引用本文： 張文友, 賀健康, 李翔, 劉亞雄, 邊衛國, 李滌塵, 靳忠民. 基于3-D打印技術的韌帶-骨復合支架制造與體內植入研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 314-317. doi: 10.7507/1002-1892.20140071 復制
膝關節是人體最大的關節系統，其穩定性和正常運動能力主要依靠關節韌帶來維持。對于因運動或意外事故導致的關節韌帶不可自愈性損傷或斷裂，需行關節韌帶重建來恢復關節的生理功能。目前，重建手術所用的韌帶支架多由單一軟質材料制成，并采用界面螺釘進行擠壓機械固定，存在韌帶移植物在骨道內微滑動、自體骨內融合骨洞擴大而拉出以及連接處應力集中易發生疲勞斷裂等問題，韌帶移植物無法與自體骨組織有效融合固定是重建手術失敗的主要原因[1-2]。為達到韌帶移植物與宿主骨通道的牢固連接，組織工程韌帶-骨復合支架成為研究熱點[3-6]。本研究旨在探討基于3-D打印技術的韌帶-骨復合支架制備方法，通過連接蠶絲纖維編織的韌帶支架、陶瓷骨支架及固定釘獲得韌帶-骨復合支架，然后將其植入豬體內3個月后觀察力學性能和組織學改變，以期達到韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的牢固生理連接，為臨床韌帶修復重建提供新思路和新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康4月齡雄性家豬10只，體重51～63 kg，由陜西咸陽養殖場提供。
β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP；上海貝奧路生物材料有限公司）；蠶絲纖維（Trudel公司，瑞士）；聚醚醚酮（polyether ether ketone，PEEK；Angst+Pfister公司，瑞士）。CMTS503微機控制電子萬能試驗機（深圳新三思材料檢測有限公司）；SPS250B快速成型機（陜西恒通智能機器有限公司）；快速升溫電阻爐（湘潭湘儀儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）。三維設計軟件Pro/engineer（PTC公司，美國）。
1.2 骨支架制備
采用3-D打印技術與凝膠注模法制備骨支架[7]。具體步驟：應用三維設計軟件Pro/engineer設計骨支架三維模型（圖 1 a），通過布爾運算生成骨支架負型（圖 1 b）；然后利用3-D打印技術制作骨支架負型樹脂模具。配制β-TCP陶瓷混合漿料并灌注入骨支架負型樹脂模具中，凝固得到陶瓷胚體（圖 1 c），在60℃、100%濕度環境下反應120 h后，60℃環境下干燥24 h，隨后在快速升溫電阻爐中高溫燒結至1 150℃，樹脂模具氣化得到骨支架（圖 1 d）。
圖1
骨支架制備流程 ? 骨支架三維模型設計 ? 骨支架負型 ? 3-D打印的骨支架負型與陶瓷胚體 ? 成型的陶瓷骨支架 ? ?1.3 韌帶-骨復合支架制備
采用自制編織機將蠶絲纖維編織成韌帶支架[8]，置于煮沸的5%Na2CO3溶液中2 h去除絲膠，將韌帶支架一端包裹燒結的骨支架連接固定。機械加工PEEK材料制作具有倒刺牙型結構的固定釘，將固定釘與連接的韌帶與骨支架進行裝配連接，形成韌帶-骨復合支架。見圖 2。將韌帶-骨復合支架浸泡于75%乙醇溶液24 h消毒備用。
1.4 韌帶-骨復合支架體內植入方法
取10只豬肌肉注射3.5%戊巴比妥鈉溶液（0.5 mL/ kg）麻醉后，打開左側后腿膝關節（實驗組），屈膝90°，去除前交叉韌帶。用電鉆沿前交叉韌帶從脛骨端向股骨端鉆孔，脛骨鉆通，股骨部分鉆孔深度為20 mm。然后連接韌帶-骨復合支架與輔助植入裝置，利用氣錘緩慢將韌帶-骨復合支架植入股骨骨道，至支架表面與股骨表面大致平齊，拔出輔助植入裝置。將韌帶-骨復合支架的韌帶端通過牽引器從脛骨骨道拉出；屈膝30°，韌帶與脛骨端采用界面螺釘固定，縫合膝關節。右側膝關節不作處理，作為對照組。術后不作外固定，自由活動。
1.5 檢測指標
1.5.1 生物力學測試
