引用本文： 甘洪全, 李琪佳, 王茜, 路建, 耿麗鑫, 宋會平, 王志強. 國產多孔鉭材料兔髕腱內植入形態學特點及生物相容性評價. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(4): 452-456. doi: 10.7507/1002-1892.20140103 復制
惡性腫瘤及外傷等因素造成的關節部位骨損傷會破壞肌腱-骨連接裝置，造成關節功能喪失[1-2]。人工關節置換術是治療此類損傷的常用方法之一。關節置換后要求肌腱與假體之間具有強大持久的附著力及連接力，以維持關節穩定性[3-5]。因此肌腱與假體連接問題成為肌腱-骨連接裝置損傷研究的熱點。臨床常用的肌腱-骨連接裝置重建方法存在肌腱負荷難以控制、不能長期堅強固定、術后并發癥多等缺點。研究發現，多孔鉭具備穩定的生物相容性、較大的摩擦系數及機械強度，彈性模量接近正常人骨，而且具有較高的孔徑及孔隙連通率[6-7]，有利于宿主組織向其孔隙內生長，達到穩定固定，目前已作為髖、膝關節假體材料用于臨床[8-10]。多孔鉭這些特性使其用于重建肌腱-骨界面連接裝置成為可能。然而目前國內臨床使用的多孔鉭材料均為國外進口，價格昂貴。重慶潤澤醫療器械有限公司聯合國內多家科研機構，采用粉末澆注高溫煅燒工藝技術成功研制了多孔鉭材料。本實驗通過將該國產多孔鉭材料植入兔髕腱內，觀察肌腱組織向多孔鉭孔隙內生長情況，評價其生物相容性，并與已廣泛應用于臨床的多孔鈦材料進行比較，為國產多孔鉭材料應用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年新西蘭大白兔48只，雌雄不限，體重2.5～ 3.0 kg，由河北聯合大學實驗動物中心提供。
多孔鉭材料由重慶潤澤醫療器械有限公司提供，材料呈深灰色，表面光潔，表面及橫斷面可見蜂窩狀針尖大小的孔，分布均勻；多孔鈦材料由陜西寶雞金凱科技工貿有限公司提供，材料呈淺灰色，表面粗糙呈顆粒狀，表面及橫斷面亦可見蜂窩狀孔隙（圖 1）。E-1010離子濺射裝置（Hitachi公司，日本）；JSM-6030LV掃描電鏡（日本電子株式會社）；Minimet1000磨片機（Buehler公司，美國）；SP2600銑片機、Leica1600硬組織切片機（Leica公司 德國）。
1.2 實驗分組及方法
取48只新西蘭大白兔，以腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定，雙膝部剃毛暴露術區。作膝關節外側縱切口，切開皮膚及皮下筋膜，沿髕腱冠狀面縱行劈開，將大小為5 mm × 5 mm × 2 mm的多孔鉭材料及多孔鈦材料分別植入左、右側髕腱，作為實驗組及對照組。用縫合線按“#”形將材料固定于髕腱，縫合髕腱、皮下筋膜及皮膚。術后肌肉注射頭孢尼西鈉預防感染，每天0.1 g，共3 d。動物均自由活動。術后2、4、8、12周各取12只動物進行觀察。
1.3 觀察指標
1.3.1 大體觀察
觀察術后動物存活、切口愈合情況及肢體活動情況。各時間點取12只實驗動物，空氣栓塞處死后按原切口入路，將植入材料連同周圍髕腱組織一并切取，觀察植入材料周圍有無紅腫、化膿，材料與周圍組織結合是否緊密。
1.3.2 組織學觀察
各時間點大體觀察后取其中4 只實驗動物標本，分離周圍髕腱組織，取出植入材料，行 石蠟包埋、切片后HE染色。光鏡觀察植入材料周圍包膜形成以及細胞浸潤情況。在100倍鏡下，每張切片取3個視野，采用鏡下測微尺測量包膜厚度，取均 值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
各時間點大體觀察后取2只實驗動物標本，同1.3.2方法取出植入材料，4%戊二醛固定，梯度乙醇逐級脫水，37℃電熱恒溫鼓風干燥箱內烘干，離子濺射裝置噴金，掃描電鏡觀察植入材料內髕腱組織長入情況。
