引用本文： 段鑫, 李偉, 項舟. 組織工程骨血管生成的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(2): 239-244. doi: 10.7507/1002-1892.20150050 復制
大段骨缺損修復是臨床難題，自體骨移植是骨缺損修復的金標準，但來源有限，且增加患者痛苦，尤其大段骨缺損修復中自體骨來源明顯受限[1]。近年來，隨著細胞基因技術和組織工程技術的發展，組織工程骨修復大段骨缺損研究也不斷深入。組織工程骨在體內存活的關鍵在于實現血管化、保證充足血供[2]，因此研發有效的血管化組織工程骨是目前亟待解決的問題。
在骨折修復過程中新生血管的形成早于成骨修復作用，目前普遍認為毛細血管在新骨形成中起重要作用，如在軟骨和骨痂形成新的微循環，同時帶入成骨細胞，形成新骨[3-4]。傳統的組織工程骨復合物由于缺乏血供，常發生骨中心壞死和移植失敗。還有研究發現，移植入體內的種子細胞只能靠周圍血管彌散獲取營養，死亡率極高，且體外培養的細胞-載體復合物很難培養出較厚的骨組織[5-6]。近年來，血管生成種子細胞與成骨種子細胞共培養體系在血管生成和骨再生中的作用愈發得到重視，而誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）和基因修飾技術的融入更是為組織工程骨血管化研究提供了新方向[7]。本文廣泛查閱近年關于種子細胞在組織工程骨血管化中的研究進展，從種子細胞來源、生物學特性、轉變機制、相關細胞因子及信號通路等方面對組織工程骨血管生成進行綜述。
1 血管生成種子細胞
血管生成是一個多因素、多環節作用過程，涉及一系列細胞和細胞因子信號網絡，主要包括兩種方式：血管發生和血管新生。前者是指中胚層內由內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化成血管內皮細胞（endothelial cells，ECs），形成原始血管網；后者是指以出芽方式從已存在的血管中長出新的毛細血管[8-9]。目前有較多研究針對組織工程骨血管生成，其經典模式是構建種子細胞-細胞因子-支架材料復合物植入體內，以達到促進成骨和血管生成的目的。
1.1 ECs
ECs在骨形成和修復過程中起著重要作用，ECs本身及產生的細胞因子等物質直接或間接參與了這一過程。ECs直接參與血管生成，且和成骨細胞關系密切，因此它在骨血管化過程中起著舉足輕重的作用。ECs和成骨細胞共培養體系是常見的血管化組織工程骨構建基礎，ECs可同時促進成骨細胞和破骨細胞及它們的前體細胞活化、分化及成熟，即其在加強成骨作用同時亦可能促進骨吸收，目前大多數研究認為其主要起著積極的促成骨作用[10-11]。ECs主要分為大血管來源和微血管來源，前者包括人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、隱靜脈、主動脈等，后者則從肺微血管、脂肪、真皮獲得。有研究將MSCs體外擴增并接種于微載體上，與ECs和/或成骨細胞共培養，發現ECs與成骨細胞1∶1混合后再與MSCs共培養能檢測到更多血管形成、骨形成標志物[12]。Ren等[13]將MSCs與HUVECs共植入一種仿生誘導膜，發現其在動物體內具有血管新生快、吻合好、成骨潛能佳的優點。研究顯示復合了ECs的組織工程骨修復骨缺損效果優于單純組織工程骨。Kaigler等[14]發現，單獨移植MSCs的骨形成量顯著少于ECs和MSCs共移植，認為ECs能直接作用于MSCs誘導成骨。ECs在VEGF誘導下可高表達BMP-2及BMP-4，而BMP-2對MSCs分化成骨具有促進作用[15-16]。Wenger等[17]將HUVECs種植于三維膠原支架材料上生長形成類球體，然后將人的成骨細胞直接接種于類球體的內皮細胞團上，結果觀察到兩種細胞在類球體內部形成了特殊的空間結構，且在VEGF及bFGF聯合作用下ECs可形成明顯的毛細血管結構；同時研究還發現，與成骨細胞共培養似乎抑制了ECs形成血管的能力，具體原因及機制仍需進一步研究。
