引用本文： 林綿輝, 史玉朋, 王磊, 葉俊強. 鈦顆粒對成骨細胞增殖分化及細胞形態的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 581-585. doi: 10.7507/1002-1892.20140130 復制
假體無菌性松動是人工關節置換術后遠期失敗的常見原因，據報道其發病率高達25%[1-2]。磨損顆粒引起的骨溶解是造成假體松動的主要原因[3]。現有研究大多集中在磨損顆粒激活破骨細胞引起的骨溶解方面。然而作為假體周圍的主要細胞成份，成骨細胞也參與了無菌性松動的病理過程。磨損顆粒對成骨細胞的影響在松動假體周圍骨重建失衡中是否也發揮了重要作用，目前尚罕見報道。本研究通過觀察鈦顆粒對成骨細胞增殖、分化的影響，采用FITC-鬼筆環肽和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙重熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察成骨細胞吞噬鈦顆粒后形態結構的變化，分析這種變化與成骨細胞增殖、分化功能改變的關系，進一步探討假體無菌性松動的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級新生24 h SD大鼠10只，雌雄不限，體重約30 g，由廣東省實驗動物中心提供。
實驗用鈦顆粒（Alfa Aesar公司，美國），直徑1～ 15 μm，其中89%顆粒直徑＜ 5 μm。淫羊藿苷（中國藥品生物制品檢定所）；DMEM培養基、FBS（Invitrogen公司，美國）；胰蛋白酶、PI、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；鱟試劑（廈門鱟試劑有限公司）；Ⅰ型膠原ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；FITC-鬼筆環肽、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術研究所）。激光共聚焦顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；酶聯免疫檢測儀（Molecular Devices公司，美國）；Sorvall ST16R通用臺式離心機（Thermo Fisher公司，美國）。
1.2 成骨細胞分離、純化及鑒定
取新生SD大鼠10只，脫頸處死后浸入75%乙醇消毒10 min，無菌條件下取出顱骨，去除骨膜及軟組織，PBS液清洗2次后，剪成1 mm × 1 mm × 1 mm大小；37℃以0.25%胰蛋白酶消化30 min，取出骨片置于0.1%Ⅱ型膠原酶消化60 min；收集含細胞的消化液，以200 × g離心10 min。棄上清，沉淀細胞團塊用0.1%Ⅱ型膠原酶重復消化1次，PBS液洗滌，加入含10%FBS的DMEM培養基吹打成細胞懸液。將細胞懸液接種于培養瓶內靜置10 min，然后吸取上清液于另一培養瓶中再靜置10 min，重復此過程1～2次，最后仍懸于培養液中細胞即為純化的成骨細胞。加入含10%FBS的DMEM培養基（含青、鏈霉素各100 U/ mL）制成細胞懸液，于37℃、5%CO2培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，隔日換液，之后每3 天更換培養液，待單層細胞鋪滿80%后進行傳代培養。取第3代細胞采用ALP染色及茜素紅染色鑒定，備用。
1.3 鈦顆粒制備
取實驗用鈦顆粒，于180℃高溫烘焙6 h，干燥后浸泡于75%乙醇中，水平搖床震蕩1 h，共4次；以16 099 × g離心10 min，更換為100%乙醇浸泡過夜，PBS沖洗3次；用含10%FBS的DMEM培養基配制成濃度為1 mg/mL的母液，再用上述培養基調整濃度至0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL備用。鱟試驗檢測鈦顆粒內毒素水平＜ 0.1 EU/mL，排除內毒素干擾。
1.4 觀測指標
1.4.1 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖能力的影響
