫凍存的半月板，剔除周圍軟組織，生理鹽水沖洗，常規固定、脫水、浸蠟、包埋，5 μm 厚連續切片。常規HE染色，鏡下觀察半月板組織。
1.3 實時熒光定量PCR檢測
按照miRNeasy Mini Kit試劑盒（QIAGEN公司，德國）說明書提取總RNA。取50 mg低溫凍存組織，加入少量液氮后于研缽中研磨，加入700 μL QIAzol溶液，制成組織勻漿，轉移至離心管后室溫放置5 min。加入140 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置2～3 min。4℃，以離心半徑0.7 cm，12 000 r/ min離心15 min。吸取上層水相至另一離心管中，加入525 μL100%乙醇充分吹吸混勻。將混合液（包括沉淀）完全吸入帶收集管的 RNeasy Mini離心柱中，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。加入700 μL RWT緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。 加入500 μL RPE緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。再次加入500 μL RPE緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心2 min后棄濾液。更換1.5 mL收集管，吸取30 μL RNase-Free水直接滴在 RNeasy Mini離心柱膜上，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心1 min洗提 RNA。利用 Epoch超微量微孔板分光光度計（Biotek公司，美國）測定總 RNA的濃度和純度，測得吸光度（A）260/280均在1.9～2.1之間。
按照One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara公司，日本）說明書進行反轉錄。反轉錄反應體系為20 μL，0.5 g/L總 RNA 1 μL，2×反轉錄緩沖混合物10 μL，RNase-Free水5 μL，反轉錄酶2 μL，0.1%牛血清白蛋白 2 μL。將反應體系轉移到0.2 mL PCR管，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心30 s混勻，編輯程序，在梯度PCR儀（ABI公司，美國）中進行反轉錄，反轉錄反應條件為37℃ 60 min，85℃ 5 s。
按照 SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（Takara公司，日本）說明書進行實時熒光定量PCR。熒光定量 PCR反應體系為20 μL，cDNA模板2 μL，水6.4 μL，SYBR Green Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL。熒光定量PCR反應條件為預變性95℃ 30 s；PCR反應95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40個循環；融解曲線分析65℃ 15 s。管家基因 U6為內參照，樣本之間基因表達的倍數差異用χ= 2-ΔΔCt計算，其中 ΔΔCt =ΔCt－ΔCt對照均值，ΔCt=Ct 目的 基因－Ct內參 基因。所有樣本均重復3次。相關軟骨退變基因[蛋白多糖（Aggrecan，ACAN)、Ⅹ型膠原（type X collagen，COL10A1）、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）、CCAAT增強子結合蛋白β（CCAAT enhancer binding protein β，CEBP-β）、蛋白聚糖酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondinmotif 5，ADAMTS-5）]引物由美國Invitrogen公司合成，miRNAs（miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p）引物由日本Takara公司合成。見表 1。
表1
目的基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 組織學觀察
對照組：正常半月板為內薄外厚新月形纖維軟骨，表面光滑，形態完整無撕裂，呈亮白色或淺褐色，彈性好（圖 1 a）。鏡下可見半月板組織表層結構完整，膠原纖維排列緊密，粗細一致，染色均勻（圖 1 b）；纖維軟骨細胞呈橢圓形或梭形，胞核大、圓且光滑，位于陷窩內，無血管增生，無炎性細胞浸潤（圖 1 c）。
圖1
對照組正常半月板觀察 ? 大體觀察 ? HE染色觀察（×20） ? HE染色觀察（×40）? ?圖 2 實驗組撕裂半月板觀察 ? 關節鏡下觀察 ? HE染色觀察（×20） ? HE染色觀察（×40）
Figure1.