1.2 EPCs
由于ECs體外培養要求高，在缺乏細胞因子和細胞外基質的條件下極易老化和死亡，大規模擴增難度大。能夠定向分化為ECs的EPCs，因其強大的增殖和全能分化潛能，有望替代ECs成為首選的血管化種子細胞[18-19]。
EPCs是ECs的前體細胞，主要存在于成體骨髓中，在某些特定情況下可被動員至外周血，富集在血管新生部位，增殖分化為ECs，參與血管再生[20]。除骨髓外，EPCs也可來源于臍帶血、脂肪組織和外周血等，臍帶血分離EPCs過程中因易受污染、分離存活率低、倫理道德尚存爭議，故應用受限；骨髓和脂肪來源EPCs數量有限且取材困難，應用均有一定困難；故目前多取材于外周血。Li等[21]發現，與 MSCs共培養的EPCs較單獨培養EPCs的ALP活性和磷酸鈣結節生成量均顯著增多，且骨生成和血管新生的標志物表達更多。Keramaris等[22]通過薈萃分析表明，在適當條件下EPCs和MSCs共培養有助于骨形成和血管形成。Seebach等[23]分別采用VEGF和MSCs、EPCs和MSCs混合進行體外實驗，EPCs和MSCs混合組顯示出強勁的血管新生能力。研究顯示在使用含有EPCs/MSCs的磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）和僅含有EPCs的TCP修復大塊骨缺損時，術后4周兩組均有骨生成，8周EPCs/MSCs組骨橋接形成顯著多于EPCs組，提示EPCs和MSCs在骨血管化早期發揮協同作用[24]。
1.3 胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）及iPS
ESCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，研究發現ESCs能夠定向分化為ECs參與血管生成，但其基因組不穩定、極易導致染色體畸變及腫瘤發生，故應用受限[25-26]。iPS是采用基因轉染技術將多能相關性基因導入宿主細胞（如成纖維細胞），誘導其“初始化”，成為與ESCs類似的細胞，再生醫學致力于采用自體成體細胞構建iPS，再定向誘導分化為ECs參與組織工程骨的血管生成。NF-κB信號通路在維持ESCs和iPS的未分化狀態中起重要作用。Takase等[27]發現NF-κB基因敲除的iPS無法誘導其發生初始化，成為類ESCs細胞。Ho等[28]在小鼠體內發現iPS重新編程的逐級過程受Wnt和Tcfs信號通路調控。Gong等[29]發現核小體組裝蛋白Nap1/1在iPS自我更新和定向分化中起著重要作用，這與Notch信號通路的傳導活動密不可分。此外，iPS和ESCs分化為ECs以及后續成血管過程還涉及MAPK、Hedgehog和VEGF等多條信號傳導通路[30-31]。iPS具有增殖能力強、分化潛能大、無免疫排斥反應和倫理道德爭議等優點，但其安全性和有效性仍待進一步研究[32]。
2 促血管化細胞因子及相關信號通路
2.1 VEGF