取生長良好的成骨細胞，以2 ×103個/孔接種于96孔板中，靜置24 h后分別加入濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ mL的鈦顆粒培養基（0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ mL組）培養，以不含鈦顆粒的正常培養基培養細胞作為對照組，每3天換液1次。培養7 d后每孔分別加入CCK-8液10 μL，于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育3 h，然后于酶聯免疫檢測儀上檢測450 nm波長處的吸光度（A）值，以實驗組A值約為對照組一半時的鈦顆粒濃度作為其半數致死濃度，并以該濃度進行細胞形態學觀察實驗。實驗重復3次。
1.4.2 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞分化能力的影響
取生長良好的成骨細胞，以2 ×104個/孔接種于24孔板中，靜置24 h后同1.4.1方法分組培養。培養7 d后用Ⅰ型膠原ELISA試劑盒檢測Ⅰ型膠原含量，比較各組成骨細胞分化能力。實驗重復3次。
1.4.3 成骨細胞吞噬鈦顆粒后的細胞形態學改變
取生長良好的成骨細胞接種于35 mm共聚焦玻底培養皿中，并分為兩組，以半數致死濃度鈦顆粒培養基培養作為實驗組，以不含鈦顆粒的正常培養基培養作為對照組。培養7 d后棄培養液，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS液清洗3次，0.2%Triton X-100室溫下滲透10 min，PBS液清洗6次，每皿滴加10 μL濃度為5 μg/mL FITC-鬼筆環肽，37℃培養箱保溫；保濕30 min，PBS液清洗3次；加入10 μL濃度為20 μg/mL的PI，37℃培養箱保溫；保濕10 min，PBS液清洗6次，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC產生綠色熒光，PI產生紅色熒光（細胞核襯染）。
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，接種的成骨細胞呈圓形，懸浮于培養液中并逐漸貼壁。24 h后細胞完全展開，形態不規則，以三角形、多角形及長梭形為主；7 d后細胞匯合成“鋪路石”樣，并可重疊生長（圖 1 a）；傳代后細胞體積增大，展平面積增加，細胞器增多，細胞伸出偽足樣突起并相互連接（圖 1 b）。ALP染色見細胞質內有灰黑色顆粒或塊狀沉淀（圖 1 c），茜素紅染色可見染成紅褐色鈣化結節（圖 1 d），提示培養的細胞為成骨細胞。
圖1
成骨細胞形態學觀察及鑒定 ? 原代細胞培養7 d（倒置相差顯微鏡×100） ? 第3代成骨細胞（倒置相差顯微鏡×100） ? ALP染色（× 200） ? 茜素紅染色（×100） ? ?2.2 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖及分化能力的影響
培養7 d，各濃度組成骨細胞增殖、分化能力與對照組比較均有不同程度下降，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。同時隨濃度增加，各濃度組對成骨細胞增殖的抑制作用逐漸增強，成骨細胞Ⅰ型膠原含量逐漸降低；除0.01、0.05 mg/mL組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。當鈦顆粒濃度為0.5 mg/mL時，成骨細胞A值為對照組的47.1% ± 3.3%，此為鈦顆粒的半數致死濃度。見表 1。
表1
不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖、分化能力影響（n=3，2.3 成骨細胞吞噬鈦顆粒后的細胞形態學改變
激光共聚焦顯微鏡下，對照組成骨細胞形態清晰，周圍伸出許多偽足，微絲在細胞質內沿細胞長軸有序分布。實驗組成骨細胞皺縮，偽足收縮變短，微絲增厚、扭曲，排列紊亂；被吞噬的鈦顆粒直徑為1～5 μm，附著于細胞骨架上形成微絲-顆粒復合體，部分顆粒聚集在細胞核周圍，核內染色質固縮為不均一的點狀結構。見圖 2。