Morphology observation of normal meniscus in control group ? Gross observation ? HE staining observation (×20) ? HE staining observation (×40)? ? Fig. 2 Morphology observation of the torn meniscus in experimental group ? Arthroscopic observation ? HE staining observation (×20) ? HE staining observation (×40)
實驗組：關節鏡下見半月板呈白色或淡黃，表面不平整，彈性較正常半月板差，局部可見凹陷，游離緣多有磨損或裂口，斷面毛糙不平，多呈黃色改變，有纖維斷絲漂浮（圖 2 a）。鏡下可見膠原纖維紊亂且染色不均，排列較疏松；軟骨細胞無序增多或減少，分布不規則，可見空泡樣變細胞，軟骨陷窩減少或消失，可見脂肪細胞及炎性細胞浸潤，局部有纖維增多及玻璃樣病變（圖 2 b、c）。
2.2 半月板組織中軟骨退變相關基因及miRNAs的表達
與對照組相比，實驗組ACAN表達水平下調，COL10A1、CEBP-β、ADAMTS-5、MMP-13表達水平均上調；除ACAN、MMP-13外，其余各退變相關基因組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
與對照組相比，實驗組miR-193b、miR-92a、miR-455-3p表達水平均顯著上調，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組軟骨退變相關基因及 miRNAs表達比較（3 討論
3.1 半月板病理組織改變
半月板為纖維軟骨結構，主要由纖維軟骨細胞、Ⅰ型膠原、蛋白多糖及少量非膠原蛋白等組成。當半月板撕裂后，不僅患膝生物力學發生變化，半月板組織也會發生相應病理改變，而且隨著創傷時間的推移，半月板的病理改變可能會越來越嚴重[7]，包括膠原纖維排列結構改變、軟骨細胞形態改變、脂肪細胞和炎性細胞浸潤以及玻璃樣病變、瘢痕形成等相關退行性改變[8]。我們分別對正常半月板和撕裂半月板進行了病理組織學觀察比較，發現半月板撕裂后5～14個月，開始出現不同程度的病理改變，提示半月板撕裂后早期，其內細胞組織、纖維結構開始發生變化，半月板有退變趨勢。導致其病變的主要原因可能是半月板撕裂后膝關節生物力學發生變化，加速其磨損退變，但半月板內細胞分子的相關病理改變可能是半月板退變加速的又一重要因素。
3.2 半月板軟骨退變相關基因分析
關節軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成[9]。在生理狀況下，軟骨細胞在合成代謝和分解代謝之間保持平衡，并調節著ECM結構和功能上的完整。OA患者關節軟骨細胞功能改變，合成代謝減少以及分解代謝酶（特別是ADAMTS-5、 MMP-13）增多會打破這種平衡，引起 ECM中Ⅱ型膠原、蛋白多糖總量的丟失，這是導致 OA的直接原因[10]。半月板代謝過程與關節軟骨相同[3]，所以半月板中相關退變基因表達的改變可為其發生退變提供分子依據。
我們研究發現，相對于正常半月板，撕裂半月板中 ADAMTS-5表達水平顯著上調，MMP-13表達水平有上調趨勢，ACAN表達水平有下調趨勢。說明當半月板撕裂后，分解代謝酶（ADAMTS-5、MMP-13）合成增加，ACAN合成減少，提示ECM中蛋白多糖及膠原纖維降解可能更嚴重，這些撕裂半月板的早期代謝變化，包括合成代謝減少、分解代謝增多，可能是隨后關節退變的基礎。同時 ACAN表達下調可能也提示半月板撕裂后，其潛在的合成修復能力開始下降，這從分子水平解釋了撕裂后的半月板組織自身修復較困難。
Ⅹ型膠原是一種網織結構膠原纖維，由肥大軟骨細胞特異性表達，被認為是軟骨細胞肥大的標志物[11]。本實驗中撕裂半月板和正常半月板相比CO L10A1表達水平上調，提示半月板撕裂后，可能部分纖維軟骨細胞轉變為肥大軟骨細胞，導致Ⅹ型膠原的合成量比正常半月板增多。病理組織切片發現撕裂半月板中開始出現空泡樣變細胞，提示它可能正向肥大軟骨細胞轉變。有研究發現軟骨細胞肥大對OA發展過程中軟骨退變有促進作用[12]，因此COL10A1表達升高從另一個角度提示了半月板撕裂后關節軟骨可能更容易發生退變。
CEBP-β是一種核轉錄因子，廣泛參與生理、病理代謝過程的調控。例如能促使軟骨細胞肥大，從而表達 MMP-13、 Ⅹ型膠原等[13]，還可通過顯著刺激MMP-3、 MMP-13和 ADAMTS-5的表達來降解軟骨中的 ECM，從而導致 OA的發生[14-16]。我們研究發現，撕裂半月板中 CEBP-β表達水平顯著上調，提示當半月板發生撕裂后，CEBP-β的合成會顯著增加，引起其下游的軟骨退變相關因子過表達，最終導致 OA的發生，即撕裂半月板中 CEBP-β表達上調可能與COL10A1、 MMP-13和 ADAMTS-5過表達有密切關系。