1.3.4 硬組織切片觀察
各時間點大體觀察后取6只實驗動物標本，切取植入材料連同周圍1 cm髕腱組織，4%甲醛固定后脫水、滲透、包埋及聚合，真空處理；取出包埋塊，拋光切面，硬組織切片機切片，切出能將多孔鉭和多孔鈦完整暴露的平面，制成70 μm厚切片，磨片至20 μm厚，干燥，脫塑。甲苯胺藍染色，空氣干燥，中性樹膠封片。光鏡下觀察植入材料內髕腱組織長入情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內不同時間點間比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后動物均存活至實驗完成，切口愈合好；3 d后膝關節活動即恢復正常。大體觀察顯示，各時間點兩組多孔鉭及多孔鈦材料與髕腱組織均結合緊密，未見明顯紅腫、化膿等炎性反應。
2.2 組織學觀察
術后2、4周，兩組植入材料周圍均有包膜形成，包膜內可見成纖維細胞及新生毛細血管，交界面可見少量淋巴細胞浸潤，未見多核巨噬細胞及各類白細胞浸潤；8、12周；兩組包膜與2、4周相比更致密，且變薄，成纖維細胞及血管明顯減少。各時間點兩組形成的包膜與周圍肌腱組織結合均較緊密（圖 2）。各時間點對照組包膜均較實驗組疏松、厚，但兩組包膜厚度比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）；隨時間延長，兩組包膜均逐漸變薄，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
各時間點兩組包膜厚度比較（n=4，μm，2.3 掃描電鏡觀察
術后2周，兩組均見少量肌腱膠原纖維長入孔隙內部，部分膠原纖維附著于孔壁，未附著部分可見孔隙空虛或縫隙。4、8周，兩組膠原纖維及纖維細胞在孔隙內部大量生長，細胞形態多樣、伸展、拉長或伸出突起，部分橫跨孔隙相互連接；實驗組多孔鉭材料內纖維組織的長入多于對照組多孔鈦材料，且仍可見部分間隙無肌腱組織長入。12周，兩組植入材料孔隙內均充滿肌腱纖維，與孔壁結合緊密，無縫隙存在；實驗組孔隙內肌腱組織的長入量較對照組更多。見圖 3。
圖1
兩種材料外觀 左側為多孔鈦，右側為多孔鉭 ? ?2.4 硬組織切片觀察
術后2周，兩組植入材料孔隙內有疏松纖維組織及少量成纖維細胞長入，同時伴新生毛細血管。4周，實驗組鉭-肌腱界面新生肌腱組織增多并大量長入孔隙內，小血管及成纖維細胞較前增加；對照組觀察情況與實驗組相似，但多孔鈦材料孔隙長入的肌腱纖維及小血管明顯較少。8、12周，實驗組多孔鉭材料表面和孔隙內已長滿新生肌腱組織，肌腱纖維呈束狀排列，小血管及細胞減少，肌腱膠原纖維-多孔鉭融合于一體；對照組與實驗組相比肌腱組織長入無明顯差異。見圖 4。
3 討論
目前，在多孔鉭材料的研制和開發方面趨于世界領先地位的是美國Zimmer公司，其研發的多孔鉭材料孔隙連接率高達75%～85%，孔徑為400～600 μm。由于其為專利技術，價格昂貴，很難在國內廣泛使用。為解決這一問題，重慶潤澤醫療器械有限公司成功研發了具有自主知識產權的國產多孔鉭材料，材料孔徑為400～600 μm，孔隙連接率達65%～80%，與美國Zimmer公司的多孔鉭材料參數相當。多孔鈦及其合金已作為骨移植替代材料在臨床廣泛應用，其結構特點及力學性能與多孔鉭類似，為此本研究選擇其作為對比材料。本實驗采用的多孔鈦是以純鈦粉為原料，采用傳統漿料發泡法制作而成，其孔徑為100～ 700 μm，孔隙連接率為40%～60%。
研究發現[11]，多孔鉭具有三維立體空間結構，可促進成骨細胞黏附、分化和生長，也有利于水及營養物質在其內部運輸。同時，該材料生物相容性好，摩擦系數較大，機械強度高，彈性模量接近正常人骨，而且孔徑合適，孔隙連接率高，十分有利于骨及其他纖維、軟骨、軟組織長入[12]。由于多孔鉭具有良好的骨長入特性，目前已作為骨移植替代材料修復骨缺損，如關節置換或翻修術后骨缺損、股骨頭缺血性壞死后骨缺損等[13-14]。本研究擬將多孔鉭植入兔髕腱，觀察材料植入肌腱與骨組織之間后肌腱組織是否向其內部生長，探討其用于重建肌腱-骨固定連接裝置的可能性。