3 討論
通常認為，磨損顆粒刺激假體周圍單核/巨噬細胞釋放炎性因子，激活破骨細胞分化和成熟，引起骨溶解是假體松動的主要發病機制[4-8]。然而，假體周圍骨床的形成有賴于骨溶解和骨形成之間的相互平衡[9]。磨損顆粒進入松動假體周圍的間隙中，可作用于大量成骨細胞，通過影響成骨細胞功能，抑制假體周圍成骨能力。有學者發現無菌性松動患者的關節滑液中骨鈣蛋白水平下降，提示關節周圍的成骨細胞活性降低，這可能與磨損顆粒對成骨細胞的作用有關[10]。因此，骨形成的減少對假體無菌性松動也具有重要意義，成骨細胞和其前體細胞對磨損顆粒的反應起到了重要作用[11-13]。
本實驗采用第3代大鼠成骨細胞進行實驗，該細胞取材簡便，具有與人成骨細胞相似的生物學特征[14]。新生大鼠顱骨細胞中含有處于不同分化階段的成骨細胞，比細胞系保留了更多在體細胞的功能特性，可更好地模擬體內生物學變化。實驗所用大鼠成骨細胞通過反復貼壁法純化，ALP和茜素紅染色證實所培養細胞為成骨細胞，符合實驗要求。鈦合金是目前臨床常用的假體材料，因此我們選擇鈦顆粒作為實驗干預顆粒，研究其不同濃度對成骨細胞增殖和分化能力的影響。激光共聚焦顯微鏡觀察，可見大鼠成骨細胞吞噬的鈦顆粒直徑＜ 5 μm，與蔡賢華等[15]實驗獲得的細胞可吞噬顆粒大小一致，可在一定程度上模擬體內鈦顆粒作用環境，保證了實驗的齊同性和有效性。
通過CCK-8檢測細胞A值的變化能反映成骨細胞增殖情況。實驗結果表明，各濃度組鈦顆粒對成骨細胞的增殖具有顯著抑制作用，且存在著一定劑量依賴性，隨著鈦顆粒濃度增加，對成骨細胞增殖抑制作用越明顯；濃度為1 mg/mL的鈦顆粒對成骨細胞增殖活力的抑制作用最強，當鈦顆粒濃度為0.5 mg/mL時，成骨細胞增殖活力約為對照組的47.1%，為鈦顆粒半數致死濃度。與成骨細胞增殖激活有關的基因包括c-myc、c-fos、c-jun、組蛋白基因等，鈦顆粒對增殖的抑制可能與對以上基因的調節作用有關[16]，但有待進一步研究明確。
Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌的骨結構蛋白，為骨基質的主要成分。鈣鹽通過沉積在骨基質中，使膠原礦化，最終形成鈣化骨組織。因此Ⅰ型膠原是成骨細胞分化成熟的重要標記，可反映細胞的成骨能力。本實驗結果顯示鈦顆粒作用7 d后，成骨細胞合成Ⅰ型膠原能力下降，并隨鈦顆粒濃度增加，抑制作用逐漸增強。說明鈦顆粒對成骨細胞的礦化成熟也存在不利影響。
研究表明，鈦顆粒可抑制成骨細胞增殖，誘發細胞凋亡，降低與成骨相關的ALP、骨鈣素、骨連接素的表達，減少膠原合成和基質礦化，還可抑制成骨前體細胞向成骨細胞分化[17-20]。Vermes等 [11]發現鈦顆粒可促進MG-63成骨樣細胞表達炎性因子IL-6，激活破骨細胞，但由此產生的骨吸收并不能被新生骨所代替，因為成骨樣細胞的增殖和Ⅰ型膠原的合成也受到了抑制。這說明鈦顆粒對成骨細胞具有雙重作用，一方面誘發成骨細胞表達炎性因子，激活破骨細胞介導的骨溶解，使骨量丟失；另一方面抑制成骨細胞的增殖和分化能力，使假體外周骨形成減少。我們前期實驗在人工關節假體松動的動物模型中，發現經鈦顆粒作用后，假體周圍骨密度下降，骨形成減少，說明鈦顆粒抑制了成骨細胞的成骨能力[21]。本研究體外實驗結果與上述結論一致。
激光共聚焦顯微鏡觀察示，成骨細胞吞噬鈦顆粒后細胞形態和細胞骨架發生了改變，提示鈦顆粒對成骨細胞的抑制作用可能與之有關。一方面，鈦顆粒被吞入細胞質后附著在肌動蛋白絲上，形成微絲-顆粒復合體，干擾了細胞骨架的正常排列，使細胞皺縮，減少了與細胞外基質（如Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白）的接觸面積，降低了細胞黏附力[22]。當鈦顆粒引起破骨性骨吸收時，依照“爬行替代”的機制，成骨細胞黏附至受侵蝕區域的骨基質中修復骨組織的能力減弱[23]。另一方面，被吞噬的鈦顆粒改變了細胞內部結構，部分鈦顆粒聚集在細胞核周圍，阻斷了細胞代謝信號的傳遞，影響了細胞增殖及成骨相關基因的轉錄和翻譯[24]。此外，在鈦顆粒負荷下，細胞核內染色質固縮、溶解、碎裂，加速細胞凋亡，使成骨細胞數量減少，成骨能力減弱[25]。