VEGF是血管形成的關鍵因子，主要作用于血管化早期，以ECs為靶細胞，促進原始血管網形成[33]。Jabbarzadeh等[34]采用轉染了腺病毒編碼的VEGF脂肪源性MSCs聯合ECs與三維聚乳酸乙醇酸支架材料復合誘導移植物的血管化，結果顯示生物材料內部有新生血管形成。VEGF/VEGF受體（VEGF receptor，VEGFR）信號通路在血管生成中起著重要作用，VEGF與VEGFR結合后形成二聚體并迅速刺激絡氨酸磷酸化，激活ERK和PI3K等細胞酶聯反應，誘導血管內皮金屬蛋白酶、凝血酶及整合素表達，并參與ECs抗凋亡機制調節，促進新的血管生成并維持其完整性[35-37]。Ko?等[38]將人成骨細胞接種于采用腺病毒載體編碼VEGF結合的多孔殼聚糖/羥基磷灰石支架，發現其具有較好的組織相容性，并且能夠使ECs富集于骨損傷部位，成骨和成血管效果均顯著加強。Ferretti等[39]通過體外實驗發現，采用VEGF刺激骨膜衍生祖細胞（periosteum-derived progenitor cells，PDPCs）結合ECs在成血管方面能夠取得更好的效果，認為這可能與多變的MAPK和PI3K/Akt信號通路有關。同時，Zhang等[40]將BMSCs與ECs共培養時，BMSCs可能通過PI3K/Akt調控VEGF因子參與活化的VEGFR1/2，進而影響ECs生物學活性，在成骨和成血管中起著重要作用。
2.2 血管生成素（angiopoietins，Ang）
Ang 表達于內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等多種細胞，主要作用于血管改建、塑形，促進血管網成熟。研究發現當VEGF成血管通路被阻斷后，Ang-1和Ang-2的表達水平將會大量增加，成為血管生成的后備通路[41]。Ang-1與受體Tie-2結合后可促使絡氨酸磷酸化，通過信號級聯反應增強內皮細胞抗凋亡能力，維持新生血管穩定。此外，還有實驗檢測到Ang-1/Tie-2信號軸的增強能夠上調ECs的VEGF表達水平，其與Notch信號通路密切相關[42-43]。Hou等[44]通過腺病毒基因修飾上調人BMSCs的VEGF和Ang-1表達水平，發現其成骨和成血管作用顯著增強。
2.3 FGF
FGF以ECs在內的多種細胞為靶細胞，既能促進ECs分裂，又能趨化ECs，具有強烈的促進血管生成作用[45]。Wenger等[17]通過構建成骨細胞-H UV ECs膠原支架三維模型發現，VEGF和bFGF可以增強ECs血管生成效率。FGF主要與VEGF形成共同信號通路，發揮促血管生成作用，其表達還受Notch信號通路調節，研究發現伴隨著Notch信號通路活性水平的上調，VEGF水平和毛細血管形成水平顯著上升[46-47]。Gothard等[48]提出目前組織工程骨構建的重點是獲取高效安全的體內材料，而聯合活性因子 FGF、PDGF、BMP-2、BMP-7/成骨蛋白1、 VEGF的生物材料是今后研究熱點。
2.4 BMP
BMP屬于TGF-β家族成員，可通過誘導VEGF等細胞因子的生成，間接促進血管化。它還能通過iPS分化為成軟骨細胞和成骨細胞，促進骨生成，同時還可上調VEGF表達，促進血管生成[49-50]。薈萃分析表明，MSCs、ECs聯合BMP構建的組織工程骨具有較高的成血管作用[48]。骨折局部的ECs在機械作用、VEGF、缺氧環境等情況下可高表達BMP-2及BMP-4，從而刺激成骨細胞分化參與骨折修復，ECs可以促進MSCs向成骨源性細胞分化，其主要機制可能是ECs分泌的BMP-2對MSCs起調控分化作用[14-15]。有研究者將BMP-2轉染MSCs復合可降解生物支架材料用于骨缺損的血管化研究，結果表明結合BMP-2基因轉染能夠上調VEGF的表達，間接誘導移植物血管化，增加種子細胞活力，從而加速新骨形成[51]。
3 種子細胞-細胞因子-支架材料體系促進血管化