支架植入后3個月，取7只實驗動物進行生物力學拉伸試驗。實驗組取再生的韌帶-骨復合支架；對照組取膝關節并剪斷后交叉韌帶、側副韌帶等，僅保留前交叉韌帶。實驗過程中為防止剪切力破壞，保證韌帶-骨復合支架軸線與微機控制電子萬能試驗機軸線一致，課題組設計了生物力學測試卡具，以實現X、 Y方向的移動并可調節角度，Z方向的移動通過微機控制電子萬能試驗機進行調節。其中，卡具筒用于固定股骨和脛骨；云臺用于調節韌帶-骨復合支架的角度和位置，角度通過調節與云臺相連的螺釘在滑槽內位置實現，位置通過調節下面滑槽位置實現。最終保證韌帶-骨復合支架軸線與微機控制電子萬能試驗機的軸線盡可能重合。采用螺釘將股骨、脛骨分別固定于卡具筒。見圖 3、4。
將生物力學測試卡具與微機控制電子萬能試驗機連接，膝關節標本與生物力學測試卡具連接固定。調節微機控制電子萬能試驗機程序，采用力控制模式，對膝關節從0 N開始拉伸，100～250 N循環250次，之后拉伸至斷裂，速度為0.5 mm/s。測試標本蠕變量及承受的最大拉伸力。蠕變量為100～250 N循環250次的位移差值，最大拉伸力為力-位移曲線最高點對應的力。
1.5.2 大體及組織學觀察
植入后3個月，取剩余3 只實驗動物韌帶-骨復合支架，大體觀察后置于甲醛溶液固定2個月，石蠟包埋并沿骨道切割韌帶-骨復合支架，厚6 μm切片，HE染色后倒置顯微鏡觀察韌帶-骨復合支架與骨道的連接部位及韌帶支 架。
1.6 統計學方法
采用Microsoft Excel軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 生物力學測試
對照組承受的最大拉伸力和蠕變量分別為（1 384 ± 181）N和（0.74 ± 0.21） mm，實驗組為（370 ± 103）N和（1.48 ± 0.49） mm，比較差異均有統計學意義（t=11.617，P=0.000；t= -2.991，P=0.020）。 見圖 5。
2.2 大體及組織學觀察
植入后3個月，大體觀察示再生出效果較好的蠶絲韌帶及韌帶-骨界面（圖 6）。HE染色示，隨韌帶支架降解，在蠶絲纖維周圍有大量纖維化組織形成并有序排列，包裹在韌帶支架周圍，形成了再生的人工韌帶（圖 7 a）；韌帶與骨道的連接部位形成了纖維軟骨過渡層，在降解的β-TCP周圍有大量新生骨，韌帶周圍再生的纖維化組織緊密固定于新生骨上（圖 7 b、c）。
3 討論
在關節韌帶重建術中，為實現韌帶移植物與自體骨組織的連接，臨床上采用在自體關節骨體上鉆孔，然后將韌帶移植物插入骨孔并用醫用螺釘機械固定，后期通過新骨在韌帶支架內的滲透生長，促進韌帶向自體骨組織的愈合固定。由于在韌帶移植物與骨道僅有薄弱連接的纖維組織形成，力學性能較差。為達到韌帶移植物與宿主骨道的生理結合，研究者進行了大量研究。Lee等[9]在韌帶支架內復合骨生長因子或細胞，但由于韌帶支架的材料結構與骨組織有較大差異，新骨生長有限，無法實現與自體骨組織的融合連接，常因骨孔擴大而拉出。He等[10]嘗試通過在韌帶移植物與自體骨連接的骨孔內填充具有骨誘導特性的填充材料，如骨水泥、磷酸鈣等，并借助物理刺激（如超聲、高氧處理）以促進從韌帶移植物到自體骨的生理愈合。但由于骨填充材料缺乏可控的多孔或管道結構，新骨再生空間有限，材料內部由于缺乏營養供給，骨組織生長緩慢，無法形成韌帶移植物與宿主骨通道的牢固連 接。
為此，國內外研究者逐漸將研究方向從傳統的韌帶重建轉向韌帶-骨復合重建。自體韌帶-骨存在供源有限及造成新損傷等問題，因此組織工程韌帶-骨復合支架成為研究熱點。由于蠶絲纖維具有和自然韌帶相似的力學性能和良好的生物相容性等優點，本研究設計的韌帶-骨復合支架的韌帶部分采用蠶絲纖維材料制作而成。為實現韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的連接，設計了帶有倒刺牙型結構的PEEK固定釘。初期韌帶-骨復合支架通過固定釘與宿主骨道進行過盈連接，由于β-TCP具有良好的骨誘導性，后期宿主骨長入陶瓷骨支架形成更為牢固的生理連接。