總之，我們研究發現當半月板撕裂后，半月板在病理組織學上有退變的相關表現，且其內軟骨退變相關基因表達發生了改變，這些細胞和分子代謝水平的內在變化，可能會加速半月板組織發生退變。且半月板中軟骨退變相關基因的表達異常，不僅提示半月板自身退變加速，而且合成的相關退變酶會釋放入關節腔，導致整個關節發生退變，從而發展為 OA。因此，撕裂半月板對軟骨退變有促進作用，且比正常半月板大。大量臨床研究發現半月板撕裂會顯著增加 OA發生率[17]，本實驗結果與其相符，為此類患者臨床上 OA的高發率提供了細胞分子學依據。
3.3 半月板軟骨退變相關miRNAs分析
miRNAs是一類內源性長度為19～25 nt的非編碼單鏈 RNA，廣泛存在于真核生物中，在轉錄后水平調控基因的表達[18]。目前越來越多的研究證實 miRNAs在調控 OA發生過程中起到重要作用。我們前期研究發現 miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p與軟骨生長發育相關，并且通過生物信息軟件對靶基因進行了預測，它們的共同靶基因可能包括：RUNX2，SOX4，CEBP-β，TGF-β1，BMP-2、6、7及SMAD-3、4、5等[19]。本次我們檢測了3種 miRNAs及潛在靶基因 CEBP-β，發現在撕裂半月板中 miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p表達均上調且有統計學意義，但CEBP-β卻沒有預想中的表達下調。可能是存在其他因素（包括 CEBP-β上游的調節因子）或者其他 miRNAs共同作用導致 CEBP-β最終表達呈上調趨勢。miRNAs在調控生理病理過程，并不是一對一簡單作用于對應靶基因，而是共同形成一個復雜精確的環路來達到調控目的。即一個 miRNA可以調控多個靶基因，同一靶基因可由數個 miRNAs共同作用。如本次檢測的3種 miRNAs還可以分別或共同調控其他靶基因，如 RUNX2，TGF-β1，BMP-2、6、7及SMAD-3、4、5等，來影響信號通路，使得ECM分解代謝增加，合成代謝減少，最終導致軟骨退變加速和 OA的發生。已有研究發現 miR-193b可通過抑制ACAN和Ⅱ型膠原基因的表達來破壞軟骨基質，促進軟骨細胞老化[20]。Swingler 等[21]研究表明miR-455通過抑制 SMAD-2、3通路來影響TGF-β信號傳導，促使軟骨細胞老化從而破壞軟骨導致 OA發生，本實驗結果與該結論一致。
本研究尚有局限性，如未充分考慮半月板撕裂類型、部位及患者個體情況，包括性別、身體質量指數及是否吸煙、喝酒等。目前半月板撕裂類型與關節軟骨損傷之間的關系尚存爭議，有研究認為半月板為較大的放射狀撕裂、桶柄狀撕裂和復合型撕裂時OA的發生率會更高[22]。也有學者認為半月板撕裂類型與軟骨損傷發生率沒有顯著聯系[23]。下一步研究擬增大樣本量，對患者按差異進行分組，充分考慮各方面情況。
綜上述，本研究從細胞分子水平探究撕裂半月板對軟骨退變的影響，結果提示半月板撕裂后，半月板組織有開始退變趨勢，其內軟骨退變相關基因表達變化可能加速了其退變。撕裂半月板對軟骨退變促進作用比正常半月板大。miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p可能和關節退變相關，可能是促進軟骨退變的調控因子。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨進行性退變和骨贅形成為特征的關節疾病，但OA不僅是關節軟骨的退變，還涉及整個關節[1-2]，包括軟骨、滑膜和半月板等[3-4]。研究表明，半月板撕裂或退變后，關節缺乏半月板對軟骨的緩沖保護作用，發生OA的風險顯著上升[5]。但有學者發現半月板撕裂后，膝關節軟骨損傷的位置不一定在撕裂半月板對應處，局限的半月板撕裂可能影響整個關節軟骨[6]。提示半月板對軟骨的影響可能不僅在生物力學方面，其細胞和分子的相關病理改變也起到關鍵作用。目前已有大量臨床隨訪發現半月板撕裂和OA密切相關，但從分子水平探究撕裂半月板對軟骨影響的報道極少。本實驗旨在驗證半月板撕裂后相關軟骨退變基因是否發生改變，在分子水平分析半月板對軟骨退變的潛在影響，以及miRNAs和軟骨退變的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本收集及處理
以2012年9月－2013年10月于中山大學附屬第一醫院行關節鏡下撕裂半月板部分切除的5例患者自愿捐贈半月板組織作為實驗組。其中男2例，女3例；年齡16～38歲，平均25.2歲。病程（出現癥狀至手術時間）5～14個月，平均9個月。以同期4例截肢患者自愿捐贈的正常未撕裂半月板組織作為對照組。其中男3例，女1例；年齡16～23歲，平均20歲。所有患者軟骨損傷按照改良Outerbridge分級均≤Ⅱ級，其中對照組3例0級、1例Ⅰ級，實驗組1例0級、2例Ⅰ級、2例Ⅱ級；無痛風、類風濕性關節炎、OA及韌帶損傷。本研究經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準。
所有標本用生理鹽水清洗2遍，切成碎片裝入2 mL凍存管中；按每50～100 毫克組織加入1 mL RNAlater試劑（Ambion公司，美國），置于-200℃液氮10 min，再轉入-80℃低溫冰箱中凍存。
