引用本文： 王永成, 孟昊業, 袁雪凌, 彭江, 郭全義, 盧世璧, 汪愛媛. 兔骨軟骨缺損自發性修復模型中軟骨下骨重塑與軟骨再生的關系. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 681-686. doi: 10.7507/1002-1892.20140151 復制
關節軟骨和軟骨下骨是相互依賴又相互作用、既獨立又統一的功能單位，軟骨下骨承受著來自軟骨向下傳導的應力負荷，兩者在解剖結構上緊密相連，在生物學功能上相互影響[1]。軟骨下骨的完整性是否受到破壞是骨軟骨損傷的標志[2]。既往研究表明，軟骨下骨在骨關節炎（osteoarthritis，OA）的發生發展中與軟骨退變密切聯系，兩種組織均發生變化且在空間結構上相關，骨量的最大改變位于骨-軟骨界面處[1, 3-5]。目前已有實驗研究關注到骨軟骨損傷模型或進行骨髓刺激技術后發生的自發性軟骨修復[6-8]，但關于兩者反應關系的機制尚不明確。僅有少數動物實驗研究描述了骨軟骨損傷中軟骨下骨板的遷移現象[6, 8]，但缺乏體內軟骨下骨重塑的定量研究。因此，本實驗通過監測不同時期兔骨軟骨缺損自發性修復模型中軟骨下骨的微觀結構變化，探討軟骨下骨重塑在骨軟骨損傷中的作用以及與軟骨再生之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡健康雄性新西蘭大白兔24只，體重1.8～ 2.5 kg，由解放軍總醫院動物實驗中心提供，實驗方案經解放軍總醫院動物實驗管理委員會批準。
番紅O、甲苯胺藍染色劑（Sigma公司，美國）；鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體（Calbiochem公司，美國）；免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。BX-51顯微鏡、DP70圖像采集系統（Olympus 公司，日本）；Locus eXplore micro-CT、MicroView圖像分析處理軟件（GE公司，美國）。
1.2 骨軟骨缺損自發性修復模型建立
取大白兔24只，術前30 min肌肉注射抗生素。肌肉注射20%鹽酸塞拉嗪注射液（2 mL/kg）麻醉，沿單側膝部髕骨內側緣行2 cm縱切口，將髕骨牽向外側，顯露髕股關節面。檢查膝關節腔無積液或粘連，關節軟骨平坦、色澤正常后，用直徑4 mm環鉆在膝關節屈曲90°時髕骨所對應股骨內、外側髁間關節面中部作一直徑4 mm、深約3 mm的骨軟骨缺損。術中見缺損區出血即可，不作任何干預，將髕骨復位后，逐層閉合關節囊和皮膚切口。術后動物單籠飼養，不行術肢外固定，自由活動、取食；術后第 2 天使用抗生素，防止腹瀉及感染。于術后1、4、12、24周，采用耳緣靜脈空氣栓塞法各處死6只動物，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
剖開關節腔，顯露髕股關節面，觀察缺損填充、邊緣修復情況、軟骨表面平整度、新生軟骨顏色等，評價術后自發性修復效果。
1.3.2 micro-CT掃描
大體觀察后對標本行micro-CT掃描，分辨率27 μm，掃描時間40 min/次。對掃描結果用標準體模校準后，以缺損區為中心，建立圓柱體（直徑4 mm、高3 mm）三維興趣區（region of interest，ROI），保證ROI內均為缺損區的修復組織。再次重建圖像后輸入MicroView圖像分析處理軟件，選取斷層掃描中軟骨下骨缺損最大的層面采集二維圖像，對相應的ROI進行三維重建后獲得三維圖像，并計算軟骨下骨組織形態計量學參數：骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）、組織礦化密度（tissue mineralized density，TMD）、骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙寬度（trabecula spacing，Tb.Sp）、骨小梁數量（trabecula number，Tb.N）。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