本研究基于3-D打印技術成功制作了韌帶-骨復合支架，植入豬體內3個月后韌帶組織再生出與自然韌帶相似的纖維組織，且宿主骨長入了骨支架。但由于體內環境復雜，再生的韌帶-骨復合支架力學性能尚未能達到正常前交叉韌帶水平，為達到韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的生理固定還需進一步探索與研究。
膝關節是人體最大的關節系統，其穩定性和正常運動能力主要依靠關節韌帶來維持。對于因運動或意外事故導致的關節韌帶不可自愈性損傷或斷裂，需行關節韌帶重建來恢復關節的生理功能。目前，重建手術所用的韌帶支架多由單一軟質材料制成，并采用界面螺釘進行擠壓機械固定，存在韌帶移植物在骨道內微滑動、自體骨內融合骨洞擴大而拉出以及連接處應力集中易發生疲勞斷裂等問題，韌帶移植物無法與自體骨組織有效融合固定是重建手術失敗的主要原因[1-2]。為達到韌帶移植物與宿主骨通道的牢固連接，組織工程韌帶-骨復合支架成為研究熱點[3-6]。本研究旨在探討基于3-D打印技術的韌帶-骨復合支架制備方法，通過連接蠶絲纖維編織的韌帶支架、陶瓷骨支架及固定釘獲得韌帶-骨復合支架，然后將其植入豬體內3個月后觀察力學性能和組織學改變，以期達到韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的牢固生理連接，為臨床韌帶修復重建提供新思路和新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康4月齡雄性家豬10只，體重51～63 kg，由陜西咸陽養殖場提供。
β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP；上海貝奧路生物材料有限公司）；蠶絲纖維（Trudel公司，瑞士）；聚醚醚酮（polyether ether ketone，PEEK；Angst+Pfister公司，瑞士）。CMTS503微機控制電子萬能試驗機（深圳新三思材料檢測有限公司）；SPS250B快速成型機（陜西恒通智能機器有限公司）；快速升溫電阻爐（湘潭湘儀儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）。三維設計軟件Pro/engineer（PTC公司，美國）。
1.2 骨支架制備
采用3-D打印技術與凝膠注模法制備骨支架[7]。具體步驟：應用三維設計軟件Pro/engineer設計骨支架三維模型（圖 1 a），通過布爾運算生成骨支架負型（圖 1 b）；然后利用3-D打印技術制作骨支架負型樹脂模具。配制β-TCP陶瓷混合漿料并灌注入骨支架負型樹脂模具中，凝固得到陶瓷胚體（圖 1 c），在60℃、100%濕度環境下反應120 h后，60℃環境下干燥24 h，隨后在快速升溫電阻爐中高溫燒結至1 150℃，樹脂模具氣化得到骨支架（圖 1 d）。
圖1
骨支架制備流程 ? 骨支架三維模型設計 ? 骨支架負型 ? 3-D打印的骨支架負型與陶瓷胚體 ? 成型的陶瓷骨支架 ? ?1.3 韌帶-骨復合支架制備
采用自制編織機將蠶絲纖維編織成韌帶支架[8]，置于煮沸的5%Na2CO3溶液中2 h去除絲膠，將韌帶支架一端包裹燒結的骨支架連接固定。機械加工PEEK材料制作具有倒刺牙型結構的固定釘，將固定釘與連接的韌帶與骨支架進行裝配連接，形成韌帶-骨復合支架。見圖 2。將韌帶-骨復合支架浸泡于75%乙醇溶液24 h消毒備用。
1.4 韌帶-骨復合支架體內植入方法
取10只豬肌肉注射3.5%戊巴比妥鈉溶液（0.5 mL/ kg）麻醉后，打開左側后腿膝關節（實驗組），屈膝90°，去除前交叉韌帶。用電鉆沿前交叉韌帶從脛骨端向股骨端鉆孔，脛骨鉆通，股骨部分鉆孔深度為20 mm。然后連接韌帶-骨復合支架與輔助植入裝置，利用氣錘緩慢將韌帶-骨復合支架植入股骨骨道，至支架表面與股骨表面大致平齊，拔出輔助植入裝置。將韌帶-骨復合支架的韌帶端通過牽引器從脛骨骨道拉出；屈膝30°，韌帶與脛骨端采用界面螺釘固定，縫合膝關節。右側膝關節不作處理，作為對照組。術后不作外固定，自由活動。
1.5 檢測指標
1.5.1 生物力學測試