本研究觀察示，多孔鉭植入兔髕腱后與髕腱結合緊密且周圍形成了穩定包膜，隨時間延長包膜逐漸變薄，但與多孔鈦周圍形成的包膜比較無顯著差異。包膜內及周圍僅見少量淋巴細胞，未見多核巨噬細胞及各類白細胞浸潤。同時掃描電鏡觀察示，術后2周即有少量肌腱膠原纖維長入孔隙內部，隨時間延長，膠原纖維在孔隙內部大量生長，形態多樣、伸展或橫跨孔隙相互連接，12周時材料孔隙內充滿了肌腱纖維，與孔壁結合緊密。同時由于多孔鉭材料孔隙大于多孔鈦材料，因此其內肌腱組織的長入量更多。提示國產多孔鉭與肌腱具有良好的生物相容性，并且能促進肌腱纖維向孔隙內生長。
為進一步觀察多孔鉭材料中細胞種類及微觀結構，本研究進行了硬組織切片技術觀察，分析肌腱、血管及細胞在多孔鉭表面、鉭-肌腱界面及孔隙內的生長變化。結果顯示：肌腱纖維在材料表面及孔隙內均有生長，鉭與肌腱接觸緊密。隨時間延長，鉭-肌腱界面新生肌腱組織增多并大量長入孔隙內，伴大量小血管及成纖維細胞，最終在多孔鉭表面和孔隙內長滿新生肌腱，肌腱纖維呈束狀排列，肌腱膠原纖維-多孔鉭緊密融合。
有研究表明，植入材料被組織包繞是機體對材料的一種“溫和”反應，其包膜厚度及細胞成分的出現可反映機體對植入材料的“包容”程度，包膜越薄且致密、細胞種類越少，說明越穩定[15]。此外，假體植入修復骨缺損時，周圍骨組織長入假體的量是判斷假體植入后穩定性的重要指標，骨組織長入量越多，說明假體與骨組織接觸越密切，假體穩定性就越高，不易松動[16-18]。根據本研究結果，結合以上報道，我們認為國產多孔鉭材料具有良好的組織相容性，其高孔徑及孔隙率可使更多富含血管的肌腱組織向其孔隙內部生長，使多孔鉭與周圍肌腱產生穩定牢固的連接及整合，有望作為肌腱與骨之間界面固定材料，將機械性固定變為生物性固定，最大限度恢復肌腱與骨的牢固連接，從而恢復關節功能。
惡性腫瘤及外傷等因素造成的關節部位骨損傷會破壞肌腱-骨連接裝置，造成關節功能喪失[1-2]。人工關節置換術是治療此類損傷的常用方法之一。關節置換后要求肌腱與假體之間具有強大持久的附著力及連接力，以維持關節穩定性[3-5]。因此肌腱與假體連接問題成為肌腱-骨連接裝置損傷研究的熱點。臨床常用的肌腱-骨連接裝置重建方法存在肌腱負荷難以控制、不能長期堅強固定、術后并發癥多等缺點。研究發現，多孔鉭具備穩定的生物相容性、較大的摩擦系數及機械強度，彈性模量接近正常人骨，而且具有較高的孔徑及孔隙連通率[6-7]，有利于宿主組織向其孔隙內生長，達到穩定固定，目前已作為髖、膝關節假體材料用于臨床[8-10]。多孔鉭這些特性使其用于重建肌腱-骨界面連接裝置成為可能。然而目前國內臨床使用的多孔鉭材料均為國外進口，價格昂貴。重慶潤澤醫療器械有限公司聯合國內多家科研機構，采用粉末澆注高溫煅燒工藝技術成功研制了多孔鉭材料。本實驗通過將該國產多孔鉭材料植入兔髕腱內，觀察肌腱組織向多孔鉭孔隙內生長情況，評價其生物相容性，并與已廣泛應用于臨床的多孔鈦材料進行比較，為國產多孔鉭材料應用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年新西蘭大白兔48只，雌雄不限，體重2.5～ 3.0 kg，由河北聯合大學實驗動物中心提供。
多孔鉭材料由重慶潤澤醫療器械有限公司提供，材料呈深灰色，表面光潔，表面及橫斷面可見蜂窩狀針尖大小的孔，分布均勻；多孔鈦材料由陜西寶雞金凱科技工貿有限公司提供，材料呈淺灰色，表面粗糙呈顆粒狀，表面及橫斷面亦可見蜂窩狀孔隙（圖 1）。E-1010離子濺射裝置（Hitachi公司，日本）；JSM-6030LV掃描電鏡（日本電子株式會社）；Minimet1000磨片機（Buehler公司，美國）；SP2600銑片機、Leica1600硬組織切片機（Leica公司 德國）。