micro-CT掃描結束后用4%多聚甲醛固定標本1周，10%EDTA脫鈣后，常規石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE、番紅O、甲苯胺藍染色，并采用S-P法行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，光鏡下觀察，根據國際軟骨修復協會（ICRS）組織學評分標準[9]評分。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；對各時間點軟骨修復組織學評分與軟骨下骨的組織形態計量學各參數進行Pearson相關分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗動物切口愈合良好，無紅腫及滲出。各時間點關節腔內無炎癥、滲出，關節囊無增厚、攣縮，滑膜無粘連、水腫。術后1周，缺損區凹陷，被血凝塊填充，與周邊界限明顯（圖 1 a）；4周，缺損區大部分被填充，與周邊仍有界限，表面不平整（圖 1 b）；12周，缺損區已基本被修復組織填充，與周圍軟骨整合尚可，表面略粗糙，新生組織顏色暗淡（圖 1 c）；24周，缺損區已完全被白色軟骨樣組織填充，與周圍軟骨整合較好，關節表面平整（圖 1 d）。
圖1
術后各時間點大體觀察 ? 1周 ? 4周 ? 12周 ? 24周 ? ?2.2 micro-CT掃描觀察
二維圖像觀察示，隨著修復時間推移，缺損區內軟骨下骨板逐漸向上遷移（圖 2）。三維圖像觀察示，隨著修復時間推移，BMD、BVF、TMD、Tb.N、Tb.Th均逐漸增加，而Tb.Sp逐漸下降，除Tb.Th術后4、12周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各指標各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、表 1。
2.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
組織學觀察示，術后1周，缺損區下陷，軟骨下骨未形成，基質染色無異染；4周，缺損區以纖維組織填充為主，表層不連續，交界處有裂隙，軟骨基質染色淺，軟骨下骨區以纖維組織為主；12周，缺損區仍以纖維軟骨細胞為主，表層不規則，兩側整合良好，軟骨基質染色淡，軟骨下骨區出現顆粒狀骨化現象；24周，修復組織以纖維軟骨細胞為主，表層仍欠平滑，但在與正常軟骨交界處有部分透明軟骨形成，軟骨基質染色中等，兩側整合良好，基質染色欠均勻，軟骨厚度約為正常軟骨的 2/3，軟骨下骨重建加快，偶可見潮線形成或軟骨下骨板重塑完成。免疫組織化學染色示，隨著修復時間推移，Ⅱ型膠原染色逐漸開始表達，但24周時仍呈弱陽性。見圖 4。
圖4
術后各時間點組織學及免疫組織化學染色觀察 （× 40） 從左至右依次為HE、番紅O、甲苯胺藍和Ⅱ型膠原染色 ? 1周 ? 4周 ? 12周 ? 24周
Figure4.
Histological and immunohistochemical observations at each time point after operation (× 40) Displayed staining from left to right: HE,safranin O,toluidine blue,and collagen type Ⅱ ? One week ? Four weeks ? Twelve weeks ? Twenty-four weeks
隨修復時間推移，術后標本ICRS組織學評分逐漸增加，除4周與12周比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。軟骨下骨組織形態計量學參數中，除Tb.Sp與ICRS組織學評分成負相關（r= -0.584，P=0.039）外，BVF（r=0.680，P=0.042）、BMD（r=0.759，P=0.036）、TMD（r=0.792，P=0.034）、Tb.Th（r=0.714，P=0.030）及Tb.N（r=0.891，P=0.011）均與其成正相關。
表1
術后各時間點關節軟骨修復組織形態計量學參數及組織學評分（n=6，3 討論
關節軟骨損傷大體分為3種類型：部分軟骨損傷、全層軟骨損傷和骨軟骨損傷。其中部分軟骨損傷只涉及關節透明軟骨，全層軟骨損傷則會影響到鈣化軟骨水平，而軟骨下骨完整性是否受到破壞是骨軟骨損傷的標志[2]。臨床關節軟骨損傷的患者中，骨軟骨損傷約占5%[10]，其主要由4種獨立病因引起，包括創傷性骨軟骨骨折、骨關節炎、骨壞死和剝脫性骨軟骨炎[11]。基于病因的多樣化及其修復過程的復雜性，迄今為止，臨床上雖有多種方法治療，但仍未獲得滿意遠期療效。