綜上述，磨損顆粒對成骨細胞的增殖和分化能力具有抑制作用，細胞吞噬顆粒后組織形態和細胞骨架排列的改變可能與這種抑制作用有關，為明確人工關節假體無菌性松動的機制提供了新思路。
假體無菌性松動是人工關節置換術后遠期失敗的常見原因，據報道其發病率高達25%[1-2]。磨損顆粒引起的骨溶解是造成假體松動的主要原因[3]。現有研究大多集中在磨損顆粒激活破骨細胞引起的骨溶解方面。然而作為假體周圍的主要細胞成份，成骨細胞也參與了無菌性松動的病理過程。磨損顆粒對成骨細胞的影響在松動假體周圍骨重建失衡中是否也發揮了重要作用，目前尚罕見報道。本研究通過觀察鈦顆粒對成骨細胞增殖、分化的影響，采用FITC-鬼筆環肽和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙重熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察成骨細胞吞噬鈦顆粒后形態結構的變化，分析這種變化與成骨細胞增殖、分化功能改變的關系，進一步探討假體無菌性松動的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級新生24 h SD大鼠10只，雌雄不限，體重約30 g，由廣東省實驗動物中心提供。
實驗用鈦顆粒（Alfa Aesar公司，美國），直徑1～ 15 μm，其中89%顆粒直徑＜ 5 μm。淫羊藿苷（中國藥品生物制品檢定所）；DMEM培養基、FBS（Invitrogen公司，美國）；胰蛋白酶、PI、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；鱟試劑（廈門鱟試劑有限公司）；Ⅰ型膠原ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；FITC-鬼筆環肽、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術研究所）。激光共聚焦顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；酶聯免疫檢測儀（Molecular Devices公司，美國）；Sorvall ST16R通用臺式離心機（Thermo Fisher公司，美國）。
1.2 成骨細胞分離、純化及鑒定
取新生SD大鼠10只，脫頸處死后浸入75%乙醇消毒10 min，無菌條件下取出顱骨，去除骨膜及軟組織，PBS液清洗2次后，剪成1 mm × 1 mm × 1 mm大小；37℃以0.25%胰蛋白酶消化30 min，取出骨片置于0.1%Ⅱ型膠原酶消化60 min；收集含細胞的消化液，以200 × g離心10 min。棄上清，沉淀細胞團塊用0.1%Ⅱ型膠原酶重復消化1次，PBS液洗滌，加入含10%FBS的DMEM培養基吹打成細胞懸液。將細胞懸液接種于培養瓶內靜置10 min，然后吸取上清液于另一培養瓶中再靜置10 min，重復此過程1～2次，最后仍懸于培養液中細胞即為純化的成骨細胞。加入含10%FBS的DMEM培養基（含青、鏈霉素各100 U/ mL）制成細胞懸液，于37℃、5%CO2培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，隔日換液，之后每3 天更換培養液，待單層細胞鋪滿80%后進行傳代培養。取第3代細胞采用ALP染色及茜素紅染色鑒定，備用。
1.3 鈦顆粒制備
取實驗用鈦顆粒，于180℃高溫烘焙6 h，干燥后浸泡于75%乙醇中，水平搖床震蕩1 h，共4次；以16 099 × g離心10 min，更換為100%乙醇浸泡過夜，PBS沖洗3次；用含10%FBS的DMEM培養基配制成濃度為1 mg/mL的母液，再用上述培養基調整濃度至0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL備用。鱟試驗檢測鈦顆粒內毒素水平＜ 0.1 EU/mL，排除內毒素干擾。
1.4 觀測指標
1.4.1 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖能力的影響