1.2 組織學觀察
取兩組低溫凍存的半月板，剔除周圍軟組織，生理鹽水沖洗，常規固定、脫水、浸蠟、包埋，5 μm 厚連續切片。常規HE染色，鏡下觀察半月板組織。
1.3 實時熒光定量PCR檢測
按照miRNeasy Mini Kit試劑盒（QIAGEN公司，德國）說明書提取總RNA。取50 mg低溫凍存組織，加入少量液氮后于研缽中研磨，加入700 μL QIAzol溶液，制成組織勻漿，轉移至離心管后室溫放置5 min。加入140 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置2～3 min。4℃，以離心半徑0.7 cm，12 000 r/ min離心15 min。吸取上層水相至另一離心管中，加入525 μL100%乙醇充分吹吸混勻。將混合液（包括沉淀）完全吸入帶收集管的 RNeasy Mini離心柱中，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。加入700 μL RWT緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。 加入500 μL RPE緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心15 s后棄去濾液。再次加入500 μL RPE緩沖液，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心2 min后棄濾液。更換1.5 mL收集管，吸取30 μL RNase-Free水直接滴在 RNeasy Mini離心柱膜上，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心1 min洗提 RNA。利用 Epoch超微量微孔板分光光度計（Biotek公司，美國）測定總 RNA的濃度和純度，測得吸光度（A）260/280均在1.9～2.1之間。
按照One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara公司，日本）說明書進行反轉錄。反轉錄反應體系為20 μL，0.5 g/L總 RNA 1 μL，2×反轉錄緩沖混合物10 μL，RNase-Free水5 μL，反轉錄酶2 μL，0.1%牛血清白蛋白 2 μL。將反應體系轉移到0.2 mL PCR管，室溫下以離心半徑0.7 cm，8 000 r/min離心30 s混勻，編輯程序，在梯度PCR儀（ABI公司，美國）中進行反轉錄，反轉錄反應條件為37℃ 60 min，85℃ 5 s。
按照 SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（Takara公司，日本）說明書進行實時熒光定量PCR。熒光定量 PCR反應體系為20 μL，cDNA模板2 μL，水6.4 μL，SYBR Green Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL。熒光定量PCR反應條件為預變性95℃ 30 s；PCR反應95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40個循環；融解曲線分析65℃ 15 s。管家基因 U6為內參照，樣本之間基因表達的倍數差異用χ= 2-ΔΔCt計算，其中 ΔΔCt =ΔCt－ΔCt對照均值，ΔCt=Ct 目的 基因－Ct內參 基因。所有樣本均重復3次。相關軟骨退變基因[蛋白多糖（Aggrecan，ACAN)、Ⅹ型膠原（type X collagen，COL10A1）、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）、CCAAT增強子結合蛋白β（CCAAT enhancer binding protein β，CEBP-β）、蛋白聚糖酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondinmotif 5，ADAMTS-5）]引物由美國Invitrogen公司合成，miRNAs（miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p）引物由日本Takara公司合成。見表 1。
表1
目的基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 組織學觀察
對照組：正常半月板為內薄外厚新月形纖維軟骨，表面光滑，形態完整無撕裂，呈亮白色或淺褐色，彈性好（圖 1 a）。鏡下可見半月板組織表層結構完整，膠原纖維排列緊密，粗細一致，染色均勻（圖 1 b）；纖維軟骨細胞呈橢圓形或梭形，胞核大、圓且光滑，位于陷窩內，無血管增生，無炎性細胞浸潤（圖 1 c）。
圖1
對照組正常半月板觀察 ? 大體觀察 ? HE染色觀察（×20） ? HE染色觀察（×40）? ?圖 2 實驗組撕裂半月板觀察 ? 關節鏡下觀察 ? HE染色觀察（×20） ? HE染色觀察（×40）
Figure1.