本研究通過構建兔骨軟骨缺損模型，采用連續時間點觀察缺損區的自發性修復效果。結果顯示，骨軟骨損傷自然修復進程中，軟骨下骨重塑具有顯著的時序性。隨著修復時間推移，骨組織形態計量學相關參數均表明軟骨下骨重塑逐漸增加，微觀結構存在顯著變化。在修復初期，軟骨下骨板位于正常位置下方，至24周時已恢復至正常水平；軟骨組織的修復也隨時間推移逐步改善，但最終并未恢復至正常形態，以纖維組織覆蓋為主，透明軟骨少見；從而表明在自發性修復模型中軟骨下骨重塑與軟骨再生修復的進程并不同步。另一方面，本研究也發現，關節軟骨的修復與軟骨下骨重塑的形態計量學各指標間均具有顯著相關性。既往有研究表明[8]，兔軟骨損傷模型中行軟骨下骨鉆孔術組比未處理組軟骨下骨板顯著增厚，認為這種現象是由于軟骨深層的組織化生所致。另外也有研究證實[12-13]，骨軟骨損傷區內的骨再生是由于新生血管形成和生長因子的作用，如TGF-β1、BMP、VEGF等。另外，Lyons等[14]指出，潮線是骨軟骨界面形成的標志，對軟骨下骨重塑也存在重要影響。而在本實驗模型中，由于骨軟骨缺損已破壞了潮線，此時損傷一般會累及骨小梁，并深達骨髓，軟骨下骨滲透的血液會填充缺損區，從而啟動炎性修復進程；同時局部凝血形成纖維蛋白凝集，可在修復過程中起支架作用，骨髓血中的BMSCs也將分化為軟骨細胞進行修復。而這種修復方式是一種“自下而上”的修復，下層軟骨下骨重塑一旦完成，上層獲得的干細胞、生長因子和營養物質將逐漸減少，導致軟骨修復不能順利完成[15]。此外有臨床研究顯示，既往接受過骨髓刺激技術治療的軟骨損傷患者，遠期會發生軟骨下骨硬化，導致自體軟骨細胞移植術失敗率增加[16]。
組織工程技術的發展為骨軟骨損傷修復提供了新選擇，然而有研究報道，應用該技術修復骨軟骨缺損時常伴軟骨細胞的“終末分化”現象，繼而出現軟骨內骨化導致新生軟骨退變[12, 17]。另一方面，從骨髓腔募集至缺損區的BMSCs，經常發生不可控制的分化，從而上調相關生化標志物和基質酶表達，導致軟骨細胞逐漸肥大、鈣化、骨化及軟骨基質降解[18-19]。有學者建議，在植入關節軟骨細胞或其他移植物修復骨軟骨缺損時，加入抗血管生成因子chondromodulin-1和thrombospondin-1，可能防止軟骨下骨的過度生長，從而促進透明軟骨再生[12, 20]。由此可見，軟骨下骨的變化在骨軟骨損傷的發生及修復進程中扮演著重要角色[21]。
綜上述，本研究結果顯示，軟骨修復與軟骨下骨重塑既密切相關又獨立發生，軟骨下骨的快速重塑可能負面影響關節軟骨修復效果。我們強調軟骨下骨在骨軟骨缺損的自然進程及修復治療中的臨床重要性，但仍需要更長期的觀察及力學性能評估。下一步將致力于應用組織工程策略構建含有骨軟骨界面的一體化材料，結合藥物調控軟骨下骨重塑進程，以促進骨軟骨損傷的功能性修復。
關節軟骨和軟骨下骨是相互依賴又相互作用、既獨立又統一的功能單位，軟骨下骨承受著來自軟骨向下傳導的應力負荷，兩者在解剖結構上緊密相連，在生物學功能上相互影響[1]。軟骨下骨的完整性是否受到破壞是骨軟骨損傷的標志[2]。既往研究表明，軟骨下骨在骨關節炎（osteoarthritis，OA）的發生發展中與軟骨退變密切聯系，兩種組織均發生變化且在空間結構上相關，骨量的最大改變位于骨-軟骨界面處[1, 3-5]。目前已有實驗研究關注到骨軟骨損傷模型或進行骨髓刺激技術后發生的自發性軟骨修復[6-8]，但關于兩者反應關系的機制尚不明確。僅有少數動物實驗研究描述了骨軟骨損傷中軟骨下骨板的遷移現象[6, 8]，但缺乏體內軟骨下骨重塑的定量研究。因此，本實驗通過監測不同時期兔骨軟骨缺損自發性修復模型中軟骨下骨的微觀結構變化，探討軟骨下骨重塑在骨軟骨損傷中的作用以及與軟骨再生之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡健康雄性新西蘭大白兔24只，體重1.8～ 2.5 kg，由解放軍總醫院動物實驗中心提供，實驗方案經解放軍總醫院動物實驗管理委員會批準。
番紅O、甲苯胺藍染色劑（Sigma公司，美國）；鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體（Calbiochem公司，美國）；免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。BX-51顯微鏡、DP70圖像采集系統（Olympus 公司，日本）；Locus eXplore micro-CT、MicroView圖像分析處理軟件（GE公司，美國）。
1.2 骨軟骨缺損自發性修復模型建立
取大白兔24只，術前30 min肌肉注射抗生素。肌肉注射20%鹽酸塞拉嗪注射液（2 mL/kg）麻醉，沿單側膝部髕骨內側緣行2 cm縱切口，將髕骨牽向外側，顯露髕股關節面。檢查膝關節腔無積液或粘連，關節軟骨平坦、色澤正常后，用直徑4 mm環鉆在膝關節屈曲90°時髕骨所對應股骨內、外側髁間關節面中部作一直徑4 mm、深約3 mm的骨軟骨缺損。術中見缺損區出血即可，不作任何干預，將髕骨復位后，逐層閉合關節囊和皮膚切口。術后動物單籠飼養，不行術肢外固定，自由活動、取食；術后第 2 天使用抗生素，防止腹瀉及感染。于術后1、4、12、24周，采用耳緣靜脈空氣栓塞法各處死6只動物，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