取生長良好的成骨細胞，以2 ×103個/孔接種于96孔板中，靜置24 h后分別加入濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ mL的鈦顆粒培養基（0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ mL組）培養，以不含鈦顆粒的正常培養基培養細胞作為對照組，每3天換液1次。培養7 d后每孔分別加入CCK-8液10 μL，于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育3 h，然后于酶聯免疫檢測儀上檢測450 nm波長處的吸光度（A）值，以實驗組A值約為對照組一半時的鈦顆粒濃度作為其半數致死濃度，并以該濃度進行細胞形態學觀察實驗。實驗重復3次。
1.4.2 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞分化能力的影響
取生長良好的成骨細胞，以2 ×104個/孔接種于24孔板中，靜置24 h后同1.4.1方法分組培養。培養7 d后用Ⅰ型膠原ELISA試劑盒檢測Ⅰ型膠原含量，比較各組成骨細胞分化能力。實驗重復3次。
1.4.3 成骨細胞吞噬鈦顆粒后的細胞形態學改變
取生長良好的成骨細胞接種于35 mm共聚焦玻底培養皿中，并分為兩組，以半數致死濃度鈦顆粒培養基培養作為實驗組，以不含鈦顆粒的正常培養基培養作為對照組。培養7 d后棄培養液，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS液清洗3次，0.2%Triton X-100室溫下滲透10 min，PBS液清洗6次，每皿滴加10 μL濃度為5 μg/mL FITC-鬼筆環肽，37℃培養箱保溫；保濕30 min，PBS液清洗3次；加入10 μL濃度為20 μg/mL的PI，37℃培養箱保溫；保濕10 min，PBS液清洗6次，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC產生綠色熒光，PI產生紅色熒光（細胞核襯染）。
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，接種的成骨細胞呈圓形，懸浮于培養液中并逐漸貼壁。24 h后細胞完全展開，形態不規則，以三角形、多角形及長梭形為主；7 d后細胞匯合成“鋪路石”樣，并可重疊生長（圖 1 a）；傳代后細胞體積增大，展平面積增加，細胞器增多，細胞伸出偽足樣突起并相互連接（圖 1 b）。ALP染色見細胞質內有灰黑色顆粒或塊狀沉淀（圖 1 c），茜素紅染色可見染成紅褐色鈣化結節（圖 1 d），提示培養的細胞為成骨細胞。
圖1
成骨細胞形態學觀察及鑒定 ? 原代細胞培養7 d（倒置相差顯微鏡×100） ? 第3代成骨細胞（倒置相差顯微鏡×100） ? ALP染色（× 200） ? 茜素紅染色（×100） ? ?2.2 不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖及分化能力的影響
培養7 d，各濃度組成骨細胞增殖、分化能力與對照組比較均有不同程度下降，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。同時隨濃度增加，各濃度組對成骨細胞增殖的抑制作用逐漸增強，成骨細胞Ⅰ型膠原含量逐漸降低；除0.01、0.05 mg/mL組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。當鈦顆粒濃度為0.5 mg/mL時，成骨細胞A值為對照組的47.1% ± 3.3%，此為鈦顆粒的半數致死濃度。見表 1。
表1
不同濃度鈦顆粒對成骨細胞增殖、分化能力影響（n=3，2.3 成骨細胞吞噬鈦顆粒后的細胞形態學改變
激光共聚焦顯微鏡下，對照組成骨細胞形態清晰，周圍伸出許多偽足，微絲在細胞質內沿細胞長軸有序分布。實驗組成骨細胞皺縮，偽足收縮變短，微絲增厚、扭曲，排列紊亂；被吞噬的鈦顆粒直徑為1～5 μm，附著于細胞骨架上形成微絲-顆粒復合體，部分顆粒聚集在細胞核周圍，核內染色質固縮為不均一的點狀結構。見圖 2。
3 討論