血管形成是一個復雜過程，供血系統在骨修復、再生過程中具有重要意義，骨生成和血管化相輔相成，血管系統為成骨提供必需的營養物質并參與代謝物質轉運，其中有多種細胞因子的參與，因此大量研究將細胞因子、種子細胞聯合接種于支架材料上，以期優化血管形成的效率。最常見的共培養組合包括：ECs和成骨細胞、ECs和MSCs、EPCs和MSCs、EPCs和成骨細胞。近年來，大量研究對共培養體系的細胞濃度、接種順序、培養基成分、培養條件等進行探索，取得了可喜成果。Guerrero等[52]將MSCs和EPCs共培養體系接種于添加VEGF等細胞因子的普魯蘭多糖-葡聚糖支架，發現體外模型能夠上調成骨標志物（ALP、Runx2、骨鈣素、BMP-2）、成血管標志物（CD31、VEGF-R2）和縫隙連接蛋白Connexin-43的表達水平；且體內實驗也表明細胞共培養支架復合物植入動物后，實驗組較對照組有更多類骨質形成。近年來，納米技術的不斷進展使其在組織工程中的應用也日益廣泛。Liu等[53]和Kim等[54]分別在納米纖維支架上接種MSCs-ECs-VEGF-TGF-β和MSCs-UVECs-VEGF細胞共培養體系，均獲良好成血管效果。利用納米技術、顯微制造技術和計算機輔助設計、制造技術在體外合成血管化組織工程骨，或可成為組織工程骨血管化發展的一個新方向[55-56]。隨著基因工程技術的發展，骨組織工程血管化研究中引用基因轉染技術，將具有顯著成骨及促血管分化作用的細胞因子外源基因通過病毒或非病毒載體導入種子細胞，使其在細胞的增殖分化過程中穩定表達并發揮促成骨和促血管生成作用。目前，VEGF和Ang-1雙基因轉染成為國內外研究熱點，Klopper等[57]將同時編碼VEGF和Ang-1的腺病毒載體轉染MSCs，結果顯示其可加速EPCs增殖，接種于人工骨支架材料后對兔跟腱缺損修復療效也較好。
4 顯微外科技術增效
將顯微外科和組織工程骨構建相結合，可通過局部轉移和顯微外科血管吻合的方法，在建立新生骨組織的同時提供充足血供，主要包括血管術植入、血管蒂筋膜包裹術和帶肌肉骨瓣等手段[58]。研究發現，采用鼠隱血管術植入能夠顯著促進局部血管生成和骨生成[59]。Viateau等[60]將中空的復合MSCs的珊瑚陶瓷植入大鼠大腿肌袋中，分離股動靜脈將其植入支架材料的管道內，發現血管束植入明顯促進了細胞-材料復合物的血管化及成骨能力。Ren等[59]采用干細胞、支架材料、生長因子以及動靜脈環構建大塊血管化組織工程骨皮瓣，用顯微外科技術植入骨缺損部位，修復效果良好，進一步證實了該項技術應用于大塊骨缺損修復的可行性。
5 展望
血管化是目前骨組織工程面臨的最大難題，現有方法均存在一定不足。以顯微外科技術為基礎的方法最為接近臨床應用，但無論是血管術植入，還是血管蒂筋膜包裹都可能增加手術次數和感染風險，且血管來源有限，不適于臨床推廣應用。由于ECs體外培養要求高，在缺乏細胞因子和細胞外基質的條件下極易老化和死亡，故現有研究多采用EPCs定向分化為ECs實現血管生成，但離臨床應用仍有距離。細胞因子若直接應用極易降解，效果不佳；若采用基因轉染則可實現細胞因子的持續高表達，但又涉及一系列信號網絡；雖有研究采用支架材料來控制細胞因子釋放速率，但對于最佳劑量和釋放時間均有待進一步研究。
iPS具有多向分化能力，在不同誘導條件下能分化為骨細胞、軟骨細胞，在VEGF誘導下還可向ECs分化，可以考慮將其作為骨生成和血管生成共同的種子細胞，探索出合理的誘導條件，使其定向分化為內皮細胞和骨細胞，以達到成骨、成血管目的。此外，VEGF和Ang-1雙轉染自體EPCs與MSCs共培養，可促進MSCs向ECs分化，MSCs分泌的細胞因子再反過來促進EPCs增殖以及血管形成，也將有可能成為實現組織工程骨血管化的方法之一。