剖開關節腔，顯露髕股關節面，觀察缺損填充、邊緣修復情況、軟骨表面平整度、新生軟骨顏色等，評價術后自發性修復效果。
1.3.2 micro-CT掃描
大體觀察后對標本行micro-CT掃描，分辨率27 μm，掃描時間40 min/次。對掃描結果用標準體模校準后，以缺損區為中心，建立圓柱體（直徑4 mm、高3 mm）三維興趣區（region of interest，ROI），保證ROI內均為缺損區的修復組織。再次重建圖像后輸入MicroView圖像分析處理軟件，選取斷層掃描中軟骨下骨缺損最大的層面采集二維圖像，對相應的ROI進行三維重建后獲得三維圖像，并計算軟骨下骨組織形態計量學參數：骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）、組織礦化密度（tissue mineralized density，TMD）、骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙寬度（trabecula spacing，Tb.Sp）、骨小梁數量（trabecula number，Tb.N）。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
micro-CT掃描結束后用4%多聚甲醛固定標本1周，10%EDTA脫鈣后，常規石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE、番紅O、甲苯胺藍染色，并采用S-P法行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，光鏡下觀察，根據國際軟骨修復協會（ICRS）組織學評分標準[9]評分。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；對各時間點軟骨修復組織學評分與軟骨下骨的組織形態計量學各參數進行Pearson相關分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗動物切口愈合良好，無紅腫及滲出。各時間點關節腔內無炎癥、滲出，關節囊無增厚、攣縮，滑膜無粘連、水腫。術后1周，缺損區凹陷，被血凝塊填充，與周邊界限明顯（圖 1 a）；4周，缺損區大部分被填充，與周邊仍有界限，表面不平整（圖 1 b）；12周，缺損區已基本被修復組織填充，與周圍軟骨整合尚可，表面略粗糙，新生組織顏色暗淡（圖 1 c）；24周，缺損區已完全被白色軟骨樣組織填充，與周圍軟骨整合較好，關節表面平整（圖 1 d）。
圖1
術后各時間點大體觀察 ? 1周 ? 4周 ? 12周 ? 24周 ? ?2.2 micro-CT掃描觀察
二維圖像觀察示，隨著修復時間推移，缺損區內軟骨下骨板逐漸向上遷移（圖 2）。三維圖像觀察示，隨著修復時間推移，BMD、BVF、TMD、Tb.N、Tb.Th均逐漸增加，而Tb.Sp逐漸下降，除Tb.Th術后4、12周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各指標各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、表 1。
2.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
組織學觀察示，術后1周，缺損區下陷，軟骨下骨未形成，基質染色無異染；4周，缺損區以纖維組織填充為主，表層不連續，交界處有裂隙，軟骨基質染色淺，軟骨下骨區以纖維組織為主；12周，缺損區仍以纖維軟骨細胞為主，表層不規則，兩側整合良好，軟骨基質染色淡，軟骨下骨區出現顆粒狀骨化現象；24周，修復組織以纖維軟骨細胞為主，表層仍欠平滑，但在與正常軟骨交界處有部分透明軟骨形成，軟骨基質染色中等，兩側整合良好，基質染色欠均勻，軟骨厚度約為正常軟骨的 2/3，軟骨下骨重建加快，偶可見潮線形成或軟骨下骨板重塑完成。免疫組織化學染色示，隨著修復時間推移，Ⅱ型膠原染色逐漸開始表達，但24周時仍呈弱陽性。見圖 4。
圖4
術后各時間點組織學及免疫組織化學染色觀察 （× 40） 從左至右依次為HE、番紅O、甲苯胺藍和Ⅱ型膠原染色 ? 1周 ? 4周 ? 12周 ? 24周
Figure4.