1.2 實驗分組及方法
取48只新西蘭大白兔，以腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定，雙膝部剃毛暴露術區。作膝關節外側縱切口，切開皮膚及皮下筋膜，沿髕腱冠狀面縱行劈開，將大小為5 mm × 5 mm × 2 mm的多孔鉭材料及多孔鈦材料分別植入左、右側髕腱，作為實驗組及對照組。用縫合線按“#”形將材料固定于髕腱，縫合髕腱、皮下筋膜及皮膚。術后肌肉注射頭孢尼西鈉預防感染，每天0.1 g，共3 d。動物均自由活動。術后2、4、8、12周各取12只動物進行觀察。
1.3 觀察指標
1.3.1 大體觀察
觀察術后動物存活、切口愈合情況及肢體活動情況。各時間點取12只實驗動物，空氣栓塞處死后按原切口入路，將植入材料連同周圍髕腱組織一并切取，觀察植入材料周圍有無紅腫、化膿，材料與周圍組織結合是否緊密。
1.3.2 組織學觀察
各時間點大體觀察后取其中4 只實驗動物標本，分離周圍髕腱組織，取出植入材料，行 石蠟包埋、切片后HE染色。光鏡觀察植入材料周圍包膜形成以及細胞浸潤情況。在100倍鏡下，每張切片取3個視野，采用鏡下測微尺測量包膜厚度，取均 值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
各時間點大體觀察后取2只實驗動物標本，同1.3.2方法取出植入材料，4%戊二醛固定，梯度乙醇逐級脫水，37℃電熱恒溫鼓風干燥箱內烘干，離子濺射裝置噴金，掃描電鏡觀察植入材料內髕腱組織長入情況。
1.3.4 硬組織切片觀察
各時間點大體觀察后取6只實驗動物標本，切取植入材料連同周圍1 cm髕腱組織，4%甲醛固定后脫水、滲透、包埋及聚合，真空處理；取出包埋塊，拋光切面，硬組織切片機切片，切出能將多孔鉭和多孔鈦完整暴露的平面，制成70 μm厚切片，磨片至20 μm厚，干燥，脫塑。甲苯胺藍染色，空氣干燥，中性樹膠封片。光鏡下觀察植入材料內髕腱組織長入情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內不同時間點間比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后動物均存活至實驗完成，切口愈合好；3 d后膝關節活動即恢復正常。大體觀察顯示，各時間點兩組多孔鉭及多孔鈦材料與髕腱組織均結合緊密，未見明顯紅腫、化膿等炎性反應。
2.2 組織學觀察
術后2、4周，兩組植入材料周圍均有包膜形成，包膜內可見成纖維細胞及新生毛細血管，交界面可見少量淋巴細胞浸潤，未見多核巨噬細胞及各類白細胞浸潤；8、12周；兩組包膜與2、4周相比更致密，且變薄，成纖維細胞及血管明顯減少。各時間點兩組形成的包膜與周圍肌腱組織結合均較緊密（圖 2）。各時間點對照組包膜均較實驗組疏松、厚，但兩組包膜厚度比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）；隨時間延長，兩組包膜均逐漸變薄，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
各時間點兩組包膜厚度比較（n=4，μm，2.3 掃描電鏡觀察
術后2周，兩組均見少量肌腱膠原纖維長入孔隙內部，部分膠原纖維附著于孔壁，未附著部分可見孔隙空虛或縫隙。4、8周，兩組膠原纖維及纖維細胞在孔隙內部大量生長，細胞形態多樣、伸展、拉長或伸出突起，部分橫跨孔隙相互連接；實驗組多孔鉭材料內纖維組織的長入多于對照組多孔鈦材料，且仍可見部分間隙無肌腱組織長入。12周，兩組植入材料孔隙內均充滿肌腱纖維，與孔壁結合緊密，無縫隙存在；實驗組孔隙內肌腱組織的長入量較對照組更多。見圖 3。