總之，要實現更為復雜、真正的血管化組織工程骨還任重道遠，基于種子細胞在組織工程骨血管化中的研究可為實現這一目標奠定堅實基礎。
大段骨缺損修復是臨床難題，自體骨移植是骨缺損修復的金標準，但來源有限，且增加患者痛苦，尤其大段骨缺損修復中自體骨來源明顯受限[1]。近年來，隨著細胞基因技術和組織工程技術的發展，組織工程骨修復大段骨缺損研究也不斷深入。組織工程骨在體內存活的關鍵在于實現血管化、保證充足血供[2]，因此研發有效的血管化組織工程骨是目前亟待解決的問題。
在骨折修復過程中新生血管的形成早于成骨修復作用，目前普遍認為毛細血管在新骨形成中起重要作用，如在軟骨和骨痂形成新的微循環，同時帶入成骨細胞，形成新骨[3-4]。傳統的組織工程骨復合物由于缺乏血供，常發生骨中心壞死和移植失敗。還有研究發現，移植入體內的種子細胞只能靠周圍血管彌散獲取營養，死亡率極高，且體外培養的細胞-載體復合物很難培養出較厚的骨組織[5-6]。近年來，血管生成種子細胞與成骨種子細胞共培養體系在血管生成和骨再生中的作用愈發得到重視，而誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）和基因修飾技術的融入更是為組織工程骨血管化研究提供了新方向[7]。本文廣泛查閱近年關于種子細胞在組織工程骨血管化中的研究進展，從種子細胞來源、生物學特性、轉變機制、相關細胞因子及信號通路等方面對組織工程骨血管生成進行綜述。
1 血管生成種子細胞
血管生成是一個多因素、多環節作用過程，涉及一系列細胞和細胞因子信號網絡，主要包括兩種方式：血管發生和血管新生。前者是指中胚層內由內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化成血管內皮細胞（endothelial cells，ECs），形成原始血管網；后者是指以出芽方式從已存在的血管中長出新的毛細血管[8-9]。目前有較多研究針對組織工程骨血管生成，其經典模式是構建種子細胞-細胞因子-支架材料復合物植入體內，以達到促進成骨和血管生成的目的。
1.1 ECs
ECs在骨形成和修復過程中起著重要作用，ECs本身及產生的細胞因子等物質直接或間接參與了這一過程。ECs直接參與血管生成，且和成骨細胞關系密切，因此它在骨血管化過程中起著舉足輕重的作用。ECs和成骨細胞共培養體系是常見的血管化組織工程骨構建基礎，ECs可同時促進成骨細胞和破骨細胞及它們的前體細胞活化、分化及成熟，即其在加強成骨作用同時亦可能促進骨吸收，目前大多數研究認為其主要起著積極的促成骨作用[10-11]。ECs主要分為大血管來源和微血管來源，前者包括人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、隱靜脈、主動脈等，后者則從肺微血管、脂肪、真皮獲得。有研究將MSCs體外擴增并接種于微載體上，與ECs和/或成骨細胞共培養，發現ECs與成骨細胞1∶1混合后再與MSCs共培養能檢測到更多血管形成、骨形成標志物[12]。Ren等[13]將MSCs與HUVECs共植入一種仿生誘導膜，發現其在動物體內具有血管新生快、吻合好、成骨潛能佳的優點。研究顯示復合了ECs的組織工程骨修復骨缺損效果優于單純組織工程骨。Kaigler等[14]發現，單獨移植MSCs的骨形成量顯著少于ECs和MSCs共移植，認為ECs能直接作用于MSCs誘導成骨。ECs在VEGF誘導下可高表達BMP-2及BMP-4，而BMP-2對MSCs分化成骨具有促進作用[15-16]。Wenger等[17]將HUVECs種植于三維膠原支架材料上生長形成類球體，然后將人的成骨細胞直接接種于類球體的內皮細胞團上，結果觀察到兩種細胞在類球體內部形成了特殊的空間結構，且在VEGF及bFGF聯合作用下ECs可形成明顯的毛細血管結構；同時研究還發現，與成骨細胞共培養似乎抑制了ECs形成血管的能力，具體原因及機制仍需進一步研究。