Histological and immunohistochemical observations at each time point after operation (× 40) Displayed staining from left to right: HE,safranin O,toluidine blue,and collagen type Ⅱ ? One week ? Four weeks ? Twelve weeks ? Twenty-four weeks
隨修復時間推移，術后標本ICRS組織學評分逐漸增加，除4周與12周比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。軟骨下骨組織形態計量學參數中，除Tb.Sp與ICRS組織學評分成負相關（r= -0.584，P=0.039）外，BVF（r=0.680，P=0.042）、BMD（r=0.759，P=0.036）、TMD（r=0.792，P=0.034）、Tb.Th（r=0.714，P=0.030）及Tb.N（r=0.891，P=0.011）均與其成正相關。
表1
術后各時間點關節軟骨修復組織形態計量學參數及組織學評分（n=6，3 討論
關節軟骨損傷大體分為3種類型：部分軟骨損傷、全層軟骨損傷和骨軟骨損傷。其中部分軟骨損傷只涉及關節透明軟骨，全層軟骨損傷則會影響到鈣化軟骨水平，而軟骨下骨完整性是否受到破壞是骨軟骨損傷的標志[2]。臨床關節軟骨損傷的患者中，骨軟骨損傷約占5%[10]，其主要由4種獨立病因引起，包括創傷性骨軟骨骨折、骨關節炎、骨壞死和剝脫性骨軟骨炎[11]。基于病因的多樣化及其修復過程的復雜性，迄今為止，臨床上雖有多種方法治療，但仍未獲得滿意遠期療效。
本研究通過構建兔骨軟骨缺損模型，采用連續時間點觀察缺損區的自發性修復效果。結果顯示，骨軟骨損傷自然修復進程中，軟骨下骨重塑具有顯著的時序性。隨著修復時間推移，骨組織形態計量學相關參數均表明軟骨下骨重塑逐漸增加，微觀結構存在顯著變化。在修復初期，軟骨下骨板位于正常位置下方，至24周時已恢復至正常水平；軟骨組織的修復也隨時間推移逐步改善，但最終并未恢復至正常形態，以纖維組織覆蓋為主，透明軟骨少見；從而表明在自發性修復模型中軟骨下骨重塑與軟骨再生修復的進程并不同步。另一方面，本研究也發現，關節軟骨的修復與軟骨下骨重塑的形態計量學各指標間均具有顯著相關性。既往有研究表明[8]，兔軟骨損傷模型中行軟骨下骨鉆孔術組比未處理組軟骨下骨板顯著增厚，認為這種現象是由于軟骨深層的組織化生所致。另外也有研究證實[12-13]，骨軟骨損傷區內的骨再生是由于新生血管形成和生長因子的作用，如TGF-β1、BMP、VEGF等。另外，Lyons等[14]指出，潮線是骨軟骨界面形成的標志，對軟骨下骨重塑也存在重要影響。而在本實驗模型中，由于骨軟骨缺損已破壞了潮線，此時損傷一般會累及骨小梁，并深達骨髓，軟骨下骨滲透的血液會填充缺損區，從而啟動炎性修復進程；同時局部凝血形成纖維蛋白凝集，可在修復過程中起支架作用，骨髓血中的BMSCs也將分化為軟骨細胞進行修復。而這種修復方式是一種“自下而上”的修復，下層軟骨下骨重塑一旦完成，上層獲得的干細胞、生長因子和營養物質將逐漸減少，導致軟骨修復不能順利完成[15]。此外有臨床研究顯示，既往接受過骨髓刺激技術治療的軟骨損傷患者，遠期會發生軟骨下骨硬化，導致自體軟骨細胞移植術失敗率增加[16]。
組織工程技術的發展為骨軟骨損傷修復提供了新選擇，然而有研究報道，應用該技術修復骨軟骨缺損時常伴軟骨細胞的“終末分化”現象，繼而出現軟骨內骨化導致新生軟骨退變[12, 17]。另一方面，從骨髓腔募集至缺損區的BMSCs，經常發生不可控制的分化，從而上調相關生化標志物和基質酶表達，導致軟骨細胞逐漸肥大、鈣化、骨化及軟骨基質降解[18-19]。有學者建議，在植入關節軟骨細胞或其他移植物修復骨軟骨缺損時，加入抗血管生成因子chondromodulin-1和thrombospondin-1，可能防止軟骨下骨的過度生長，從而促進透明軟骨再生[12, 20]。由此可見，軟骨下骨的變化在骨軟骨損傷的發生及修復進程中扮演著重要角色[21]。
綜上述，本研究結果顯示，軟骨修復與軟骨下骨重塑既密切相關又獨立發生，軟骨下骨的快速重塑可能負面影響關節軟骨修復效果。我們強調軟骨下骨在骨軟骨缺損的自然進程及修復治療中的臨床重要性，但仍需要更長期的觀察及力學性能評估。下一步將致力于應用組織工程策略構建含有骨軟骨界面的一體化材料，結合藥物調控軟骨下骨重塑進程，以促進骨軟骨損傷的功能性修復。