支架植入后3個月，取7只實驗動物進行生物力學拉伸試驗。實驗組取再生的韌帶-骨復合支架；對照組取膝關節并剪斷后交叉韌帶、側副韌帶等，僅保留前交叉韌帶。實驗過程中為防止剪切力破壞，保證韌帶-骨復合支架軸線與微機控制電子萬能試驗機軸線一致，課題組設計了生物力學測試卡具，以實現X、 Y方向的移動并可調節角度，Z方向的移動通過微機控制電子萬能試驗機進行調節。其中，卡具筒用于固定股骨和脛骨；云臺用于調節韌帶-骨復合支架的角度和位置，角度通過調節與云臺相連的螺釘在滑槽內位置實現，位置通過調節下面滑槽位置實現。最終保證韌帶-骨復合支架軸線與微機控制電子萬能試驗機的軸線盡可能重合。采用螺釘將股骨、脛骨分別固定于卡具筒。見圖 3、4。
將生物力學測試卡具與微機控制電子萬能試驗機連接，膝關節標本與生物力學測試卡具連接固定。調節微機控制電子萬能試驗機程序，采用力控制模式，對膝關節從0 N開始拉伸，100～250 N循環250次，之后拉伸至斷裂，速度為0.5 mm/s。測試標本蠕變量及承受的最大拉伸力。蠕變量為100～250 N循環250次的位移差值，最大拉伸力為力-位移曲線最高點對應的力。
1.5.2 大體及組織學觀察
植入后3個月，取剩余3 只實驗動物韌帶-骨復合支架，大體觀察后置于甲醛溶液固定2個月，石蠟包埋并沿骨道切割韌帶-骨復合支架，厚6 μm切片，HE染色后倒置顯微鏡觀察韌帶-骨復合支架與骨道的連接部位及韌帶支 架。
1.6 統計學方法
采用Microsoft Excel軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 生物力學測試
對照組承受的最大拉伸力和蠕變量分別為（1 384 ± 181）N和（0.74 ± 0.21） mm，實驗組為（370 ± 103）N和（1.48 ± 0.49） mm，比較差異均有統計學意義（t=11.617，P=0.000；t= -2.991，P=0.020）。 見圖 5。
2.2 大體及組織學觀察
植入后3個月，大體觀察示再生出效果較好的蠶絲韌帶及韌帶-骨界面（圖 6）。HE染色示，隨韌帶支架降解，在蠶絲纖維周圍有大量纖維化組織形成并有序排列，包裹在韌帶支架周圍，形成了再生的人工韌帶（圖 7 a）；韌帶與骨道的連接部位形成了纖維軟骨過渡層，在降解的β-TCP周圍有大量新生骨，韌帶周圍再生的纖維化組織緊密固定于新生骨上（圖 7 b、c）。
3 討論
在關節韌帶重建術中，為實現韌帶移植物與自體骨組織的連接，臨床上采用在自體關節骨體上鉆孔，然后將韌帶移植物插入骨孔并用醫用螺釘機械固定，后期通過新骨在韌帶支架內的滲透生長，促進韌帶向自體骨組織的愈合固定。由于在韌帶移植物與骨道僅有薄弱連接的纖維組織形成，力學性能較差。為達到韌帶移植物與宿主骨道的生理結合，研究者進行了大量研究。Lee等[9]在韌帶支架內復合骨生長因子或細胞，但由于韌帶支架的材料結構與骨組織有較大差異，新骨生長有限，無法實現與自體骨組織的融合連接，常因骨孔擴大而拉出。He等[10]嘗試通過在韌帶移植物與自體骨連接的骨孔內填充具有骨誘導特性的填充材料，如骨水泥、磷酸鈣等，并借助物理刺激（如超聲、高氧處理）以促進從韌帶移植物到自體骨的生理愈合。但由于骨填充材料缺乏可控的多孔或管道結構，新骨再生空間有限，材料內部由于缺乏營養供給，骨組織生長緩慢，無法形成韌帶移植物與宿主骨通道的牢固連 接。
為此，國內外研究者逐漸將研究方向從傳統的韌帶重建轉向韌帶-骨復合重建。自體韌帶-骨存在供源有限及造成新損傷等問題，因此組織工程韌帶-骨復合支架成為研究熱點。由于蠶絲纖維具有和自然韌帶相似的力學性能和良好的生物相容性等優點，本研究設計的韌帶-骨復合支架的韌帶部分采用蠶絲纖維材料制作而成。為實現韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的連接，設計了帶有倒刺牙型結構的PEEK固定釘。初期韌帶-骨復合支架通過固定釘與宿主骨道進行過盈連接，由于β-TCP具有良好的骨誘導性，后期宿主骨長入陶瓷骨支架形成更為牢固的生理連接。
本研究基于3-D打印技術成功制作了韌帶-骨復合支架，植入豬體內3個月后韌帶組織再生出與自然韌帶相似的纖維組織，且宿主骨長入了骨支架。但由于體內環境復雜，再生的韌帶-骨復合支架力學性能尚未能達到正常前交叉韌帶水平，為達到韌帶-骨復合支架與宿主骨通道的生理固定還需進一步探索與研究。