1.2 EPCs
由于ECs體外培養要求高，在缺乏細胞因子和細胞外基質的條件下極易老化和死亡，大規模擴增難度大。能夠定向分化為ECs的EPCs，因其強大的增殖和全能分化潛能，有望替代ECs成為首選的血管化種子細胞[18-19]。
EPCs是ECs的前體細胞，主要存在于成體骨髓中，在某些特定情況下可被動員至外周血，富集在血管新生部位，增殖分化為ECs，參與血管再生[20]。除骨髓外，EPCs也可來源于臍帶血、脂肪組織和外周血等，臍帶血分離EPCs過程中因易受污染、分離存活率低、倫理道德尚存爭議，故應用受限；骨髓和脂肪來源EPCs數量有限且取材困難，應用均有一定困難；故目前多取材于外周血。Li等[21]發現，與 MSCs共培養的EPCs較單獨培養EPCs的ALP活性和磷酸鈣結節生成量均顯著增多，且骨生成和血管新生的標志物表達更多。Keramaris等[22]通過薈萃分析表明，在適當條件下EPCs和MSCs共培養有助于骨形成和血管形成。Seebach等[23]分別采用VEGF和MSCs、EPCs和MSCs混合進行體外實驗，EPCs和MSCs混合組顯示出強勁的血管新生能力。研究顯示在使用含有EPCs/MSCs的磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）和僅含有EPCs的TCP修復大塊骨缺損時，術后4周兩組均有骨生成，8周EPCs/MSCs組骨橋接形成顯著多于EPCs組，提示EPCs和MSCs在骨血管化早期發揮協同作用[24]。
1.3 胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）及iPS
ESCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，研究發現ESCs能夠定向分化為ECs參與血管生成，但其基因組不穩定、極易導致染色體畸變及腫瘤發生，故應用受限[25-26]。iPS是采用基因轉染技術將多能相關性基因導入宿主細胞（如成纖維細胞），誘導其“初始化”，成為與ESCs類似的細胞，再生醫學致力于采用自體成體細胞構建iPS，再定向誘導分化為ECs參與組織工程骨的血管生成。NF-κB信號通路在維持ESCs和iPS的未分化狀態中起重要作用。Takase等[27]發現NF-κB基因敲除的iPS無法誘導其發生初始化，成為類ESCs細胞。Ho等[28]在小鼠體內發現iPS重新編程的逐級過程受Wnt和Tcfs信號通路調控。Gong等[29]發現核小體組裝蛋白Nap1/1在iPS自我更新和定向分化中起著重要作用，這與Notch信號通路的傳導活動密不可分。此外，iPS和ESCs分化為ECs以及后續成血管過程還涉及MAPK、Hedgehog和VEGF等多條信號傳導通路[30-31]。iPS具有增殖能力強、分化潛能大、無免疫排斥反應和倫理道德爭議等優點，但其安全性和有效性仍待進一步研究[32]。
2 促血管化細胞因子及相關信號通路
2.1 VEGF