Morphology observation of normal meniscus in control group ? Gross observation ? HE staining observation (×20) ? HE staining observation (×40)? ? Fig. 2 Morphology observation of the torn meniscus in experimental group ? Arthroscopic observation ? HE staining observation (×20) ? HE staining observation (×40)
實驗組：關節鏡下見半月板呈白色或淡黃，表面不平整，彈性較正常半月板差，局部可見凹陷，游離緣多有磨損或裂口，斷面毛糙不平，多呈黃色改變，有纖維斷絲漂浮（圖 2 a）。鏡下可見膠原纖維紊亂且染色不均，排列較疏松；軟骨細胞無序增多或減少，分布不規則，可見空泡樣變細胞，軟骨陷窩減少或消失，可見脂肪細胞及炎性細胞浸潤，局部有纖維增多及玻璃樣病變（圖 2 b、c）。
2.2 半月板組織中軟骨退變相關基因及miRNAs的表達
與對照組相比，實驗組ACAN表達水平下調，COL10A1、CEBP-β、ADAMTS-5、MMP-13表達水平均上調；除ACAN、MMP-13外，其余各退變相關基因組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
與對照組相比，實驗組miR-193b、miR-92a、miR-455-3p表達水平均顯著上調，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組軟骨退變相關基因及 miRNAs表達比較（3 討論
3.1 半月板病理組織改變
半月板為纖維軟骨結構，主要由纖維軟骨細胞、Ⅰ型膠原、蛋白多糖及少量非膠原蛋白等組成。當半月板撕裂后，不僅患膝生物力學發生變化，半月板組織也會發生相應病理改變，而且隨著創傷時間的推移，半月板的病理改變可能會越來越嚴重[7]，包括膠原纖維排列結構改變、軟骨細胞形態改變、脂肪細胞和炎性細胞浸潤以及玻璃樣病變、瘢痕形成等相關退行性改變[8]。我們分別對正常半月板和撕裂半月板進行了病理組織學觀察比較，發現半月板撕裂后5～14個月，開始出現不同程度的病理改變，提示半月板撕裂后早期，其內細胞組織、纖維結構開始發生變化，半月板有退變趨勢。導致其病變的主要原因可能是半月板撕裂后膝關節生物力學發生變化，加速其磨損退變，但半月板內細胞分子的相關病理改變可能是半月板退變加速的又一重要因素。
3.2 半月板軟骨退變相關基因分析
關節軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成[9]。在生理狀況下，軟骨細胞在合成代謝和分解代謝之間保持平衡，并調節著ECM結構和功能上的完整。OA患者關節軟骨細胞功能改變，合成代謝減少以及分解代謝酶（特別是ADAMTS-5、 MMP-13）增多會打破這種平衡，引起 ECM中Ⅱ型膠原、蛋白多糖總量的丟失，這是導致 OA的直接原因[10]。半月板代謝過程與關節軟骨相同[3]，所以半月板中相關退變基因表達的改變可為其發生退變提供分子依據。
我們研究發現，相對于正常半月板，撕裂半月板中 ADAMTS-5表達水平顯著上調，MMP-13表達水平有上調趨勢，ACAN表達水平有下調趨勢。說明當半月板撕裂后，分解代謝酶（ADAMTS-5、MMP-13）合成增加，ACAN合成減少，提示ECM中蛋白多糖及膠原纖維降解可能更嚴重，這些撕裂半月板的早期代謝變化，包括合成代謝減少、分解代謝增多，可能是隨后關節退變的基礎。同時 ACAN表達下調可能也提示半月板撕裂后，其潛在的合成修復能力開始下降，這從分子水平解釋了撕裂后的半月板組織自身修復較困難。
Ⅹ型膠原是一種網織結構膠原纖維，由肥大軟骨細胞特異性表達，被認為是軟骨細胞肥大的標志物[11]。本實驗中撕裂半月板和正常半月板相比CO L10A1表達水平上調，提示半月板撕裂后，可能部分纖維軟骨細胞轉變為肥大軟骨細胞，導致Ⅹ型膠原的合成量比正常半月板增多。病理組織切片發現撕裂半月板中開始出現空泡樣變細胞，提示它可能正向肥大軟骨細胞轉變。有研究發現軟骨細胞肥大對OA發展過程中軟骨退變有促進作用[12]，因此COL10A1表達升高從另一個角度提示了半月板撕裂后關節軟骨可能更容易發生退變。