圖1
兩種材料外觀 左側為多孔鈦，右側為多孔鉭 ? ?2.4 硬組織切片觀察
術后2周，兩組植入材料孔隙內有疏松纖維組織及少量成纖維細胞長入，同時伴新生毛細血管。4周，實驗組鉭-肌腱界面新生肌腱組織增多并大量長入孔隙內，小血管及成纖維細胞較前增加；對照組觀察情況與實驗組相似，但多孔鈦材料孔隙長入的肌腱纖維及小血管明顯較少。8、12周，實驗組多孔鉭材料表面和孔隙內已長滿新生肌腱組織，肌腱纖維呈束狀排列，小血管及細胞減少，肌腱膠原纖維-多孔鉭融合于一體；對照組與實驗組相比肌腱組織長入無明顯差異。見圖 4。
3 討論
目前，在多孔鉭材料的研制和開發方面趨于世界領先地位的是美國Zimmer公司，其研發的多孔鉭材料孔隙連接率高達75%～85%，孔徑為400～600 μm。由于其為專利技術，價格昂貴，很難在國內廣泛使用。為解決這一問題，重慶潤澤醫療器械有限公司成功研發了具有自主知識產權的國產多孔鉭材料，材料孔徑為400～600 μm，孔隙連接率達65%～80%，與美國Zimmer公司的多孔鉭材料參數相當。多孔鈦及其合金已作為骨移植替代材料在臨床廣泛應用，其結構特點及力學性能與多孔鉭類似，為此本研究選擇其作為對比材料。本實驗采用的多孔鈦是以純鈦粉為原料，采用傳統漿料發泡法制作而成，其孔徑為100～ 700 μm，孔隙連接率為40%～60%。
研究發現[11]，多孔鉭具有三維立體空間結構，可促進成骨細胞黏附、分化和生長，也有利于水及營養物質在其內部運輸。同時，該材料生物相容性好，摩擦系數較大，機械強度高，彈性模量接近正常人骨，而且孔徑合適，孔隙連接率高，十分有利于骨及其他纖維、軟骨、軟組織長入[12]。由于多孔鉭具有良好的骨長入特性，目前已作為骨移植替代材料修復骨缺損，如關節置換或翻修術后骨缺損、股骨頭缺血性壞死后骨缺損等[13-14]。本研究擬將多孔鉭植入兔髕腱，觀察材料植入肌腱與骨組織之間后肌腱組織是否向其內部生長，探討其用于重建肌腱-骨固定連接裝置的可能性。
本研究觀察示，多孔鉭植入兔髕腱后與髕腱結合緊密且周圍形成了穩定包膜，隨時間延長包膜逐漸變薄，但與多孔鈦周圍形成的包膜比較無顯著差異。包膜內及周圍僅見少量淋巴細胞，未見多核巨噬細胞及各類白細胞浸潤。同時掃描電鏡觀察示，術后2周即有少量肌腱膠原纖維長入孔隙內部，隨時間延長，膠原纖維在孔隙內部大量生長，形態多樣、伸展或橫跨孔隙相互連接，12周時材料孔隙內充滿了肌腱纖維，與孔壁結合緊密。同時由于多孔鉭材料孔隙大于多孔鈦材料，因此其內肌腱組織的長入量更多。提示國產多孔鉭與肌腱具有良好的生物相容性，并且能促進肌腱纖維向孔隙內生長。
為進一步觀察多孔鉭材料中細胞種類及微觀結構，本研究進行了硬組織切片技術觀察，分析肌腱、血管及細胞在多孔鉭表面、鉭-肌腱界面及孔隙內的生長變化。結果顯示：肌腱纖維在材料表面及孔隙內均有生長，鉭與肌腱接觸緊密。隨時間延長，鉭-肌腱界面新生肌腱組織增多并大量長入孔隙內，伴大量小血管及成纖維細胞，最終在多孔鉭表面和孔隙內長滿新生肌腱，肌腱纖維呈束狀排列，肌腱膠原纖維-多孔鉭緊密融合。
有研究表明，植入材料被組織包繞是機體對材料的一種“溫和”反應，其包膜厚度及細胞成分的出現可反映機體對植入材料的“包容”程度，包膜越薄且致密、細胞種類越少，說明越穩定[15]。此外，假體植入修復骨缺損時，周圍骨組織長入假體的量是判斷假體植入后穩定性的重要指標，骨組織長入量越多，說明假體與骨組織接觸越密切，假體穩定性就越高，不易松動[16-18]。根據本研究結果，結合以上報道，我們認為國產多孔鉭材料具有良好的組織相容性，其高孔徑及孔隙率可使更多富含血管的肌腱組織向其孔隙內部生長，使多孔鉭與周圍肌腱產生穩定牢固的連接及整合，有望作為肌腱與骨之間界面固定材料，將機械性固定變為生物性固定，最大限度恢復肌腱與骨的牢固連接，從而恢復關節功能。