VEGF是血管形成的關鍵因子，主要作用于血管化早期，以ECs為靶細胞，促進原始血管網形成[33]。Jabbarzadeh等[34]采用轉染了腺病毒編碼的VEGF脂肪源性MSCs聯合ECs與三維聚乳酸乙醇酸支架材料復合誘導移植物的血管化，結果顯示生物材料內部有新生血管形成。VEGF/VEGF受體（VEGF receptor，VEGFR）信號通路在血管生成中起著重要作用，VEGF與VEGFR結合后形成二聚體并迅速刺激絡氨酸磷酸化，激活ERK和PI3K等細胞酶聯反應，誘導血管內皮金屬蛋白酶、凝血酶及整合素表達，并參與ECs抗凋亡機制調節，促進新的血管生成并維持其完整性[35-37]。Ko?等[38]將人成骨細胞接種于采用腺病毒載體編碼VEGF結合的多孔殼聚糖/羥基磷灰石支架，發現其具有較好的組織相容性，并且能夠使ECs富集于骨損傷部位，成骨和成血管效果均顯著加強。Ferretti等[39]通過體外實驗發現，采用VEGF刺激骨膜衍生祖細胞（periosteum-derived progenitor cells，PDPCs）結合ECs在成血管方面能夠取得更好的效果，認為這可能與多變的MAPK和PI3K/Akt信號通路有關。同時，Zhang等[40]將BMSCs與ECs共培養時，BMSCs可能通過PI3K/Akt調控VEGF因子參與活化的VEGFR1/2，進而影響ECs生物學活性，在成骨和成血管中起著重要作用。
2.2 血管生成素（angiopoietins，Ang）
Ang 表達于內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等多種細胞，主要作用于血管改建、塑形，促進血管網成熟。研究發現當VEGF成血管通路被阻斷后，Ang-1和Ang-2的表達水平將會大量增加，成為血管生成的后備通路[41]。Ang-1與受體Tie-2結合后可促使絡氨酸磷酸化，通過信號級聯反應增強內皮細胞抗凋亡能力，維持新生血管穩定。此外，還有實驗檢測到Ang-1/Tie-2信號軸的增強能夠上調ECs的VEGF表達水平，其與Notch信號通路密切相關[42-43]。Hou等[44]通過腺病毒基因修飾上調人BMSCs的VEGF和Ang-1表達水平，發現其成骨和成血管作用顯著增強。
2.3 FGF
FGF以ECs在內的多種細胞為靶細胞，既能促進ECs分裂，又能趨化ECs，具有強烈的促進血管生成作用[45]。Wenger等[17]通過構建成骨細胞-H UV ECs膠原支架三維模型發現，VEGF和bFGF可以增強ECs血管生成效率。FGF主要與VEGF形成共同信號通路，發揮促血管生成作用，其表達還受Notch信號通路調節，研究發現伴隨著Notch信號通路活性水平的上調，VEGF水平和毛細血管形成水平顯著上升[46-47]。Gothard等[48]提出目前組織工程骨構建的重點是獲取高效安全的體內材料，而聯合活性因子 FGF、PDGF、BMP-2、BMP-7/成骨蛋白1、 VEGF的生物材料是今后研究熱點。
2.4 BMP
BMP屬于TGF-β家族成員，可通過誘導VEGF等細胞因子的生成，間接促進血管化。它還能通過iPS分化為成軟骨細胞和成骨細胞，促進骨生成，同時還可上調VEGF表達，促進血管生成[49-50]。薈萃分析表明，MSCs、ECs聯合BMP構建的組織工程骨具有較高的成血管作用[48]。骨折局部的ECs在機械作用、VEGF、缺氧環境等情況下可高表達BMP-2及BMP-4，從而刺激成骨細胞分化參與骨折修復，ECs可以促進MSCs向成骨源性細胞分化，其主要機制可能是ECs分泌的BMP-2對MSCs起調控分化作用[14-15]。有研究者將BMP-2轉染MSCs復合可降解生物支架材料用于骨缺損的血管化研究，結果表明結合BMP-2基因轉染能夠上調VEGF的表達，間接誘導移植物血管化，增加種子細胞活力，從而加速新骨形成[51]。
3 種子細胞-細胞因子-支架材料體系促進血管化