CEBP-β是一種核轉錄因子，廣泛參與生理、病理代謝過程的調控。例如能促使軟骨細胞肥大，從而表達 MMP-13、 Ⅹ型膠原等[13]，還可通過顯著刺激MMP-3、 MMP-13和 ADAMTS-5的表達來降解軟骨中的 ECM，從而導致 OA的發生[14-16]。我們研究發現，撕裂半月板中 CEBP-β表達水平顯著上調，提示當半月板發生撕裂后，CEBP-β的合成會顯著增加，引起其下游的軟骨退變相關因子過表達，最終導致 OA的發生，即撕裂半月板中 CEBP-β表達上調可能與COL10A1、 MMP-13和 ADAMTS-5過表達有密切關系。
總之，我們研究發現當半月板撕裂后，半月板在病理組織學上有退變的相關表現，且其內軟骨退變相關基因表達發生了改變，這些細胞和分子代謝水平的內在變化，可能會加速半月板組織發生退變。且半月板中軟骨退變相關基因的表達異常，不僅提示半月板自身退變加速，而且合成的相關退變酶會釋放入關節腔，導致整個關節發生退變，從而發展為 OA。因此，撕裂半月板對軟骨退變有促進作用，且比正常半月板大。大量臨床研究發現半月板撕裂會顯著增加 OA發生率[17]，本實驗結果與其相符，為此類患者臨床上 OA的高發率提供了細胞分子學依據。
3.3 半月板軟骨退變相關miRNAs分析
miRNAs是一類內源性長度為19～25 nt的非編碼單鏈 RNA，廣泛存在于真核生物中，在轉錄后水平調控基因的表達[18]。目前越來越多的研究證實 miRNAs在調控 OA發生過程中起到重要作用。我們前期研究發現 miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p與軟骨生長發育相關，并且通過生物信息軟件對靶基因進行了預測，它們的共同靶基因可能包括：RUNX2，SOX4，CEBP-β，TGF-β1，BMP-2、6、7及SMAD-3、4、5等[19]。本次我們檢測了3種 miRNAs及潛在靶基因 CEBP-β，發現在撕裂半月板中 miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p表達均上調且有統計學意義，但CEBP-β卻沒有預想中的表達下調。可能是存在其他因素（包括 CEBP-β上游的調節因子）或者其他 miRNAs共同作用導致 CEBP-β最終表達呈上調趨勢。miRNAs在調控生理病理過程，并不是一對一簡單作用于對應靶基因，而是共同形成一個復雜精確的環路來達到調控目的。即一個 miRNA可以調控多個靶基因，同一靶基因可由數個 miRNAs共同作用。如本次檢測的3種 miRNAs還可以分別或共同調控其他靶基因，如 RUNX2，TGF-β1，BMP-2、6、7及SMAD-3、4、5等，來影響信號通路，使得ECM分解代謝增加，合成代謝減少，最終導致軟骨退變加速和 OA的發生。已有研究發現 miR-193b可通過抑制ACAN和Ⅱ型膠原基因的表達來破壞軟骨基質，促進軟骨細胞老化[20]。Swingler 等[21]研究表明miR-455通過抑制 SMAD-2、3通路來影響TGF-β信號傳導，促使軟骨細胞老化從而破壞軟骨導致 OA發生，本實驗結果與該結論一致。
本研究尚有局限性，如未充分考慮半月板撕裂類型、部位及患者個體情況，包括性別、身體質量指數及是否吸煙、喝酒等。目前半月板撕裂類型與關節軟骨損傷之間的關系尚存爭議，有研究認為半月板為較大的放射狀撕裂、桶柄狀撕裂和復合型撕裂時OA的發生率會更高[22]。也有學者認為半月板撕裂類型與軟骨損傷發生率沒有顯著聯系[23]。下一步研究擬增大樣本量，對患者按差異進行分組，充分考慮各方面情況。
綜上述，本研究從細胞分子水平探究撕裂半月板對軟骨退變的影響，結果提示半月板撕裂后，半月板組織有開始退變趨勢，其內軟骨退變相關基因表達變化可能加速了其退變。撕裂半月板對軟骨退變促進作用比正常半月板大。miR-193b、 miR-92a、 miR-455-3p可能和關節退變相關，可能是促進軟骨退變的調控因子。