通常認為，磨損顆粒刺激假體周圍單核/巨噬細胞釋放炎性因子，激活破骨細胞分化和成熟，引起骨溶解是假體松動的主要發病機制[4-8]。然而，假體周圍骨床的形成有賴于骨溶解和骨形成之間的相互平衡[9]。磨損顆粒進入松動假體周圍的間隙中，可作用于大量成骨細胞，通過影響成骨細胞功能，抑制假體周圍成骨能力。有學者發現無菌性松動患者的關節滑液中骨鈣蛋白水平下降，提示關節周圍的成骨細胞活性降低，這可能與磨損顆粒對成骨細胞的作用有關[10]。因此，骨形成的減少對假體無菌性松動也具有重要意義，成骨細胞和其前體細胞對磨損顆粒的反應起到了重要作用[11-13]。
本實驗采用第3代大鼠成骨細胞進行實驗，該細胞取材簡便，具有與人成骨細胞相似的生物學特征[14]。新生大鼠顱骨細胞中含有處于不同分化階段的成骨細胞，比細胞系保留了更多在體細胞的功能特性，可更好地模擬體內生物學變化。實驗所用大鼠成骨細胞通過反復貼壁法純化，ALP和茜素紅染色證實所培養細胞為成骨細胞，符合實驗要求。鈦合金是目前臨床常用的假體材料，因此我們選擇鈦顆粒作為實驗干預顆粒，研究其不同濃度對成骨細胞增殖和分化能力的影響。激光共聚焦顯微鏡觀察，可見大鼠成骨細胞吞噬的鈦顆粒直徑＜ 5 μm，與蔡賢華等[15]實驗獲得的細胞可吞噬顆粒大小一致，可在一定程度上模擬體內鈦顆粒作用環境，保證了實驗的齊同性和有效性。
通過CCK-8檢測細胞A值的變化能反映成骨細胞增殖情況。實驗結果表明，各濃度組鈦顆粒對成骨細胞的增殖具有顯著抑制作用，且存在著一定劑量依賴性，隨著鈦顆粒濃度增加，對成骨細胞增殖抑制作用越明顯；濃度為1 mg/mL的鈦顆粒對成骨細胞增殖活力的抑制作用最強，當鈦顆粒濃度為0.5 mg/mL時，成骨細胞增殖活力約為對照組的47.1%，為鈦顆粒半數致死濃度。與成骨細胞增殖激活有關的基因包括c-myc、c-fos、c-jun、組蛋白基因等，鈦顆粒對增殖的抑制可能與對以上基因的調節作用有關[16]，但有待進一步研究明確。
Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌的骨結構蛋白，為骨基質的主要成分。鈣鹽通過沉積在骨基質中，使膠原礦化，最終形成鈣化骨組織。因此Ⅰ型膠原是成骨細胞分化成熟的重要標記，可反映細胞的成骨能力。本實驗結果顯示鈦顆粒作用7 d后，成骨細胞合成Ⅰ型膠原能力下降，并隨鈦顆粒濃度增加，抑制作用逐漸增強。說明鈦顆粒對成骨細胞的礦化成熟也存在不利影響。
研究表明，鈦顆粒可抑制成骨細胞增殖，誘發細胞凋亡，降低與成骨相關的ALP、骨鈣素、骨連接素的表達，減少膠原合成和基質礦化，還可抑制成骨前體細胞向成骨細胞分化[17-20]。Vermes等 [11]發現鈦顆粒可促進MG-63成骨樣細胞表達炎性因子IL-6，激活破骨細胞，但由此產生的骨吸收并不能被新生骨所代替，因為成骨樣細胞的增殖和Ⅰ型膠原的合成也受到了抑制。這說明鈦顆粒對成骨細胞具有雙重作用，一方面誘發成骨細胞表達炎性因子，激活破骨細胞介導的骨溶解，使骨量丟失；另一方面抑制成骨細胞的增殖和分化能力，使假體外周骨形成減少。我們前期實驗在人工關節假體松動的動物模型中，發現經鈦顆粒作用后，假體周圍骨密度下降，骨形成減少，說明鈦顆粒抑制了成骨細胞的成骨能力[21]。本研究體外實驗結果與上述結論一致。
激光共聚焦顯微鏡觀察示，成骨細胞吞噬鈦顆粒后細胞形態和細胞骨架發生了改變，提示鈦顆粒對成骨細胞的抑制作用可能與之有關。一方面，鈦顆粒被吞入細胞質后附著在肌動蛋白絲上，形成微絲-顆粒復合體，干擾了細胞骨架的正常排列，使細胞皺縮，減少了與細胞外基質（如Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白）的接觸面積，降低了細胞黏附力[22]。當鈦顆粒引起破骨性骨吸收時，依照“爬行替代”的機制，成骨細胞黏附至受侵蝕區域的骨基質中修復骨組織的能力減弱[23]。另一方面，被吞噬的鈦顆粒改變了細胞內部結構，部分鈦顆粒聚集在細胞核周圍，阻斷了細胞代謝信號的傳遞，影響了細胞增殖及成骨相關基因的轉錄和翻譯[24]。此外，在鈦顆粒負荷下，細胞核內染色質固縮、溶解、碎裂，加速細胞凋亡，使成骨細胞數量減少，成骨能力減弱[25]。
綜上述，磨損顆粒對成骨細胞的增殖和分化能力具有抑制作用，細胞吞噬顆粒后組織形態和細胞骨架排列的改變可能與這種抑制作用有關，為明確人工關節假體無菌性松動的機制提供了新思路。