血管形成是一個復雜過程，供血系統在骨修復、再生過程中具有重要意義，骨生成和血管化相輔相成，血管系統為成骨提供必需的營養物質并參與代謝物質轉運，其中有多種細胞因子的參與，因此大量研究將細胞因子、種子細胞聯合接種于支架材料上，以期優化血管形成的效率。最常見的共培養組合包括：ECs和成骨細胞、ECs和MSCs、EPCs和MSCs、EPCs和成骨細胞。近年來，大量研究對共培養體系的細胞濃度、接種順序、培養基成分、培養條件等進行探索，取得了可喜成果。Guerrero等[52]將MSCs和EPCs共培養體系接種于添加VEGF等細胞因子的普魯蘭多糖-葡聚糖支架，發現體外模型能夠上調成骨標志物（ALP、Runx2、骨鈣素、BMP-2）、成血管標志物（CD31、VEGF-R2）和縫隙連接蛋白Connexin-43的表達水平；且體內實驗也表明細胞共培養支架復合物植入動物后，實驗組較對照組有更多類骨質形成。近年來，納米技術的不斷進展使其在組織工程中的應用也日益廣泛。Liu等[53]和Kim等[54]分別在納米纖維支架上接種MSCs-ECs-VEGF-TGF-β和MSCs-UVECs-VEGF細胞共培養體系，均獲良好成血管效果。利用納米技術、顯微制造技術和計算機輔助設計、制造技術在體外合成血管化組織工程骨，或可成為組織工程骨血管化發展的一個新方向[55-56]。隨著基因工程技術的發展，骨組織工程血管化研究中引用基因轉染技術，將具有顯著成骨及促血管分化作用的細胞因子外源基因通過病毒或非病毒載體導入種子細胞，使其在細胞的增殖分化過程中穩定表達并發揮促成骨和促血管生成作用。目前，VEGF和Ang-1雙基因轉染成為國內外研究熱點，Klopper等[57]將同時編碼VEGF和Ang-1的腺病毒載體轉染MSCs，結果顯示其可加速EPCs增殖，接種于人工骨支架材料后對兔跟腱缺損修復療效也較好。
4 顯微外科技術增效
將顯微外科和組織工程骨構建相結合，可通過局部轉移和顯微外科血管吻合的方法，在建立新生骨組織的同時提供充足血供，主要包括血管術植入、血管蒂筋膜包裹術和帶肌肉骨瓣等手段[58]。研究發現，采用鼠隱血管術植入能夠顯著促進局部血管生成和骨生成[59]。Viateau等[60]將中空的復合MSCs的珊瑚陶瓷植入大鼠大腿肌袋中，分離股動靜脈將其植入支架材料的管道內，發現血管束植入明顯促進了細胞-材料復合物的血管化及成骨能力。Ren等[59]采用干細胞、支架材料、生長因子以及動靜脈環構建大塊血管化組織工程骨皮瓣，用顯微外科技術植入骨缺損部位，修復效果良好，進一步證實了該項技術應用于大塊骨缺損修復的可行性。
5 展望
血管化是目前骨組織工程面臨的最大難題，現有方法均存在一定不足。以顯微外科技術為基礎的方法最為接近臨床應用，但無論是血管術植入，還是血管蒂筋膜包裹都可能增加手術次數和感染風險，且血管來源有限，不適于臨床推廣應用。由于ECs體外培養要求高，在缺乏細胞因子和細胞外基質的條件下極易老化和死亡，故現有研究多采用EPCs定向分化為ECs實現血管生成，但離臨床應用仍有距離。細胞因子若直接應用極易降解，效果不佳；若采用基因轉染則可實現細胞因子的持續高表達，但又涉及一系列信號網絡；雖有研究采用支架材料來控制細胞因子釋放速率，但對于最佳劑量和釋放時間均有待進一步研究。
iPS具有多向分化能力，在不同誘導條件下能分化為骨細胞、軟骨細胞，在VEGF誘導下還可向ECs分化，可以考慮將其作為骨生成和血管生成共同的種子細胞，探索出合理的誘導條件，使其定向分化為內皮細胞和骨細胞，以達到成骨、成血管目的。此外，VEGF和Ang-1雙轉染自體EPCs與MSCs共培養，可促進MSCs向ECs分化，MSCs分泌的細胞因子再反過來促進EPCs增殖以及血管形成，也將有可能成為實現組織工程骨血管化的方法之一。
總之，要實現更為復雜、真正的血管化組織工程骨還任重道遠，基于種子細胞在組織工程骨血管化中的研究可為實現這一目標奠定堅實基礎。